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Artigo de método

Time-Lapse Vídeo Microscopia de Avaliação da EYFP-Parkin Agregação como um marcador para Cellular Mitophagy

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DOI:

10.3791/53657

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4 de maio de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Thomas Jefferson University, SKCC, 2Department of Medical Oncology, Thomas Jefferson University, SKCC, 3Kazan Federal University

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos em detalhes uma abordagem de microscopia de vídeo com lapso de tempo para medir o recrutamento temporal de EYFP-Parkin durante a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas. Este processo dinâmico de remoção dependente de EYFP-Parkin de mitocôndrias danificadas pode ser usado como um indicador da saúde celular sob diferentes condições experimentais.

Resumo

A microscopia de vídeo com lapso de tempo pode ser definida como a imagem em tempo real de células vivas. Essa técnica depende da coleta de imagens em diferentes momentos. Os intervalos de tempo podem ser definidos por meio de uma interface de computador que controla a câmera integrada ao microscópio. Esse tipo de microscopia requer tanto a capacidade de adquirir eventos muito rápidos quanto o sinal gerado pela estrutura celular observada durante esses eventos. Depois que as imagens foram coletadas, um filme de todo o experimento é montado para mostrar a dinâmica dos eventos moleculares de interesse. A videomicroscopia de lapso de tempo tem uma ampla gama de aplicações no campo da pesquisa biomédica e é uma ferramenta poderosa e única para acompanhar a dinâmica dos eventos celulares em tempo real. Por meio dessa técnica, podemos avaliar eventos celulares como migração, divisão, transdução de sinal, crescimento e morte. Além disso, usando sondas moleculares fluorescentes, somos capazes de marcar moléculas específicas, como DNA, RNA ou proteínas, e acompanhá-las em suas vias e funções moleculares. A microscopia de vídeo com lapso de tempo tem várias vantagens, sendo a principal delas a capacidade de coletar dados no nível de uma única célula, que a tornam uma tecnologia única para investigação no campo da biologia celular. No entanto, a videomicroscopia com lapso de tempo tem limitações que podem interferir na aquisição de imagens de alta qualidade. As imagens podem ser comprometidas por fatores externos; flutuações de temperatura, vibrações, umidade e fatores internos; pH, motilidade celular. Aqui, descrevemos um protocolo para a aquisição dinâmica de uma proteína específica, Parkin, fundida com a proteína fluorescente amarela aprimorada (EYFP) para rastrear a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas, usando uma abordagem de microscopia de vídeo com lapso de tempo.

Introdução

A macro autofagia é um processo intracelular que envolve a degradação catabólica de componentes celulares danificados e disfuncionais, como organelas e proteínas, para fins de reciclagem ou produção de energia. Para iniciar esse processo metabólico, a célula engole os componentes celulares danificados em uma estrutura de membrana dupla, conhecida como autofagossomo, que se funde com um lisossomo e seu conteúdo é degradado e reciclado 1,2. Existem dois tipos principais de autofagia, a não seletiva e a seletiva. O processo de autofagia não seletiva ocorre quando a célula está sob condições de privação de nutrientes e precisa procurar nutrientes essenciais e energia. No entanto, a autofagia seletiva ocorre para mediar a remoção de organelas e proteínas disfuncionais/danificadas que, de outra forma, poderiam ser tóxicas. Um dos processos de autofagia seletiva mais estudados é a remoção das mitocôndrias, denominada mitofagia 1,3-5.

As mitocôndrias são as organelas centrais para o metabolismo celular e a principal fonte de trifosfato de adenosina (ATP) por meio da fosforilação oxidativa através da cadeia de transporte de elétrons, oxidação de ácidos graxos e ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Além disso, as mitocôndrias regulam a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e liberam proteínas que participam das vias de morte celular 6-8.

a quinase putativa induzida por PTEN 1 (PINK1) e a ubiquitina ligase Parkin RBR E3 (Parkin) são as principais proteínas implicadas no processo de mitofagia. Parkin pode proteger contra a morte celular, mantendo a célula saudável por meio do controle de qualidade mitocondrial9. Após a perda do potencial da membrana mitocondrial, a Parkin citosólica é recrutada para as mitocôndrias por PINK1. Esse recrutamento desencadeia os eventos sequenciais da mitofagia 10. Há uma ampla gama de evidências de que a mitofagia é um processo fundamental de controle de qualidade das mitocôndrias e anormalidades nesse processo impulsionam a doença 7. Por exemplo, a doença de Parkinson autossômica recessiva tem sido associada a mutações nos genes que codificam Parkin e PINK1 (PARK2 e PINK1, respectivamente) 11. O controle de qualidade da saúde mitocondrial é essencial para a remoção das mitocôndrias que contribuem para o acúmulo de ROS12. A presença excessiva de ROS intracelulares pode levar a danos ao DNA nuclear e mitocondrial (DNA e mt DNA, respectivamente).

