Eliminar células específicas sem danificar outras células é extremamente difícil, especialmente em tecidos estabelecidos, mas há uma necessidade urgente de um método de eliminação celular no campo da engenharia de tecidos. Aqui, apresentamos um método para eliminação celular específica de uma cultura de células 3D mista usando fotoimunoterapia no infravermelho próximo (NIR-PIT).
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Artigo de método
Eliminação celular seletiva de Cultura 3D Mixed usando uma técnica de infravermelho próximo Photoimmunotherapy
Neste artigo
Resumo
Resumo
Desenvolvimentos recentes em engenharia de tecidos oferecem soluções inovadoras para muitas doenças. Por exemplo, a engenharia de tecidos usando células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) surgiu como um novo método na medicina regenerativa. Embora essa regeneração tecidual seja promissora, a contaminação com células indesejadas durante as culturas de tecidos é uma grande preocupação. Além disso, há uma preocupação de segurança em relação à tumorigenicidade após o transplante. Portanto, há uma necessidade urgente de eliminar células específicas sem danificar outras células que precisam ser protegidas, especialmente em tecidos estabelecidos. Aqui, apresentamos um método para eliminação celular específica de uma cultura de células 3D mista in vitro com fotoimunoterapia no infravermelho próximo (NIR-PIT) sem danificar as células não-alvo. Esta técnica permite a eliminação de células específicas de culturas de células ou tecidos mistos.
Introdução
A eliminação de células específicas, sem danificar outras células é extremamente difícil, especialmente no tecido estabelecido, e não há uma necessidade urgente de um método de eliminação de células no campo da engenharia de tecidos. Hoje em dia no campo da medicina regenerativa, as culturas de tecido, utilizando células estaminais embrionárias (ES), células estaminais pluripotentes (PSCs), ou induzida por células estaminais pluripotentes (IPS) são materiais promissores 1-3.
Embora esta regeneração de tecidos é promissor, a contaminação com células não desejadas é uma grande preocupação. Além disso, existe uma preocupação de segurança de tumorigenicidade após o transplante 4,5. Embora muitos estudos têm-se centrado sobre estas questões para eliminar as células específicas, especialmente em medicina regenerativa 6-8, nenhum método prático tem sido desenvolvido.
Perto photoimmunotherapy infravermelho (NIR-PIT) é um tratamento baseado em um anticorpo conjugat-fotoabsorventee (APC). Uma APC é constituído por um anticorpo específico de células monoclonais (mAb) e um fotoabsorvente, IR700. IR700 é um derivado de ftalocianina de sílica-hidrofílico e não induz por si só a fototoxicidade 9. IR700 é covalentemente conjugada com o anticorpo através de resíduos de amida na cadeia lateral de moléculas de lisina. A APC liga-se moléculas alvo na membrana celular e, em seguida, induz necrose celular quase imediato após a exposição à luz NIR a 690 nm. Durante a exposição à NIR-luz, as rupturas de membranas celulares que levam à morte celular 9-14. NIR-PIT tem provado ser eficazes com vários anticorpos ou fragmentos de anticorpos, incluindo o anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesotelina, anti-GPC3, e anti-CEA 15-21. Portanto, NIR-poço pode ser usada contra uma ampla variedade de moléculas-alvo. Além disso, NIR-PIT é um tratamento bem controlado que permite tratamento selectivo de regiões específicas, restringindo o NIR-light irradiação 18,22.
Aqui, apresentamos um método de eliminação célula específica usando NIR-PIT a partir de culturas em 3D mistos.
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Protocolo
Nota: O protocolo a seguir descreve as etapas necessárias para eliminar as células específicas usando NIR-PIT. Controles e outros detalhes sobre NIR-PIT e viabilidade celular pode ser encontrada em outro lugar 18.
1. Conjugação de IR700 a anticorpos monoclonais (mAb)
- Prepare o mAb de interesse a 2-5 mg / ml em solução (pH 8,6) 0,1 M de Na 2 HPO 4.
- Misture 6,8 nmol de mAb com 30,8 nmol de IR700 10 mM em Na 2 HPO H 4 solução 0,1 M (pH 8,6) num tubo de microcentrífuga e incubar à TA durante 1 h, coberto com folha de alumínio.
- Lavar a coluna PD-10 (ver Tabela de Materiais / Equipamentos) com 15 ml PBS, duas vezes. Coloque a amostra a partir do passo 1.2.
- Purifica-se a mistura através da coluna PD-10 por eluição PBS de acordo com as instruções do fabricante.
Nota: Aqui, a eluição foi ao longo da cor banda de IR700. Para uma amostra de 300 ul, fracção de eluição PBS é tipicamente entre 2,5 ml a 4,4 ml. - Determine oconcentração de proteína com coloração com Coomassie, medindo a absorção a 595 nm com um espectrofotómetro 9. Determinar a concentração de IR700 com absorção a 689 nm para confirmar o número de moléculas de fluoróforo conjugadas a cada molécula de Acm 9.
Nota: É importante para determinar um número de conjugação óptima de moléculas IR700 em um mAb com um espectrofotómetro. Geralmente, cerca de 3 moléculas de IR700 na molécula um mAb é óptimo para ambas in vitro e in vivo de trabalho. métodos de HPLC e SDS-PAGE pode ser usado para confirmar se o mAb e IR700 são obrigados ou não. - Armazenar a 4 ° C, depois de determinar a concentração de proteína.
2. Preparação de Cultura de Células 3D Misto (Mixed Spheroid)
- Aplicar água estéril (cerca de 1 ml) na seção do reservatório placa de pendurar placas gota.
