Este protocolo descreve a digestão enzimática da pele de camundongo em meio rico em nutrientes, seguida de separação gradiente para isolar leucócitos. As células assim derivadas podem ser usadas para diversas aplicações a jusante. Esta é uma alternativa eficaz, econômica e aprimorada às máquinas de dissociação de tecidos e aos protocolos de digestão de tecidos mais severos baseados em tripsina e dispase.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente
Neste artigo
Resumo
Resumo
A dissociação da pele murina em uma única suspensão celular é essencial para a análise celular a jusante, como a caracterização de células imunes infiltrantes em modelos de roedores de inflamação da pele. Aqui, descrevemos um protocolo para a digestão da pele de camundongo em uma solução rica em nutrientes com colagenase D, seguida pela separação de células hematopoiéticas usando um gradiente de densidade descontínuo. As células assim obtidas podem ser usadas para estudos in vitro, transferência in vivo e outras análises celulares e moleculares a jusante, incluindo citometria de fluxo. Este protocolo é uma alternativa eficaz e econômica para dissociadores mecânicos caros, colunas de separação especializadas e métodos de digestão mais severos baseados em tripsina e dispase, que podem comprometer a viabilidade celular ou a densidade de proteínas de superfície relevantes para a caracterização fenotípica ou função celular. Conforme mostrado aqui em nossos dados representativos, este protocolo produziu células altamente viáveis, continha subconjuntos específicos de células imunes e não teve efeito na integridade das proteínas marcadoras de superfície comuns usadas na análise de citometria de fluxo.
Introdução
Doenças da pele que variam de dermatite de contato, eczema, psoríase, celulite, infecções fúngicas e abcessos para cânceres de pele não-melanoma foram encontrados para estar entre as 50 doenças mais prevalentes em todo o mundo, ea quarta causa líder global de doenças não fatais em 2010 1. Por conseguinte, a investigação dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes diversas patologias da pele é uma área de investigação activa e necessário. Modelos de roedores têm sido notavelmente útil na compreensão de condições inflamatórias da pele tais como dermatite atópica 2, 3 psoríase, ou infecção por Staphylococcus aureus
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Nota: os ratos 8-12 semanas de idade do sexo feminino ND4 Swiss Webster, convencionalmente alojados com livre acesso a comida e água, foram utilizados para estes estudos O protocolo experimental utilizado (B13S1) foi aprovado pelo IACUC do Macalester College..
1. Sensibilização e Desafio com Oxazolona
- Dia 0
- Prepare a câmara de anestesia por adição de 3 ml de isoflurano para toalhas absorventes colocados por baixo da malha na parte inferior de um frasco de 4 L com tampa de vidro. Para os ratinhos fêmea ND4 usado aqui, o tempo na câmara é de 30-60 segundos até que o sujeito está adequadamente anestesiados; otimizar a administração d....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A colagenase D tratada esplenócitos mostram níveis semelhantes de CD4 e CD8 α em células T, quando comparado com controlos tratados com media
Em primeiro lugar, quaisquer efeitos potenciais de colagenase D sobre a frequência e abundância de superfície de linhagem e de ativação marcadores em subpopulações de células T foram avaliados utilizando tecido linfóide secundário como um controle. Uma suspensão de esplenócitos de ratos foi .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Caracterização alterações em leucócitos-pele residente em modelos de roedores de doenças da pele tais como dermatite atópica ou psoríase é importante para a compreensão de ligações mecânicas entre o influxo de células inflamatórias e a patologia da doença. Aqui nós descrevemos uma técnica econômica para isolar leucócitos de tecido da pele com equipamento básico encontrado na maioria dos laboratórios de pesquisa biomédica. Esta técnica relativamente rápida evita a utilização de máquinas de dissociação de tecidos caros e .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros ou outros para divulgar.
Agradecimentos
Os Institutos Nacionais de Saúde (NIH R15 NS067536-01A1 para DC), a Associação Nacional Vulvodynia (prêmio para DC), e Macalester College apoiaram este trabalho. CB recebeu uma bolsa do Macalester College Beckman Scholars Programa, financiado pela Fundação Arnold e Mabel Beckman. BTF e TM são suportados por JDRF 2-2011-662. Agradecemos ao Dr. Jason Schenkel e Juliana Dr. Lewis para o conselho técnico, e todos os membros atuais e antigos do laboratório Chatterjea pela sua ajuda e apoio.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| HBSS com vermelho de fenol, sem cálcio, sem magnésio, líquido | Sigma Aldrich | 55021C | Manter estéril até o dia do uso. |
| HEPES, ≥ 99,5% (titulação) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA solução de sal dissódico | Sigma Aldrich | E7889 | Mantenha estéril até o dia do uso. |
| Soro Fetal Bovino, USDA, Inativado por Calor, Premium Select | MidSci | S01520HI | Mantenha estéril até o dia do uso. |
| Percoll, pH 8,5-9,5 (25° C) | Sigma Aldrich | P1644 | Mantenha estéril. Percoll precisa ser feito isotônico com PBS 10X estéril antes do uso. |
| Kit Combo de Aparador | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use o aparador maior para depilar o flanco e as costas. |
| 4-Etoximetileno-2-fenil-2-oxazolin-5-ona | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve em 100% EtOH a 50° C por 15 minutos em uma placa giratória. |
| Anti-camundongo purificado CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Anticorpo usado para bloquear a ligação de anticorpos não específicos durante a coloração de anticorpos para citometria de fluxo |
| anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo | |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Anticorpo usado para corar células para fluxo citometria |
| anti-CD8α-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo |
| Corante fantasma-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Corante de viabilidade para citometria de fluxo |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Analisador de células (18 parâmetros) |
| Colagenase D de Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | enzima liofilizada de alíquota a 5 mg/ml em HBSS com vermelho de fenol, sem cálcio e sem magnésio em alíquotas de 1 mL. Armazene imediatamente a -20° C por até seis meses. |
| ND4 camundongos fêmeas suíças | Harlan | 0-32 | 8-12 semanas de idade; convencionalmente alojados com livre acesso a comida e água e usados de acordo com as diretrizes IACUC do Macalester College. |
Referências
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
Explorar mais artigos
