Exame de proteínas ligadas ao DNA em células de mamíferos Nascente usar a técnica de-BrdU-chip-Slot Ocidental

Resumo

Neste protocolo, descrevemos uma nova técnica BrdU-ChIP-Slot-Western para examinar proteínas e modificações de histonas associadas a DNA recém-sintetizado ou nascente.

Resumo

Histona-desacetilases 1 e 2 (HDAC1,2) localizam os sítios de replicação do ADN. No estudo anterior, utilizando-se um inibidor selectivo e um sistema genético knockdown, que mostrou novos funções para HDAC1,2 na replicação garfo progressão e manutenção nascente cromatina em células de mamífero. Além disso, usamos uma técnica BrdU-chip-Slot-ocidental que combina imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de bromo-desoxiuridina (BrdU) DNA marcado com com slot blot e análise Ocidental para medir quantitativamente proteínas ou modificação da histona associadas com DNA nascente.

Activamente células em divisão foram tratados com HDAC1,2 inibidor selectivo ou transfectadas com ARNsi contra HDAC1 e HDAC2 e, em seguida, o ADN recém-sintetizado foi marcado com o análogo de timidina bromodesoxiuridina (BrdU). A marcação com BrdU foi realizada em um ponto de tempo quando não havia paragem do ciclo celular ou apoptose significativa devido à perda de funções HDAC1,2. Seguindo lAbeling de células com BrdU, a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de marcas de acetilação de histonas ou da cromatina-remodeler foi realizada com anticorpos específicos. Entrada de ADN marcadas com BrdU e o imunoprecipitado (ou chiped) DNA foi então manchado para uma membrana utilizando a técnica de fenda blot e imobilizada utilizando UV. A quantidade de ADN nascente em cada slot foi depois avaliado quantitativamente usando análise de Western com um anticorpo anti-BrdU. O efeito da perda de funções HDAC1,2 sobre os níveis de histonas recentemente sintetizadas marcas de acetilação associado com ADN e cromatina remodeler foi então determinada através da normalização do sinal de BrdU-chip obtidos a partir das amostras tratadas para as amostras de controlo.

Introdução

Reparação de ADN defeituosos e / ou a replicação de DNA são uma das principais causas de instabilidade do genoma, o que pode provocar a morte celular. Uma única quebra de cadeia dupla unrepaired é suficiente para causar morte celular ^1. Organização da cromatina é transitoriamente alterada durante a replicação e reparar ^2,3, e falha em manter a informação epigenética durante esses processos irão resultar em uma ameaça à integridade do genoma. Perda de HDAC3 ou função HDAC1,2 impede a progressão da fase S, replicação e reparação do ADN, levando ao estresse genotóxico (dano ao DNA) e morte celular ^4-9. É, por conseguinte, uma estratégia prático utilizar os inibidores de HDAC selectivos para interromper a replicação, reparação e cromatina em células cancerosas e causar danos no ADN, que por sua vez pode parar o crescimento e induzir a morte celular selectiva, em que crescem rapidamente células cancerosas.

Durante a replicação do DNA, cromatina é rapidamente desmontada e remontada em seguida, seguir a duplicação do DNA. Recém-synthesized histona H4 acetilada é a K5 e K12 (H4K5K12ac resíduos) e a seguir para a deposição de cromatina, são rapidamente desacetilado por histona desacetilases (HDACs) ^10,11. A falha das células para manter a integridade da cromatina nascente pela histona desacetilação pode conduzir ao colapso da forquilha, que por sua vez pode resultar em danos no ADN e morte celular. Nós recentemente mostrou que a inibição seletiva de HDAC1,2 aumenta acetilação das histonas (H4K5ac, H4K12ac e H4K16ac) e inibe a atividade SMARCA5 cromatina remodeler na cromatina nascente, que se correlaciona com a redução da progressão da forquilha de replicação, maior colapso garfo e aumento da replicação do estresse induzido por danos no DNA ⁶ . Assim, o tratamento com inibidor de HDAC podem alterar a estrutura da cromatina nascente para provocar danos no ADN e morte muito rapidamente em células de cancro, uma vez que estas células ciclo rapidamente e muitas vezes passar através da fase-S. Por isso, é importante entender como HDACs funcionar para regular acetilação das histonas e bindi proteínang de manter replicação de ADN em células de mamífero.