- Prepare a várias proporções dos tipos de células de interesse - células A431-Luc-GFP e células 3T3-RFP -com cada amostra contendo 5000 células no total, suspensos em 50 ul de meio de cultura.
Nota: Preparar 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, etc proporções de tipos de células de interesse em meios de cultura, dependendo do tipo de célula. - Incubar a mistura durante 5-7 dias a 96 em placa bem pendurado gota numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono. Alterar os meios de cultura a cada 2 dias. Nota: Para fazer o 3D esferóides precisamente, lidar com a placa suavemente, como gotas contendo células cair facilmente antes de formar formas 3D.
- Observar a morfologia e tamanho dos esferóides utilizando um microscópio de campo claro invertido a 10X - 40X de ampliação. Nota: Embora dependa em tipos de células e o tamanho de gota suspensa de, assegurar que o diâmetro do esferóide é de cerca de 400-600 uM, após 7 dias de incubação em 96 a placa de suspensão bem gota.
3. In Vitro NIR-PIT para Cultura Celular 3D Mixed
- Alterar a mídia da hanging placas gota a 10 ug / ml de conjugado anticorpo-fotoabsorvente (APC) meios que contêm, e incuba-se durante 6 h num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono.
- Após 6 horas de incubação, lavar o esferóide duas vezes com meio de cultura fresco (vermelho de fenol livre). Gentilmente transferir o esferóide a um prato de fundo de vidro de 50 mm, com 100 ul fresco fenol meios de cultura livre vermelho usando um estéril 200 mL ponta da pipeta com a ponta cortada. Coloque um esferóide em cada prato.
- Observar o esferóide com um microscópio de campo claro invertido para detectar a alteração da morfologia. Para observar os repórteres ópticos (por exemplo, GFP e RFP) usam microscópio de fluorescência com as seguintes configurações de filtro: GFP - filtro de excitação 469 nm e filtro de emissão de 525 nm; RFP - 559 nm, filtro de excitação, e um filtro de emissão de 630 nm.
- Coloque o diodo emissor de luz (LED) acima do prato com fundo de vidro para irradiação.
Nota: Os esferóides podem ser expostos a NIRluz quer no microscópio ou na capa laminar.- Medir a densidade de energia da luz NIR com um medidor de potência óptica 9. De acordo com esta medida, irradiar NIR-luz através de diodos emissores de luz (LEDs) que emitem luz em comprimentos de onda de 670 a 710 nm a 2 J / cm 2.
Nota: diodo emissor de luz pode penetrar profundidade máxima de aproximadamente 5 polegadas. Efeitos citotóxicos de NIR-PIT depende apenas dada energia, independentemente da densidade de potência e duração da exposição 23.
- Medir a densidade de energia da luz NIR com um medidor de potência óptica 9. De acordo com esta medida, irradiar NIR-luz através de diodos emissores de luz (LEDs) que emitem luz em comprimentos de onda de 670 a 710 nm a 2 J / cm 2.
- Após a irradiação, a transferência do esferóide para uma nova placa de gota em suspensão com 50 ul de meio de cultura fresco e incubar durante um dia numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono.
- Suavemente transferir o esferóide de um prato de vidro de fundo com 100 ul de meio de cultura fresco (sem vermelho de fenol), utilizando uma ponta de pipeta esterilizada de 200 ul com a ponta cortada. Observe o esferóide com um microscópio de fluorescência 1 dia após NIR-PIT usando ficonfigurações PELD descrito no passo 3.3.
- Detecção de células mortas através da adição de iodeto de propídio para os meios de comunicação a uma concentração final de 2 ug / mL, ou pela perda de fluorescência citoplasmática GFP-usando um microscópio de fluorescência (Figura 2B) 14,18,22.
- Repita os passos de 3,1-3,6 se as células-alvo não são completamente eliminados.
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Resultados
Para monitorizar o efeito opticamente de NIR-PIT, a linha celular A431, que sobre-expressa EGFR, foi geneticamente modificado para expressar GFP e também de luciferase (Luc-A431-GFP). Como um não-alvo de NIR-PIT, a linha de células Balb / 3T3 foi opticamente modificada para expressar RFP (3T3-RFP). A APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), foi sintetizado. Esferóides mistas, compostas de várias proporções de células (A431-Luc-GFP e 3T3-RFP) foram fabricados de acordo com este protocolo
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Discussão
Nós demonstramos um método de eliminação de células específicas a partir de uma cultura de células mista 3D sem danos para as células não alvo usando NIR-poço. Até agora, não existe nenhum método prático de eliminação da célula uma vez que o tecido é estabelecida ou após o transplante. Assim, NIR-PIT é um método promissor para alcançar este objetivo. Esta técnica também pode ser utilizada in vivo, 18,22, desde APCs mostram farmacocinéticos semelhantes aos do próprio Acm. O tipo de célula alv...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Investigação Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| IRDye 700DX Éster Corante Infravermelho | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, EUA) | 929-70011 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, EUA) | S9763 | |
| Sephadex G25 coluna (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, EUA) | 17-0851-01 | |
| Coomassie (bradford) Mais ensaio de proteína | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, EUA) | PI-23200 | |
| Placas de queda suspensas de 96 poços Perfecta3D | 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, EUA) | HDP1096-8 | |
| Medidor de potência óptica | Thorlabs (Newton, NJ, EUA) | PM100 | |
| LED: L690-66-60 | Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, EUA) | L690-66-60 | |
| Vectibix (panitumumabe) | Amgen (Thousand Oaks, CA, EUA) | ||
| 35 mm prato de fundo de vidro, tamanho do prato 35 mm, tamanho do poço 10 mm | Cellvis (Mountain View, CA, EUA) | D35-10-0-N |
Referências
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Reimpressões e permissões
