Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Resumo

Este protocolo descreve a digestão enzimática da pele de camundongo em meio rico em nutrientes, seguida de separação gradiente para isolar leucócitos. As células assim derivadas podem ser usadas para diversas aplicações a jusante. Esta é uma alternativa eficaz, econômica e aprimorada às máquinas de dissociação de tecidos e aos protocolos de digestão de tecidos mais severos baseados em tripsina e dispase.

Resumo

A dissociação da pele murina em uma única suspensão celular é essencial para a análise celular a jusante, como a caracterização de células imunes infiltrantes em modelos de roedores de inflamação da pele. Aqui, descrevemos um protocolo para a digestão da pele de camundongo em uma solução rica em nutrientes com colagenase D, seguida pela separação de células hematopoiéticas usando um gradiente de densidade descontínuo. As células assim obtidas podem ser usadas para estudos in vitro, transferência in vivo e outras análises celulares e moleculares a jusante, incluindo citometria de fluxo. Este protocolo é uma alternativa eficaz e econômica para dissociadores mecânicos caros, colunas de separação especializadas e métodos de digestão mais severos baseados em tripsina e dispase, que podem comprometer a viabilidade celular ou a densidade de proteínas de superfície relevantes para a caracterização fenotípica ou função celular. Conforme mostrado aqui em nossos dados representativos, este protocolo produziu células altamente viáveis, continha subconjuntos específicos de células imunes e não teve efeito na integridade das proteínas marcadoras de superfície comuns usadas na análise de citometria de fluxo.

Introdução

Doenças da pele que variam de dermatite de contato, eczema, psoríase, celulite, infecções fúngicas e abcessos para cânceres de pele não-melanoma foram encontrados para estar entre as 50 doenças mais prevalentes em todo o mundo, ea quarta causa líder global de doenças não fatais em 2010 ^1. Por conseguinte, a investigação dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes diversas patologias da pele é uma área de investigação activa e necessário. Modelos de roedores têm sido notavelmente útil na compreensão de condições inflamatórias da pele tais como dermatite atópica ^{2, 3} psoríase, ou infecção por Staphylococcus aureus ^4. Protocolos de baixo custo, eficiente, simples e de digestão enzimática dos tecidos da pele do rato podem proporcionar preparações de células que podem ser utilizadas para uma variedade de aplicações a jusante para melhor compreender a fisiopatologia de doenças de pele. Aqui, um método simples e econômica é descrito por digestão enzimática da pele do ratode tecido e isolamento de leucócitos que se infiltram na pele que pode ser utilizado para cultura de células, in vivo, a transferência adoptiva, análise de citometria de fluxo e classificação ou estudos de expressão de genes. O objetivo geral deste procedimento é para preparar uma suspensão única célula de leucócitos infiltrantes da pele com a viabilidade celular elevada, minimizando os custos tipicamente associados a custom kits de reagentes e dissociadores mecânicos.

Métodos existentes de dissociação do tecido da pele ^5-7 pode resultar em baixa viabilidade celular e da superfície integridade marcador, ou requerem kits de enzimas personalizadas e caras máquinas de dissociação tecido ^8-11. Enquanto a digestão do tecido da pele da orelha rato é razoavelmente prevalente ^12-13, digerindo o tecido da pele altamente queratinizadas (por exemplo, a partir do flanco) pode resultar em preparações de células contaminadas com grandes quantidades de detritos não celular. Em um estudo recente, Zaid e colegas digerido rato pele flanco, durante 90 minutos em 2,5 mg / ml dispase, folloconduzida por 45 min em 3 mg / ml de colagenase ^7. Em outro estudo, estes investigadores usaram várias incubações com uma digestão combinada de 2,5 horas, incluindo a utilização de tripsina / EDTA, colagenase III, e dispase ^5. A utilização de tripsina não é recomendado para a digestão enzimática da pele, como o tratamento com tripsina a partir de diferentes fabricantes, tem sido demonstrado que afecta de forma mensurável a integridade de proteínas da superfície celular em células de mamífero ^14-15. Além disso, dispase pode ter efeitos significativos sobre a capacidade proliferativa das células CD4 e CD8u T e afetar a abundância de superfície de pelo menos 20 moléculas, incluindo T comum marcadores de ativação celular, como CD62L ^16. Outros protocolos usar RPMI 1640 no meio de digestão ^6. No entanto, a presença de Mg ²⁺ e Ca ²⁺ em RPMI pode causar agregação extensiva de células ^17.

