Desenvolvimento de um modelo de rato baseada alfa-sinucleína para a doença de Parkinson por meio de injecção estereotáxica de um vector viral recombinante adeno-associado

Resumo

Este manuscrito descreve como a entrega de genes locais mediada por vetores virais fornece uma maneira atraente de expressar transgenes no sistema nervoso central. O protocolo descreve todas as etapas cruciais para realizar uma injeção de vetor viral na substância negra do rato para desenvolver um modelo animal baseado em vetor viral para a doença de Parkinson.

Resumo

A fim de estudar as vias moleculares de doença de Parkinson (DP) e para desenvolver novas estratégias terapêuticas, os investigadores científicos confiar em modelos animais. A identificação dos genes associados com a DP tem levado ao desenvolvimento de modelos genéticos PD. mouse modelos α-SYN mais transgênicas desenvolver gradual patologia α-SYN, mas não conseguem exibir perda de células dopaminérgicas clara e déficits comportamentais dependentes da dopamina. Este obstáculo foi superado pela segmentação direta da substância negra com vetores virais que superexpressam genes associados à DP. a entrega do gene local usando vetores virais fornece uma maneira atraente para expressar transgenes no sistema nervoso central. Regiões específicas do cérebro podem ser alvo (por exemplo, a substância negra), a expressão pode ser induzida na configuração adulto e elevados níveis de expressão pode ser alcançada. Além disso, podem ser utilizados diferentes sistemas de vectores à base de vírus diferentes. O protocolo descreve todos os passos cruciais para realizar um vetor viralinjecção na substantia nigra do rato para desenvolver um modelo animal baseados em vírus vector alfa-sinucleína para a doença de Parkinson.

Introdução

Para estudar a fisiopatologia da DP e para desenvolver novas estratégias terapêuticas, há uma necessidade urgente de modelos animais que se assemelham os sintomas neuropatologia, fisiologia e motores da DP humano. Quanto maior o valor preditivo, melhor podemos traduzir novas terapias de modelos animais para os pacientes.

A descoberta de alfa-sinucleína (α-SYN) como o primeiro gene PARK em 1997, levou ao desenvolvimento dos primeiros modelos PD genéticos. Muitos ratos transgênicos com superexpressão humano de tipo selvagem (WT) ou mutante (A30P, A53T) α-SYN foram gerados ao longo da última década. Os níveis de sobreexpressão α-SYN provaram ser crucial no desenvolvimento da patologia. Além disso, a estirpe de ratinho, a presença ou ausência de endógena α-SYN e se o comprimento completo ou uma forma truncada é expresso, desempenha um papel (revisão detalhada pela magem e Chesselet ^1). A sobre-expressão de ambos WT e vários mutantes clínicos de humano &# 945; -SYN em ratinhos transgénicos induz a acumulação patológica de α-SYN e disfunção neuronal ^2-6. No entanto, até modelos de rato α-SYN agora a maioria transgênicas não conseguiu exibir perda de células dopaminérgicas clara e déficits comportamentais dependentes da dopamina.

Este obstáculo foi superado pela segmentação direta da substantia nigra (SN) com vetores virais com superexpressão α-SYN. Os vectores virais são derivados a partir de vírus que infectam as células podem facilmente, introduzir material genético no seu genoma hospedeiro e forçar a célula hospedeira para replicar o genoma viral, de modo a produzir novas partículas virais. Os vírus podem ser manipuladas para vectores virais não replicantes que conservam a sua capacidade de entrar nas células e introduzir genes. Por eliminação de partes do genoma viral e substituindo-os pelos genes de interesse, o vector de aplicação vai resultar em uma única infecção rodada sem replicação na célula hospedeira, geralmente designado como "transdução". Os vectores virais cum ser usado tanto para a sobre-expressão e silenciamento do gene. O transgene expressa pode ser uma proteína repórter (por exemplo, proteína verde fluorescente ou luciferase de pirilampo) ^7, uma proteína terapêutica para aplicações de terapia genética ^8-10 ou, como vamos focar neste trabalho, uma proteína relacionada com a doença usados ​​para modelagem doença ^{11 -14.}

entrega de genes mediada por vectores virais fornece uma forma alternativa de expressar os transgenes no SNC com várias vantagens. Usando entrega transgene local, regiões específicas do cérebro podem ser alvo. Além disso, a expressão do transgene pode ser induzido durante a vida adulta diminuindo o risco de mecanismos de compensação durante o desenvolvimento. Além disso, os modelos podem ser criados em diferentes espécies e estirpes. E, finalmente, diferentes transgenes podem ser facilmente combinados. Utilizando vectores virais, os níveis de expressão elevado do transgene pode ser alcançada, que pode ser crucial uma vez que o aparecimento e gravidade da doença frequentemente depender do nível de OVEREXPression.