Aqui, mostramos uma abordagem de microscopia de vídeo com lapso de tempo para acompanhar a agregação de Parkin após a indução de mitofagia mediada por Parkin em fibroblastos embrionários de camundongos imortalizados via administração in vitro de cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona (FCCP), um agente de desacoplamento. O FCCP interrompe a síntese de ATP por curto-circuito de prótons através da membrana externa da mitocôndria e, portanto, desacoplando a fosforilação oxidativa da cadeia de transporte de elétrons 13. O desencadeamento da despolarização da membrana mitocondrial leva à ruptura das mitocôndrias e à remoção seletiva dependente de Parkin. Portanto, a transfecção das células de interesse com um vetor de expressão que codifica Parkin fundido com um marcador fluorescente (proteína fluorescente amarela aprimorada, EYFP) pode ser usada como uma marca fluorescente para acompanhar o recrutamento de Parkin durante o processo mitofágico. Para visualizar as mitocôndrias, co-transfectamos pDsRed2-Mito, que codifica a proteína fluorescente vermelha (DsRed2) que contém uma sequência de direcionamento mitocondrial da subunidade VIII da citocromo c oxidase (Mito). O pDsRed2-Mito foi projetado para marcação fluorescente de mitocôndrias14. O tempo necessário para a translocação de Parkin para a membrana mitocondrial pode ser medido e fornece uma medida indireta da saúde celular. Por exemplo, podemos dizer que se uma linhagem celular nocauteada para um determinado gene de interesse mostra um recrutamento mais rápido ou mais lento de Parkin após a indução da mitofagia por FCCP, esse produto gênico seria um jogador-chave para manter as taxas metabólicas da célula no estado fisiológico e prevenir o desenvolvimento de doenças. Portanto, a videomicroscopia de lapso de tempo fornece uma ferramenta muito poderosa para aplicações de pesquisa básica e clínica no acompanhamento da dinâmica das proteínas marcadas durante seus processos moleculares e na compreensão de como esses processos são afetados durante uma condição patológica.

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Protocolo

1. Eletroporação de Fibroblasto com Ambos Expression Vectors EYFP-Parkin e pDsRed2-Mito

  1. Cresça o rato imortalizada células de fibroblastos embrionários de 10 centímetros placa de cultura de tecidos, utilizando meio DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / mL estreptomicina, em atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 a 37 ° C.
    1. Na confluência celular de 80%, descartar o meio DMEM completo por sucção estéril e adicionar 10 ml de solução tampão de fosfato de 1x estéril (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 e 1 L de H2O destilada, pH: 7,4).
    2. Descartar o PBS por sucção estéril e adicionar 1 mL de Tripsina-EDTA a 0,25%. Incubar a placa a 37 ° C até as células são separadas (2-3 minutos). Adicione 4 ml de meio DMEM completo, voltar a suspender as células e tirar 10 _6; L da suspensão de células para a contagem em hemocitómetro.
      NOTA: O hemocitómetro é concebido de modo que o número de células em um conjunto de quadrados de canto 16 é equivalente ao número de células x 10 4 / ml.
  2. Semente de 1 x 10 6 células nas placas de 10 cm de cultura de tecidos de 24 horas antes do processo de electroporação.
  3. Descartar o meio DMEM completo por sucção estéril e adicionar 10 ml de PBS estéril. Descartar o PBS por sucção estéril e adicionar 1 mL de Tripsina-EDTA a 0,25%. Incubar a placa a 37 ° C até as células são separadas (2-3 minutos). Adicionar 4 ml de meio DMEM completo e ressuspender as células em um tubo de 15 ml.
  4. Rodar as células para baixo a 250 xg durante 5 min, utilizando a-centrifugadora refrigerada (4 ° C). Descartar o sobrenadante por aspiração estéril e ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS estéril. Rodar as células para baixo a 250 xg durante 5 min a 4 ° C.
  5. Descartar o sobrenadante por aspiração estéril, e adiciona-se 100 ul Of mix solução para eletroporação (82 ul de eletroporação Solução V + 18 ml de solução Suplementar 1) para o pellet celular e delicadamente ressuspender o sedimento pipetando (Para mais detalhes, consulte o manual do utilizador). Adicionar 2 ug de EYFP-Parkin (excitação / emissão de 514/527) e 1 ug pDsRed2-Mito (excitação / emissão de 565/620) a suspensão de células.
  6. Transferir a solução para a cuvete estéril usando um pasteur descartável (ambas as ferramentas são fornecidos com o kit) e electroporate usando o programa pré-definido NIH / 3T3 U-030 (pulso único, tensão de 200 V, capacitância 960 mF, tempo de pulso de 20 milissegundos , número de pulsos: 1).
  7. Imediatamente após a electroporação, adicionar 500 uL de meio DMEM completo pré-aquecido frescos e as sementes da célula em um-processamento de imagem de grau directo de 6 centímetros de cultura de tecidos de placa e incubar-los numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 a 37 ° C durante 24 horas.