Um protocolo ideal para a dissociação do tecido deve apontar para a viabilidade celular elevada, baixoníveis de agregação das células, e o mínimo de danos para a célula proteínas de superfície. Alta qualidade preparações de células do linfonodo estromal ter sido realizado com protocolos que utilizam incubações enzimáticas mais curtos, Ca ^{2+ e Mg 2+} meios de comunicação livres e evitar tripsina e dispase ^18. No entanto, não foram estabelecidas protocolos deste tipo para a dissociação da pele inteira do rato.

Aqui, é descrito um protocolo para dissociar, isolar e enriquecer leucócitos infiltrantes de pele desafiados com alergénio pele de ratinho flanco. Resumidamente, pele excisada é pré-incubada em Solução de Sal Equilibrada de Hank (HBSS) com 10% de soro fetal bovino durante 1 h para amaciar o tecido para a digestão e remover qualquer excesso de pele ou tecido gordo morto. Isto é seguido por um passo de 30 min de digestão enzimática com 0,7 mg / mL de colagenase D. colagenase D tem efeitos mínimos sobre a densidade de marcadores da superfície celular, e nenhum efeito sobre a proliferação de células T in vitro, ^16,18, tornando-altamente adequados para aplicações que envolvem a caracterização de proteínas de superfície. A seguir à digestão enzimática, centrifugação descontínua de gradiente de densidade foi utilizada para remover as células epiteliais e os detritos a partir da suspensão de célula única e para enriquecer células hematopoiéticas. Importante, este procedimento evita os reagentes caros de separação baseados em colunas de células magnético e máquinas de dissociação de tecido ^8-11, e pode ser realizada com equipamento e materiais encontrada num laboratório de investigação biomédica de base. Aqui este protocolo foi utilizado para isolar leucócitos de pele flanco desafiados três vezes com o hapteno de oxazolona (OX) em ratos previamente sensibilizados ND4 suíços (adaptado a partir de 19). As células foram analisadas utilizando citometria de fluxo multi-paramétrico. Esta técnica proporcionou uma suspensão de células com detritos mínima e> 95% de viabilidade de linfócitos isolados que foram analisadas por fluxo multiparamétrica de citometria de medir a infiltração de linfócitos T e de neutrófilos para o SK afectadadentro.

Protocolo

Nota: os ratos 8-12 semanas de idade do sexo feminino ND4 Swiss Webster, convencionalmente alojados com livre acesso a comida e água, foram utilizados para estes estudos O protocolo experimental utilizado (B13S1) foi aprovado pelo IACUC do Macalester College..