Vários sistemas de vectores à base de vírus diferentes foram desenvolvidos. A escolha do sistema de vector depende do tamanho do gene de interesse, a duração necessária da expressão de genes, a célula alvo e questões de biosegurança. Para a transferência de genes estável no cérebro, Lentivirus (LV) e virais adeno-associado recombinante (rAAV) vectores são agora considerados os sistemas de vector de escolha, uma vez que conduzem a expressão do gene eficiente e a longo prazo no cérebro de roedores. Para segmentação específica dos neurônios dopaminérgicos (DN) do SN, vectores de rAAV foram gradualmente outcompeted vetores LV por causa de seus títulos mais elevados e eficiência de transdução de DN.

Os melhores modelos de roedores com base α-SYN disponíveis atualmente foram desenvolvidos a partir de uma abordagem combinada usando sorotipos AAV mais recentes (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) e otimizado construções de vector, títulos e pureza ^15,16. A título de vector, bem como a pureza do vetor influencia directamenteo resultado fenotípica do modelo. Os títulos de vetor excessivas ou lotes vetor insuficientemente purificadas pode resultar em toxicidade não específica. Portanto, vetores de controlo adequados são indispensáveis. investimento de tempo considerável na produção vetor, upscaling e procedimentos de purificação virais também tem se mostrado essencial para obter lotes vetor reprodutíveis e de alta qualidade.

Protocolo

Todos os experimentos com animais são realizadas em conformidade com a directiva de 24 de Novembro de 1986 (86/609 / CEE) Comunidades Europeias e aprovado pelo Comitê de Bioética da Universidade de Leuven (Bélgica).

1. AAV recombinante Produção e Purificação

Nota: A produção do vector de rAAV e a purificação foi realizada pela Leuven Vector viral núcleo (LVVC) como previamente descrito ^17.

1. Resumidamente, transfectar subconfluentes baixo (<50) de passagem células HEK 293T aderentes utilizando uma polietilenimina linear 25 kD solução de transfecção 150 nM de NaCl e três plasmídeos diferentes numa proporção de 1: 1: 1 em meio DMEM soro bovino fetal a 2%. Após 24 h de incubação a 37 ° C em 5% de CO _2, substituir o meio com meio fresco de DMEM soro bovino fetal a 2%.
   Nota: Os plasmídeos incluem os construtos para o serotipo AAV7, o plasmídeo de transferência de AAV que codifica o mutante humano A53T α-SYN sob o controlo do CMVie reforçada synapsin1 promotor e o pAdvDeltaF6 adenoviral plasmídeo auxiliar ^17.
2. Colher as médias de 5 dias após a transfecção transiente e se concentrar utilizando filtração de fluxo tangencial ^17.
3. Purifica-se as partículas de vector de rAAV a partir do meio concentrado utilizando um gradiente por passos de ¹⁷ iodixanol.
4. Utilize as técnicas padrão de PCR em tempo real para a cópia genômica (GC) determinação. Neste protocolo, a título de vector de 3,0 E11 GC / ml foi utilizado para desenvolver um modelo de rato com base α-SYN para PD ^17.

2. injecção estereotáxica de α-SYN vector de rAAV no SN do rato (Figura 2)