Para medir quantitativamente a quantidade de acetilação das histonas e SMARCA5 remodeler cromatina associada à DNA durante a replicação do DNA nascente, eu inventei um ensaio ChIP modificada chamada a técnica de BrdU-chip-Slot-ocidental. Após imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de uma modificação da proteína ou histona desejado, a quantidade de ADN nascente (marcado utilizando análogo da timidina, BrdU) na amostra de chip pode ser detectada por meio de análise ocidental da marcadas com BrdU chip de ADN transferido para uma membrana utilizando um entalhe Aparelho Blot. Usando esta técnica, nós mostramos que H4K16ac (a marca envolvido em embalagem cromatina) eo membro da família ISWI SMARCA5 (dependente de actina regulador associada à matriz relacionada com o SNF SWI / da cromatina) remodeler cromatina estão associados com DNA nascente em células em fase S ^6. Também descobrimos que a marca H4K16ac nascente é desacetilada por HDAC1,2 durante a replicação do DNA ^6. Inibe H4K16acatividade remodeler cromatina do membro da família ISWI SMARCA5 ^12. Assim, usando a técnica de-BrdU-CHIP-Slot Ocidental, podemos conectar as funções para HDAC1,2 na regulação da remodelação da cromatina durante a replicação do DNA. Assim, a técnica BrdU-chip-Slot-Western Blot é uma abordagem poderosa para medir quantitativamente a associação e dissociação dinâmica de proteínas ou suas modificações pós-traducionais que são obrigados a DNA nascente.