1. Sensibilização e Desafio com Oxazolona

1. Dia 0
   1. Prepare a câmara de anestesia por adição de 3 ml de isoflurano para toalhas absorventes colocados por baixo da malha na parte inferior de um frasco de 4 L com tampa de vidro. Para os ratinhos fêmea ND4 usado aqui, o tempo na câmara é de 30-60 segundos até que o sujeito está adequadamente anestesiados; otimizar a administração do anestésico para a cepa do mouse está sendo usado.
   2. Raspar as costas de cada rato anestesiado e flanquear usando um aparador de pêlos do animal.
2. Dia 1
   1. Adicione uma solução a 2% de 4-etoximetileno-2-fenil-2-oxazolin-5-ona (Ox) em etanol absoluto, e incuba-se a 50 ° C durante 15 min numa placa numa incubadora rotativa.
   2. Resumidamente anestesiarcamundongos, usando anestesia isoflurano, conforme descrito no ponto 1.1.1 e aplique 100 l de 2% Ox ao raspou de volta em várias aplicações em série de cerca de 20 mL cada. Espera 5-10 seg entre aplicações em série para que a solução seque.
   3. Tome cuidado para não derramar a solução 2% boi em outras regiões do que a parte de trás, e esperar que a solução para secar entre as aplicações.
3. Dias 5-7
   1. Adicione uma solução de 1% (OX) em etanol absoluto, e incuba-se a 50 ° C durante 15 min numa placa numa incubadora rotativa.
   2. Gentil mas firmemente imobilizar o mouse na nuca do pescoço e base do rabo com abdômen virado para cima e pescoço ligeiramente inclinada para baixo (semelhante a uma espera por uma injecção intraperitoneal) e aplicam-se 100 ul de 1% do boi para o flanco raspada em várias aplicações em série e tendo o tempo necessário para secar a pele depois como descrito acima.
   3. Para ratinhos de controlo, aplicar 100 ml de etanol absoluto veículo para o flan raspadak.

2. Flanco Pele Colheita

1. Eutanásia ratinhos utilizando dióxido de carbono inalação, e excisar cuidadosamente a área desejada da pele do flanco (~ 25 mm x 25 mm de pele) com 10 cm tesouras cirúrgicas.
2. Usando uma lâmina cirúrgica limpo, afiado, raspar o excesso de gordura e tecido conjuntivo da pele do flanco.
3. Colocar 3 pedaços de pele do flanco de 3 ratinhos em um tubo de 50 ml contendo 10 ml de HBSS RT [com vermelho de fenol, sem cálcio ou magnésio, 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazinoetanossulfónico (HEPES), e 10% de soro fetal de bovino (FBS)].

3. Pré-lavagem de tecidos digestão

1. Colocar o tubo contendo os fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C.
2. Vortex vigorosamente durante 10 seg, no final do período de incubação.
3. Coe o conteúdo do tubo por meio de um 70 uMfiltro para descartar o tampão de lavagem e recolher o tecido. Um único filtro pode ser reutilizada durante todo o procedimento dentro de um grupo de tratamento biológico.
4. Utilizando um par de pinças, transferir a pele do flanco do filtro para um novo tubo de 50 ml contendo 10 ml de fresco, meios RT (HBSS contendo EDTA, HEPES, e FBS como descrito acima).
5. Com um par de 12,5 cm de tesouras de dissecção cirúrgica imersos no interior do tubo, mediu cada pedaço de pele do flanco de modo a que o pedaço de tecido média é de aproximadamente 2,2 mm x 2,2 mm na área.
6. Colocar o tubo contendo os fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C.
7. Vortex vigorosamente durante 10 seg, no final da incubação

4. A digestão de colagenase da pele

1. Coe o conteúdo do tubo através de um filtro de 70 | iM, recolher e transferir os pedaços de pele do flanco para um novo tubo de 50 ml contendo 10 ml de freSH, meios RT HBSS suplementado com 0,7 mg / ml de colagenase D.
2. Colocar o tubo contendo o meio de digestão e fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C.
3. Conteúdo vórtice de tubo vigorosamente durante 10 seg, no final da incubação.
4. Filtrar o conteúdo de tubo através de um filtro de 70 um para um novo tubo de 50 ml; manter o fluxo através contendo o tecido digerido e descartar o filtro e flanquear os restos da pele.
5. Lavar o fluxo de passagem em 50 ml de meio HBSS, centrifuga-se durante 5 min a 350 g, e decanta-se o sobrenadante.