2. Time-Lapse Vídeo Microscopy

  1. Ajustar a temperatura da câmara do microscópio a 37 ° C antes de usar.
  2. Neste ponto, se preparar um meio específico de imagens ao vivo para prosseguir com o protocolo experimental. Prepare o suporte de imagens ao vivo da seguinte forma; misturar DMEM isento de fenol suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina. Pré-aquecer o meio de imagens ao vivo a 37 ° C num banho de água.
  3. Descartar a forma das células electroporadas por sucção estéril e adicionar 1 ml de meio de imagens ao vivo pré-aquecido, usando uma pipeta P1000 e incubar a placa durante 30 minutos a 37 ° C.
  4. Durante o período de incubação da placa, influxo de 5% de CO 2 na câmara do microscópio já a uma temperatura estável de 37 ° C.
  5. Coloque a placa com as células electroporadas à câmara do microscópio evitar grandes movimentos ou oscilações.
  6. Utilizando o software de interface, definir o microscópio, a fim de detectar tanto fluorésinais scence de as proteínas de fusão codificadas pelos vectores co-transfectados, EYFP-Parkin (gama Excitação 495-510 nm e faixa de emissão de 520-550 nm, verde) e o pDsRed2-Mito (excitação máximo 558 nm e de emissão de máximo 583 nm, vermelho).
    1. Abra o software de vídeo microscopia de lapso de tempo. No menu superior, selecione a FITC para EYFP-Parkin e Rodamina para pDsRed2-Mito. No menu superior, selecione a ampliação (20x).
  7. Usando a interface do software, procure a única célula expressando ambos os vectores de co-transfectadas e registrar a posição. Repita este passo até um mínimo de 10 células são coletadas para cada condição experimental (grupo experimental).
    1. Selecione o menu "Aplicativos" e clique em Aquisição multi-dimensional. Nas janelas de aquisição multi dimensional seleccionar os parâmetros necessários, tais como o número de aquisições, o intervalo de tempo entre cada uma das aquisições e a posição da célula registada. Clique em "Adquirir"Para iniciar o processo de aquisição.
  8. Comece a aquisição basal de ambos EYFP-Parkin e sinal fluorescente DsRed2-Mito recolher imagens a cada 5 minutos para um intervalo total de 15 min.
  9. Prepare meio de imagem ao vivo pré-aquecido com uma concentração de FCCP duas vezes mais elevada do que a concentração final de trabalho (0,1-10 uM, dependentes de tipo de célula).
  10. Interromper o processo de aquisição e adicionar suavemente 1 ml de meio de imagens ao vivo pré-aquecido com FCCP para a placa dentro da câmara do microscópio utilizando uma pipeta P1000.
  11. Reiniciar o processo de aquisição, como anteriormente descrito, para um período total de 3 horas, utilizando a posição registada. Salve todas as imagens adquiridas, a fim de analisá-los e criar um vídeo do processo mitophagic quando a aquisição é longo.