Protocolo

1. A cromatina imunoprecipitação (CHIP) seguinte BrdU Labeling

1. Culturas de células NIH3T3 na presença de DMSO ou inibidores selectivos ^HDAC1,2-6, como descrito anteriormente.
2. A seguir ao tratamento com inibidores selectivos de DMSO ou HDAC1,2, adicionar BrdU para as células de uma cultura de tecido estéril capa. Incubar 2 x 10 ⁶ NIH3T3 células plaqueadas em 10 ml de meio NIH3T3 com 20 uM de concentração final de bromodesoxiuridina (BrdU) durante 60 min num estéril 37 ° C incubadora de cultura de tecidos.
3. Proteínas intracelulares Crosslink ao DNA por adição de formaldeído directamente ao meio de cultura a uma concentração final de 1%. Incubar 2 X 10 ⁶ células NIH3T3 com formaldeído à temperatura ambiente durante 10 minutos num agitador.
4. Extingue-se a ligação cruzada pela adição de glicina para uma concentração final de 125 mM. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min num agitador.
5. Remover os meios de comunicação e recolher células em PBS num tubo de centrífuga de 15 ml. Spin cells a 956 xg durante 5 min a 4 ° C. Lava-se a pelete de células duas vezes com PBS gelado. Remover o PBS do tubo. Armazenar o sedimento celular reticulada sem PBS (o sobrenadante) a -80 ° C até à sua utilização.
6. Prepara-se o lisado a partir do sedimento celular reticulada por adição de tampão de FA140 500 ul (50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 e desoxicolato de sódio a 0,1%) suplementado com cocktail inibidor de protease.
7. Distorcer a cromatina por sonicando as amostras de cinco vezes a 35% de energia e com um pulso de 15 segundos, 0,9 segundos em 0,1 segundos e fora configuração. Manter os tubos em gelo após cada rodada de sonicação para evitar o aquecimento das amostras.
   1. Verificar o corte num gel de ADN como a eficiência de cisalhamento vai variar entre diferentes sonicadores. Para verificar ultra-sons, reverter ligações cruzadas pela adição de NaCl a uma concentração de 0,16 M e executar etapas 1.17.1. - 1.22. Run eluída 10 ul DNA em gel de agarose 1,5% para verificar se o corte éentre 300-700 pb com uma intensidade média de 500 pb.
8. Após sonicação, amostras de centrifugação durante 10 min a 17.949 xg, a 4 ° C, e transferir o sobrenadante para um novo tubo.
   1. Executar a estimativa de proteína utilizando o kit de ensaio de proteínas comerciais de acordo com o protocolo do fabricante. Use igual quantidade de lisado para Chip de controle e amostras experimentais. De um modo geral, usar 1 mg de lisado total por reacção de chip.
9. Preparar pasta a 50% de proteína A-agarose usando tampão contendo FA140 cocktail inibidor de protease. Adicionar 1/10 volume de cocktail inibidor de protease. Calcular o volume de grânulos necessário com base no número de amostras no total.
   1. Lavar os grânulos de proteína A-agarose com tampão FA140 duas vezes para remover o tampão de armazenamento e adicionar um volume igual de tampão FA140 aos grânulos para fazer pasta a 50%.
   2. Para remover as proteínas que se ligam de forma não específica às pérolas, adicionar 50 ul de pasta a 50% de Proteína A-agarose e emCubate as amostras a 4 ° C com rotação constante extremidade-sobre-extremidade num misturador espeto rotativo durante 30 min.
10. Rotação das amostras a 956 xg, a 4 ° C durante um minuto. Recolhe-se o sobrenadante e realizar a imunoprecipitação pela adição de 8 pi de anticorpo quer H4K16ac ou 5 ul (5 ug) de 1 mg / ml de anticorpo SMARCA5 para o sobrenadante. Incubar a 4 ° CO / N com uma rotação de extremidade sobre extremidade constante num misturador de assador.
11. Salve o 1 / 10th do extrato para o controle 'input' e configure-o como de lado a -20 ° C. A entrada tem de ser inversa reticulada juntamente com as amostras IP.
12. Usar uma quantidade igual de IgG de coelho (5 ul de 1 mg / ml) tal como a amostra de controlo negativo imunoprecipitação.
13. No dia seguinte, adicionar 50 ul de 50% de proteína A-agarose slurry ao extracto e incubar durante 1 hora a 4 ° C com rotação.
14. Pellet pérolas de agarose por centrifugação a 956 xg durante 2 min a 4 ° C, remover cuidadosamente o sobrenadante e wash os grânulos com os seguintes tampões sequencialmente. Em preparações de buffer, adicione os inibidores da protease direita antes de usar.
    1. Lavar com Baixo Sal complexo imune tampão de lavagem (FA140; concentração final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 e 0,1% de desoxicolato de sódio) durante 5 min a 4 ° C com rotação de extremidade sobre extremidade.
    2. Lavar com alto de sal complexo imune tampão de lavagem (FA500; concentração final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 e 0,1% de desoxicolato de sódio) durante 5 min a 4 ° C com rotação de extremidade sobre extremidade.
    3. Lava-se com LiCl complexo imune tampão de lavagem (concentração final de 10 mM de Tris-Cl pH 8,0, 250 mM de LiCl, 0,5% NP40 e 0,5% de desoxicolato de sódio) durante 5 min a 4 ° C com rotação de extremidade sobre extremidade.
15. Após lavagens, tal como descrito acima, adicionar 200 ul de solução de eluição (concentração final de SDS a 1% e bicarbonato de sódio 100 mM) e incubate à temperatura ambiente durante 15 minutos com rotação de extremidade sobre extremidade à TA.
16. Rotação das amostras a 956 xg à temperatura ambiente e transferir o eluato para um novo tubo de 1,5 mL. Repetir o passo 1.15 com solução de eluição adicional de 200 ul.
17. A 400 ul do eluato, adicionar NaCl a uma concentração de 0,16 M e misturar bem.
    1. Além disso, adicionar solução de eluição de 400 uL a 10 uL de entrada que foi posto de lado (passo 1.11) e adicionar a uma concentração de NaCl de 0,16 M a inverter amostras de entrada de reticulação bem. Inverter a ligação cruzada das amostras por incubação a 65 ° C em banho de água durante 5 horas.
18. Adicione 1 ml de EtOH a 100% para o produto de eluição inversa reticulado. Misturar bem e incubar à temperatura de -80 ° C durante 2 - 3 h a -20 ° ou CO / N. Rodar as amostras a 17.949 xg durante 15 min e descartar etanol.
19. Adicionar 800 ul de etanol a 70% para lavar o sedimento. Rotação em 17.949 xg durante 15 min a 4 ° C e descartar etanol. Rotação brevemente para remover o etanol residual qualquer. Secar as amostras a 37 ° C durante 10 min para remover o etanol residual.
20. Dissolve-se o ADN em 90 ul de ARNase e ADNase isenta de água e adiciona-se 2 ul de 10 mg / ml de RNase com uma solução a 0,2 mg / ml de concentração final. Incubar a 37 ° C em banho-maria durante 30 min.
21. Adicionar 10 ul de Tampão Proteinase K 10x (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM de EDTA, pH 8,0, SDS a 5%). Misturar bem e adicionar 1 ml de Proteinase K. Incubar a 42 ° C durante 1 h.
22. Purificar DNA de entrada e chip usando kit comercial de purificação de PCR de acordo com o protocolo do fabricante e eluir DNA em 50 ul de água. ADN Armazenar a -20 ° C até à sua utilização.