5. centrifugação em gradiente de densidade

1. Usando uma pipeta serológica, adicionar 3 ml de RT 67% de gradiente de densidade de meios de centrifugação em 1X tampão fosfato salino (PBS) para um novo tubo de 15 ml para cada amostra.
2. Ressuspender o sedimento celular em 5 ml de RT 44% de densidade de meios de centrifugação em gradiente em HBSS com vermelho de fenol.
3. CavalheiroLY camada de 5 ml da centrifugação em gradiente de densidade media de 44%, contendo as células na parte superior da centrifugação em gradiente de densidade de amostra media de 67%, utilizando uma pipeta serológica. Certifique-se de definir a pipeta para a velocidade mais lenta, e coloque a pipeta ao longo da parede do tubo cônico. Tenha cuidado para não agitar, perturbar, ou inverter o gradiente.
4. Definir aceleração para a configuração mais baixa, desengatar o travão de, e centrifugar o gradiente a 931 xg durante 20 min à temperatura ambiente para garantir que a centrífuga é equilibrada.
5. Após a centrifugação, retirar cuidadosamente o gradiente da centrífuga, e transportar gentilmente para a bancada do laboratório segurando o tubo na posição vertical. Usando uma pipeta de 5 ml de transferência de plástico, remover a camada de células na interface dos 44% e 67% de gradiente de densidade de meios de centrifugação e transferência para um novo tubo de 15 ml. Se a interface não é visível, basta remover cerca de 2 ml de líquido a 67% a -44% do limite.
6. Encha o tubo cônico contendo células do interface com FBS a 2% em 1X PBS gelado, as células de centrifugação durante 5 minutos a 350 xg, e decanta-se o sobrenadante.
   Nota: Esta é a primeira vez que as células podem ser arrefecido / mantido frio desde passos de digestão são a 37 ° C e os passos de centrifugação de gradiente de densidade media são à TA. As células podem ser ressuspendidas numa solução 1: 1 de tripano azul e contagens de diluição e informação viabilidade pode ser obtido neste ponto.

6. Bloqueio e coloração para análise de citometria de fluxo

1. Bloco FcyRII / receptores em células III para evitar coloração não específica de anticorpos. Para as experiências aqui descritas, tornar misturas principais de anticorpo em PBS com 2% de FBS contendo 1: 100 de diluição do anticorpo não conjugado contra CD16 / 32 (2.4G2) para se ligar e bloquear os receptores FcyRII / III.
2. Incubar as células bloqueadas com misturas principais adequados de anticorpos contra CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8u (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), e Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), bem como violeta brilhante 510 ao vivo / morto mancha para identificar as células mortas. Use todos os anticorpos, quer a diluição recomendada pelos fabricantes ou previamente otimizado por pesquisadores. Para as experiências aqui descritas, utilizar todos os anticorpos de 1: 100 de diluição.
3. Lave as células e ressuspender em 50 ul de tampão de coloração 1X PBS com 2% de FBS. Manter em gelo até que os dados de fluorescência pode ser adquirido num citómetro de fluxo.
   Nota: É importante ter parâmetros de compensação pré-optimizada com o tecido linfóide e um antigénio da superfície celular comum (como CD4 ou CD8) antes da aquisição de dados de fluorescência.
4. Para aumentar o número de células por citometria de fluxo a jusante análise, a aquisição de dados a partir de amostras inteiras de células coradas.

7. Analisar Citometria de Fluxo de dados usando métodos padrão para realizar a passos descritos abaixo

1. Primeiro, portão na região de linfócitos da dispersão para a frente(área) por dispersão lateral (área) enredo.
2. Em seguida, selecione as células individuais usando a dispersão para a frente (largura) por dispersão lateral (largura), para evitar analisando parelhas. Isto também pode ser conseguido com uma altura de dispersão para a frente pela altura dispersão lateral trama.
3. Então, portão na linhagem (CD11b, CD11c, e CD45R / B220) -negative e CD3-positivo eventos, para excluir macrófagos, células células dendríticas, e B, respectivamente, e confine análises para compartimento de células T, se o objetivo é, como é aqui, para avaliar as células T infiltrantes.
4. Em seguida, portão em células vivas que excluem a vivo / morto mancha.
5. Finalmente, portão à população de células de interesse (ver secção resultados representante).