3. Análise

  1. Recolha todas as imagens adquiridas em formato "tiff" em um computador pessoal
  2. Abra as imagens com um pano macio gráficoWare e definem o intervalo de tempo ocorreu a partir da mitocondrial induzida por despolarização com FCCP para a primeira imagem que mostra o recrutamento de Parkin na membrana mitocondrial (as imagens são adquiridas a cada 5 minutos). Repetir esta análise para cada célula no grupo experimental.
  3. Rotular a primeira célula da coluna, numa folha de cálculo com o nome do grupo experimental. Para cada grupo experimental, medir os intervalos temporais para Parkin recrutamento de um mínimo de 10 células. Realizar uma média dos intervalos temporais calculados para o recrutamento e Parkin definir o desvio padrão para cada grupo experimental (Média ± DP, n = 10).
    1. Organizar-se em colunas os intervalos temporais calculados individuais. Cada coluna contém o n = 10 medidas do grupo experimental.
    2. Seleccione a função de "médio" a partir do menu Formula Builder. Seleccionar os dados na coluna. Seleccione a função "Desvio Padrão" no menu Formula Builder. SeleCT os dados na coluna.
  4. Usando uma abordagem estatística, comparar os grupos experimentais que aplicam a estatística apropriada, a fim de definir uma diferença significativa na dinâmica de mitophagy entre os grupos experimentais. (Por exemplo, dois grupos = t de Student, três ou mais grupos = ANOVA além de um teste post-hoc)

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Resultados

Aqui, mostramos como microscopia de lapso de tempo vídeo é uma técnica poderosa que pode ser usado para acompanhar os acontecimentos moleculares de proteínas fluorescentes-marcado em uma única célula. Os resultados representativos também mostram como esta técnica permite a aquisição de imagens de alta qualidade. Quando as imagens dos processos moleculares, são obtidas, que têm a oportunidade de analisá-los de modos diferentes. Aqui, analisamos o intervalo de tempo entre o início do proce...

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Discussão

microscopia de lapso de tempo pode ser definido como a técnica que se estende imagem de células vivas a partir de uma única observação em tempo para a observação da dinâmica celular durante longos períodos de tempo. Esta metodologia é distinguida de uma simples confocal ou microscopia de células vivas porque permite que o observador identificar em tempo real, com uma única proteína fluorescente marcado com e seguir a sua dinâmica dentro de uma única célula viva. Na verdade, a microscopia confocal pode facilmente identif...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte por doações do NIH (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 para R.G.P.), a concessão do Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core P30CA056036 (R.G.P.), uma doação da Breast Cancer Research Foundation, doações generosas do Dr. Ralph e Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) e uma doação do Departamento de Saúde da Pensilvânia (R.G.P.). Em parte, este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Italian Cancer Foundation (GD) e pelo Recurso Compartilhado de Bioimagem do Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5, P30, CA-56036). O Departamento se isenta especificamente da responsabilidade por uma análise, interpretações ou conclusões. Não há conflitos de interesse associados a este manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMCorning Life Science10-013-CVPré-aquecido a 37 ° C antes de usar
DMEM sem fenolCorning Life Science17-205-CVPré-aquecido a 37 ° C antes do uso
Soro fetal bovinoSigma-AldrichF2442Pré-aquecido a 37 ° C antes
de usar L-GlutaminaGibco25030Pré-aqueça a 37 ° C antes de usar
Penicilina/estreptomicinaCorning Life Science30-002-CIPré-aquecer a 37 ° C antes do uso
Vetor de expressão EYFP-PARKINAddgene23955
pDsRed2-Mito Vetor de expressãoClontech632421
Nucleofector 2B DispositivoLONZAAAD-1001S
Nucleofector para kit R NIH / 3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M microscópio invertidoCARL ZEISS
Carbonilo Cianeto 4-(trifluorometoxi)-Fenilhidrazona (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorphMolecular DevicesExperimental
ImageJNational Institute of HealthExperimental
Builder Builder

Referências

  1. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).
  2. Zhi, X., Zhong, Q. Autophagy in cancer. F1000Prime Rep. 7, 18(2015).
  3. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
  4. Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
  5. Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
  6. Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
  7. Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
  8. Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
  9. Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
  10. Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002(2012).
  11. Trinh, J., Farrer, M. Advances in the genetics of Parkinson disease. Nat Rev Neurol. 9, 445-454 (2013).
  12. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  13. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
  14. Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
  15. Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
  16. Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
  17. Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
  18. Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
  19. Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
  20. Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
  21. Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
  22. Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
  23. Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
  24. Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
  25. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
  26. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
  27. Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
  28. Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
  29. Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
  30. Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
  31. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).

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