2. Slot de Blot Análise de DNA ChIP

1. Medir o rendimento de ADN de entrada e ChIP eluída em 50 ul de água, tal como descrito na etapa 1,22 utilizando um espectrofotómetro a 280 nm de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Aqui volumes iguais (50 ul) de entrada ou de ADN imunoprecipitado que estão dentro do intervalo linear de detecção.
   1. Por exemplo, se a entradaRendimento de DNA é de 1,5 ng / mL, em seguida, tomar 30 ul (ou 45 ng de DNA total) e fazer volume para 50 mL com água. Para o fator Chip, tomar todo o fluido 50 ul do Passo 2.1 e vá para a etapa 2.3.
3. Desnaturar 50 ul de entrada ou de ADN imunoprecipitado pela adição de 2,5 volumes de NaOH 0,4 N, vortex brevemente e centrifuga-se durante 956 xg durante 10 seg, e incubar à TA durante 30 min.
4. Neutraliza-se a ADN desnaturado através da adição de 175 ul de 1 M de Tris-HCl, pH 6,8, vortex, centrifugar para 956 xg durante 10 seg e colocar as amostras em gelo.
5. Prepara-se uma diluição em série de entrada e de ADN imunoprecipitado para o ensaio de transferência de entalhe, conforme descrito abaixo.
   1. Siga passos 2.3 - 2.4 para obter um volume total de amostra de 350 uL (ou seja, 50 ul de entrada / ADN Chip, 125 uL de NaOH 0,4 N, 175 ul de 1 M de Tris-HCl, pH 6,8).
      Nota: Para o exemplo acima referido, 45 ng de DNA de entrada vai acabar sendo 0,129 ng / mL.
   2. Para DNA de entrada, rotular três tubes como 100, 50 e 25 e adiciona-se 100 ul, 50 ul e 25 ul da amostra de DNA desnaturada e neutralizada. Completar o volume final de 100 ul com água isenta de nuclease. Para chip de ADN, a etiqueta como três tubos 200, 100 e 50 e adicionar 200 ul, 100 ul e 50 ul da amostra de DNA desnaturada e neutralizada. Faça volume final para 200 mL com água livre de nuclease.
6. Cortar a membrana com o tamanho do aparelho de slot blot. Pré-molhou a membrana e papéis mata-borrão em 20x SSC antes e antes da adição do DNA. Montá-los no aparelho de slot blot de acordo com o protocolo do fabricante.
7. DNA Pipet do passo 2.5.2 em slots apropriados. Aplicar vácuo para puxar lentamente o ADN sobre a membrana Zeta-probe. Pare de vácuo depois de todas as amostras passaram pelo aparelho.
   1. Desmontar o aparelho e imobilizar imediatamente o ADN para a membrana utilizando um reticulador de UV. Ter a cara da DNA-se no reticulador UV e usar o autocrosslink configuração em que o agente reticulante. Siga o protocolo do fabricante.
8. Detectar BrdU no blot ranhura através da realização de transferência de western.
   1. Bloquear a membrana com 5% de leite seco não gordo em PBS contendo 0,1% de Tween-20 (PBST) durante 1 h à TA, para impedir a ligação não específica de anticorpos contra a membrana.
   2. Adicionar anticorpo primário anti-BrdU (diluição 1: 500) diluída em 1% de leite seco não gordo em PBST e incubar o blot com o anticorpo primário durante 3 horas à temperatura ambiente num agitador. Lava-se a membrana com PBST três vezes após a incubação do anticorpo primário.
   3. Adicionar anticorpo conjugado com HRP anti-ratinho secundário para o blot (1: 5000 de diluição) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Lava-se a membrana com PBST três vezes após a incubação do anticorpo secundário.
      NOTA: Use um volume suficiente de anticorpos para cobrir completamente a membrana durante incubações de anticorpos primários e secundários.
9. Preparar a mistura de ECL e adicioná-lo à ac blotgundo o protocolo do fabricante. Incubar a membrana com uma mistura de ECL durante 5 min à TA.
   1. Colocar a membrana em uma cassete de raios-X, expor a membrana a um filme de raios-X e desenvolver o blot utilizando o protocolo do fabricante.
   2. Quantificar o sinal obtido para entrada e DNA chiped após a digitalização das manchas usando o software Image J de acordo com o protocolo do fabricante. Para quantificação, usar o sinal que está dentro da gama linear de detecção, a fim de garantir a precisão da medição.