1. Casa oito semanas de idade ratas Wistar pesando cerca de 200-250 g sob 12 h ciclo claro / escuro normal com livre acesso a ração peletizada e água da torneira.
2. Submeta o rato para administração intraperitoneal (ip) a anestesia que contém uma mistura de cetamina (60 mg / kg) e medetomidina (0,4 mg / kg). Uma vez que o rato é anestesiado e não reagequando apertando as diferentes patas, subcutaneamente administrar um micro-transponder na parte traseira do rato para reconhecimento ulterior usando um dispositivo de implantação de micro-respondedor. Verificar se o micro-respondedor está posicionada correctamente e pode ser lida pelo dispositivo de leitura.
3. Cortar o cabelo no topo do couro cabeludo. Aplicar um anestésico local, tanto o couro cabeludo e as orelhas. Executar o restante do procedimento cirúrgico sob um fluxo laminar utilizando técnicas assépticas.
4. Coloque os ratos em um quadro estereotáxico cabeça utilizando duas barras de ouvido, uma boca e um bar nariz. Cobrir o corpo do rato com uma manta de papel a fim de evitar uma queda na temperatura corporal. Aplicar um lubrificante ocular para evitar que os olhos de secagem.
5. Desinfectar o couro cabeludo com jodium 1% em isopropanol a 70% e fazer uma pequena incisão na linha média do couro cabeludo. Raspe fora as membranas no crânio e enxaguar com soro fisiológico. Deixe o crânio seco durante vários minutos. Observe as suturas cranianas e os dois pontos de referência: bregma e lambda.
6. Para injectar o vector de rAAV para o SN, definir as coordenadas no sentido bregma (anteroposterior: 5,3 milímetros; mediolateral: 2,0 mm e dorso-ventral: 7,2 mm contados a partir da dura-máter).
   Nota: As coordenadas tridimensionais para cada região de interesse pode ser calculado usando um atlas estereotáxica do cérebro do rato, aplicando bregma como ponto de referência anatômica.
7. Encher uma seringa de micro-injecção de 10 ul (30 calibre 20 mm) com o vector de rAAV e colocá-lo no instrumento estereotáxico ligado com uma bomba de micro-injecção motorizada. Controlar o volume, liberando uma gota de vector e eliminar em um detergente de limpeza polivalente pH 9 (por exemplo RBS).
8. Visualmente verificar se a cabeça é fixa em linha reta no quadro de cabeça e avaliar o eixo esquerda-direita. Cuidadosamente definir visualmente os ântero-posterior e médio-lateral coordenadas para bregma e lambda e medir a sua altura usando uma agulha de calibre 30 20 milímetros no braço dorsoventral do quadro estereotáxico.
   1. permitir amaximum de diferença de 0,3 mm de altura entre bregma e lambda. Coloque a agulha de volta no bregma e aplicar o ântero-posterior e coordenadas mediolaterais movendo o ântero-posterior e médio-lateral do braço do quadro estereotáxico.
9. No local de injeção, medir a altura do crânio e garantir que ele não difere mais de 0,3 mm a partir da altura da bregma. Perfurar um orifício no crânio com um diâmetro de aproximadamente 2 mm. Medir a altura da dura-máter, isto servirá como uma referência para aplicar o dorsoventral de coordenadas. Alternativamente subtrair uma espessura fixo para o crânio (0,9 mm).
10. Penetre a dura-máter, utilizando uma agulha de calibre 26 e absorver o sangue com um tecido estéril. Espere até que todos sangramento parou antes de prosseguir.
11. inserir lentamente a microinjecção seringa de 10 mL, pré-carregadas com uma solução de vector no cérebro para a profundidade pré-determinada (dorsoventral de coordenadas). Espere 1 min com a agulha no lugar. Injectar 3 ulde solução de vetor (3,0 E11 genoma cópias / ml (dose vector médio) ou 1,0 E12 GC / ml (dose alta vector) de rAAV2 / 7 α-SYN ou eGFP vector de controlo) utilizando a bomba de microinjecção motorizado com um caudal de 0,25 mL / min.
12. Após a injeção, manter a agulha no lugar por mais 5 min antes de removê-lo lentamente. Costurar o couro cabeludo com revestido de poliéster trançado 3.0, desinfectar com 1% jodium em 70% isopropanol e remova cuidadosamente o animal do instrumento estereotáxico. Primeiro solte a barra de nariz e da boca, então as duas barras de ouvido.
13. Para reverter a anestesia, injectar o rato por via intraperitoneal com 0,5 mg / kg atipamezol e coloque o rato em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento de 38 ° C até que ele acorda. Cobrir o rato com uma manta de papel, para evitar uma queda na temperatura corporal.
14. Proporcionar um acesso fácil a alimentos e água para as primeiras horas. Monitorar o rato para os primeiros dias. Se necessário, aplicar a analgesia.
    Nota: Não há necessidade de remover os pontos de tele crânio. Depois de 1-2 semanas, o crânio é completamente reparado e os stiches fique solta.