Resultados

A colagenase D tratada esplenócitos mostram níveis semelhantes de CD4 e CD8 α em células T, quando comparado com controlos tratados com media
Em primeiro lugar, quaisquer efeitos potenciais de colagenase D sobre a frequência e abundância de superfície de linhagem e de ativação marcadores em subpopulações de células T foram avaliados utilizando tecido linfóide secundário como um controle. Uma suspensão de esplenócitos de ratos foi ob...

Discussão

Caracterização alterações em leucócitos-pele residente em modelos de roedores de doenças da pele tais como dermatite atópica ou psoríase é importante para a compreensão de ligações mecânicas entre o influxo de células inflamatórias e a patologia da doença. Aqui nós descrevemos uma técnica econômica para isolar leucócitos de tecido da pele com equipamento básico encontrado na maioria dos laboratórios de pesquisa biomédica. Esta técnica relativamente rápida evita a utilização de máquinas de dissociação de tecidos caros e ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
HBSS com vermelho de fenol, sem cálcio, sem magnésio, líquido	Sigma Aldrich	55021C	Manter estéril até o dia do uso.
HEPES, ≥ 99,5% (titulação)	Sigma Aldrich	H3375
EDTA solução de sal dissódico	Sigma Aldrich	E7889	Mantenha estéril até o dia do uso.
Soro Fetal Bovino, USDA, Inativado por Calor, Premium Select	MidSci	S01520HI	Mantenha estéril até o dia do uso.
Percoll, pH 8,5-9,5 (25° C)	Sigma Aldrich	P1644	Mantenha estéril. Percoll precisa ser feito isotônico com PBS 10X estéril antes do uso.
Kit Combo de Aparador	Kent Scientific	CL9990-1201	Use o aparador maior para depilar o flanco e as costas.
4-Etoximetileno-2-fenil-2-oxazolin-5-ona	Sigma Aldrich	E0753-10G	Dissolve em 100% EtOH a 50° C por 15 minutos em uma placa giratória.
Anti-camundongo purificado CD16/CD32 (2.4G2)	Tonbo Biosciences	70-0161	Anticorpo usado para bloquear a ligação de anticorpos não específicos durante a coloração de anticorpos para citometria de fluxo
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11)	Becton Dickinson		564378 Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)	eBioscience	47-0042-80	Anticorpo usado para corar células para fluxo citometria
anti-CD8α-BV785 (53-6.7)	BioLegend	100749	Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)	eBioscience	48-0112-80	Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo
anti-CD11c-eFluor450 (N418)	eBioscience	48-0114-80	Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo
anti-CD44-BV711 (IM7)	Becton Dickinson	563971	Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo
anti-CD45-FITC (30-F11)	Tonbo Biosciences	35-0451-U025	Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)	eBioscience	48-0452-80	Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)	BioLegend	104431	Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)	BioLegend	108407	Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo
Corante fantasma-BV510	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Corante de viabilidade para citometria de fluxo
LSR Fortessa	Becton Dickinson	N/A	Analisador de células (18 parâmetros)
Colagenase D de Clostridium histolyticum	Roche Applied Science	11088858001	enzima liofilizada de alíquota a 5 mg/ml em HBSS com vermelho de fenol, sem cálcio e sem magnésio em alíquotas de 1 mL. Armazene imediatamente a -20° C por até seis meses.
ND4 camundongos fêmeas suíças	Harlan	0-32	8-12 semanas de idade; convencionalmente alojados com livre acesso a comida e água e usados de acordo com as diretrizes IACUC do Macalester College.