Resultados

Para determinar a especificidade dos inibidores selectivos HDAC1,2, foram usadas Hdac1,2 ^{FL / FL} e ^FL HDAC3 ^{/ FL} células de fibrossarcoma. Foi utilizado a recombinase Cre (Ad-Cre) contendo adenovírus para excluir Hdac1,2 e HDAC3 nestas células. Após a infecção Ad-Cre de Hdac1,2 ^{FL / FL} células, foi observado um aumento robusto na H4K5ac. O tratamento de células com knoc...

Discussão

O protocolo descrito neste manuscrito é um método relativamente rápido para demonstrar a presença das proteínas ou as suas formas modificadas pós-tradução de DNA recentemente replicado ou nascente. Além disso, esta técnica permite um para medir a cinética da associação, dissociação de uma proteína ou a sua forma modificada com o ADN nascente. Esta técnica é complementar da tecnologia elegante iPOND ^13. Na tecnologia iPOND, ADN sintetizado de novo é marcado com acetato de desoxiuridina (EdU). Um conjugado biot...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-BrdU (westerns)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT Membrane	Bio-Rad	162-0197
Formaldeído	Fisher	BP531-500
Proteína A agarose	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma	P4850
Kit de Purificação PCR	Qiagen	28106
Glicina	Sigma	G7403
Inibidor de protease coquetel	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Coelho IgG& nbsp;	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Desoxicolato de sódio	Sigma	D6750
Bicarbonato de sódio	Sigma	S-4019
Etanol	Decon Laboratories	04-355-222
Água tratada com DEPC	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Hidróxido de sódio	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20x SSC	Life Technologies	15557-036
Leite em pó desnatado	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
Filme de raio-X	Genesee Sci	30-101
Desenvolvedor	Konica Minolta	SRX-101A
UV Crosslinker	Stratagene	XLE-1000
Sonicator	Branson Sonifier  Disruptor de Célula Ultrassônico Digital	Modelo: 450
Centrifuge	Eppendorf	Modelo: 5810R
Banho-maria	Fisher Scientific Isotemp	Modelo: 2322
NanoDrop 1000 espectrofotômetro	Modelo ThermoScientific	: Aparelho de 1000
Slot Blot	Schleicher and Schuell Minifold II	44-27570
Incubadora de Cultura de Tecidos	Thermo Scientific	Série II 3110 Incubadoras

de CO2 com camisa de água