3. Avaliação da rAAV2 / 7 α-SYN ratos injectados Usando Non-invasive PET Imaging, testes comportamentais e Análise imuno-histoquímica

1. Para acompanhar a cinética de neurodegeneração dopaminérgica nigroestriatal não invasiva ao longo do tempo em animais individuais, quantificar transportador de dopamina (DAT) de ligação utilizando pequenos animais tomografia por emissão de positrões (PET) e um marcador da DA Transporter por exemplo ^[18F] -FECT ¹⁶ .
2. Para examinar se o nível de neurodegeneração dopaminérgica é suficiente para induzir deficiências motoras nos ratos, submeter os ratos para o teste do cilindro para avaliar o uso forelimb espontânea.
   1. Coloque o rato em um 20 cm cilindro de vidro e fita de vídeo o comportamento de largura claro durante movimentos verticais ao longo da parede e aterragem depois de um traseiro. Marque o número de contatos feitos por cada pata dianteira para um total de 20contatos. Para uma descrição detalhada dos critérios de pontuação ver Schallert et al. ¹⁸ Expresse o número de contatos forelimb prejudicada (por exemplo, das patas dianteiras esquerda) como uma porcentagem do total de contatos forelimb (da esquerda mais pata dianteira direita).
      Nota: ratos controle não-lesionados usando as duas patas igualmente devem marcar em torno de 50% neste teste.
3. Realizar a análise imuno-histoquímica (IHQ) para avaliar o nível de expressão do transgene e perda de células dopaminérgicas.
   1. Em diferentes estágios finais, sacrificar os ratos com uma overdose de pentobarbital de sódio (60 mg / kg, ip) e realizar uma perfusão intracardíaca com solução salina fria, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS ^19. Fixar os cérebros durante a noite a 4 ° C e 50 um corte secções cerebrais coronais de espessura utilizando um micrótomo de vibração.
   2. Execute coloração IHC em secções de flutuação livre usando anticorpos contra α-SYN e tirosina hidroxilase para analisar os níveis de expressão α-SYN e da level da neurodegeneração ^16.

Resultados

O esquema geral da experiência está ilustrada na Figura 1

a sobre-expressão de rAAV 07/02-mediada de A53T α-SYN induz défices motores dependentes de dopamina.
Para examinar se o nível de α-SYN superexpressão é suficiente para induzir deficiências motoras nos ratos, que submeteram os ratos ao teste do cilindro para avaliar o uso forelimb espontânea (Figura 3A). A partir de...

Discussão

Há vários passos críticos no âmbito do protocolo. A título de vector, bem como a pureza do vetor influencia directamente o resultado fenotípica do modelo. Os títulos de vetor excessivas ou lotes vetor insuficientemente purificadas pode resultar em toxicidade não específica. Portanto, o uso de lotes de vectores de alta qualidade e vectores de controlo apropriados é indispensável. Além disso, o posicionamento exacto da cabeça do rato na moldura estereotáxica e a determinação precisa das coordenadas é essencial no direccio...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ratos Wistar fêmeas de 8 semanas	Janvier	/	200-250 g
Cetamina (Nimatek)	Eurovet saúde animal	804132
Medetomidina (Dormitor)	Orion-Pharma/ Janssen Animal Health	1070-499
Anestésico local para couro cabeludo e orelhas: Xylocaï ne gel 2%	Astrazeneca	0137-547
Terramicina	Pfizer	0132-472
Bupré norfina (Vetergesic)	Ecuphar	2623-627
Jodium 1% isopropanol	VWR	0484-0100
de cabeça estereotáxica	Seringa Stoeling	/
Hamilton (30 gauge -20 mm -pst 2)	Hamilton/ Serviço de Filtro	7803-07
atipamezol (Antisedan)	Orion-Pharma/Elanco	1300-185
rAAV A53T & vetor alfa;-SYN	LVVC, KU Leuven	/
https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ pentobarbital sódico (Nembutal)	Ceva Santé	0059-444
micrótomo	Microm	HM650
coelho policlonal sinucleína Ab	Chemicon	5038	1:5.000
coelho policlonal TH Ab	Chemicon	152	1:1.000
Lutécio oxiortossilicato baseado em detector FOCUS 220 tomógrafo	Siemens / Concorde Microsystems	/
radioligante: 18F-FECT	Internamente	/
L-dopa: Prolopa 125	Roche		6 mg/kg i.p.
DMEM, Glutamax	Life Technologies	N° 31331-093
Soro fetal bovino	Life Technologies	N° 10270-106
Polietilenonimina linear de 25 kD (PEI)	Polysciences	/
OptiPrep Gradiente de Densidade Médio: Iodixanol	Sigma	D1556-250ML
Optimen	Life Technologies	N° 51985-026
Atlas estereotipático de Paxinos 1 watston, quarta edição	Elsevier	/