Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Resumo

As projeções supraespinhais são importantes para a percepção da dor e outros comportamentos, e as fibras serotoninérgicas são um desses sistemas de fibras. O presente estudo teve como foco a aplicação do protocolo combinado CLARITY/CUBIC à medula espinhal de camundongos, a fim de investigar a terminação dessas fibras serotoninérgicas.

Resumo

fibras descendentes longos para a medula espinhal são essenciais para a locomoção, a percepção da dor, e outros comportamentos. O padrão de terminação da fibra na medula espinal da maioria destes sistemas de fibra não foram cuidadosamente investigados em qualquer espécie. fibras serotoninérgicos, que se projectam para a espinal-medula, foram estudados em ratos e em secções histológicas marsupiais e o seu significado funcional foi deduzida com base no seu padrão de terminação da fibra na medula espinal. Com o desenvolvimento de clareza e técnicas cúbicos, é possível investigar este sistema de fibra e a sua distribuição na medula espinal, a qual é susceptível de revelar características anteriormente desconhecidos de vias supraespinhais serotoninérgicos. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para geração de imagens das fibras serotoninérgicos na medula espinhal de rato usando o CLAREZA combinados e técnicas cúbicos. O método envolve a perfusão de um rato com uma solução de hidrogel e clarificação do tecido com uma combinção de limpar reagentes. tecido da medula espinhal foi liberado em pouco menos de duas semanas, e a coloração de imunofluorescência subsequente contra a serotonina foi concluída em menos de dez dias. Com um microscópio de fluorescência multi-fotão, o tecido foi digitalizado e uma imagem 3D foi reconstruído usando software Osirix.

Introdução

As projeções supraespinhais são responsáveis pela modulação de diversos comportamentos, como a percepção da dor. Uma das projeções com informações nociceptivas contém fibras serotoninérgicas, que se originam da rafe do rombencéfalo e dos núcleos reticulares adjacentes^1,2. Estudos fisiológicos e farmacológicos demonstraram um aumento da liberação de serotonina no corno dorsal da medula espinhal após estimulação elétrica dos núcleos da rafe no rombencéfalo^3-5. No rato e no gambá, as fibras rafespinal serotoninérgicas têm terminais densos, não apenas no corno dorsal^6-8, mas também na zona intermediária^7,9,10, no corno ventral^7,11 e até na lâmina 10^12,13. Não há estudos semelhantes no camundongo. O presente estudo teve como objetivo mapear o padrão de terminação das fibras serotoninérgicas provenientes dos núcleos da rafe do rombencéfalo e seus núcleos reticulares adjacentes na medula espinhal de camundongos utilizando o método CLARITY¹⁴ recentemente publicado e sua modificação - CUBIC¹⁵.

A imuno-histoquímica convencional de fluorescência ou peroxidase da medula espinhal mostra claramente a distribuição das fibras serotoninérgicas na substância cinzenta da medula espinhal em seções transversais de 30-40 μm de espessura. No entanto, essa abordagem não mostra a continuidade dos tratos de fibras serotoninérgicas na substância branca e seus colaterais na substância cinzenta. Embora a reconstrução 3D de cortes histológicos tenha avançado nosso conhecimento sobre tratos de fibras, continua sendo um desafio para histologistas e anatomistas seguir um único trato devido a pequenas distorções no tecido causadas pelo corte. Para contornar esse obstáculo, vários pesquisadores desenvolveram vários protocolos para tornar toda a estrutura do tecido transparente e coletar uma imagem de tecido inalterado em um único arquivo de vídeo^17-21. Até o momento, a técnica de hidrogel tecidual (CLARITY), rígida com troca lipídica, hibridizada em acrilamida, compatível com imagem/imunocoloração, desenvolvida pelo grupo de Deisseroth^14,15, bem como a CUBIC, desenvolvida por Susaki et al¹⁶ são as mais bem-sucedidas. Desde a publicação dos protocolos, muitos pesquisadores começaram a usar essas técnicas para investigar vários aspectos dos tecidos biológicos, incluindo, não apenas o cérebro^22-25, mas também o coração, rins, intestino e pulmões^26,27.

Ao fixar a medula espinhal do camundongo com a solução de hidrogel (CLARITY) e limpar com os reagentes CUBIC (que é um método muito mais rápido do que o descrito pelo protocolo CLARITY original^14,15), um bloco de tecido da medula espinhal de 2-3 mm de comprimento foi removido em duas semanas e a coloração de imunofluorescência para serotonina concluída em oito dias. Com apenas uma combinação de agentes químicos, a imuno-histoquímica convencional pode ser usada para criar uma imagem de tratos de fibras individuais em um arquivo de vídeo 3D em aproximadamente um mês.

Protocolo

Declaração de Ética: Todos os procedimentos envolvendo indivíduos animais siga as orientações do Comitê de Cuidados com Animais e Ética (ACEC) da Universidade de New South Wales (o número ACEC aprovado é de 14 / 94A).

1. Preparação da Transparente cabo do rato Spinal

1. Preparação de Ice Cold Hidrogel Solution
   1. Preparação de solução de paraformaldeído a 16% (PFA)
      1. Adicionar 16 g de paraformaldeído em pó em 70 ml de pré-aquecida de água destilada (50-55 ° C) e agita-se num agitador magnético até aquecida paraformaldeído é dissolvido. Nota: Não permitir que a solução para aquecer acima de 55 ° C e estar ciente de que paraformaldeído é tóxico.
      2. Transferir a solução de paraformaldeído a um cilindro e adicionar água destilada até 100 ml. Arrefece-se a solução de paraformaldeído a 4 utilizando um refrigerador ° C.
   2. Dissolve-se 125 mg de VA-044 iniciador em 26.25 ml de água destilada e arrefece-se a solução em um 4° C frigorífico.
   3. Arrefecer 5 ml de solução de acrilamida (40%), 1,25 ml de solução de bis (2%) (CUIDADO: Bis e soluções de acrilamida são tóxicos, podem causar defeitos genéticos ou cancro), 5 ml de PBS 10X, ml de 16% solução de 12,5 PFA, eo solução de iniciador VA-044 em gelo.
   4. Misturar as soluções acima em gelo.
      Nota: O volume total é 50 ml.
2. Perfusão e Colecção do Cordão do rato Spinal
   1. Anestesiar um rato com uma injecção intraperitoneal de cetamina (80 mg / kg) e xyzaline (5 mg / kg) diluído em 0,9% de solução salina normal. A dosagem para rato pode ser menor do que para os ratos.
   2. Em uma superfície de plástico adequado em um exaustor, corrigir os membros do mouse para longe do corpo (fita adesiva é eficaz) uma vez que o mouse não responder a uma pitada a sua pele do pé.
   3. Cortar a pele do rato sobre o peito e depois do peito osso para expor o coração com uma tesoura.
   4. Usando uma bomba peristáltica, com uma agulha de 25 G ligada a the das extremidades do tubo, inserir a agulha no ventrículo esquerdo do coração, cortar o átrio direito para criar um ponto de saída para o sangue e, em seguida, iniciar a lavagem com 40 ml de solução salina normal a 0,9% de uma taxa de aproximadamente 10 ml / min.
   5. Quando completo, perfundir o mouse com 35 solução de hidrogel frio ml de gelo.
      Nota: perfundir a uma velocidade de 10 ml / min para evitar inchaço do tecido nervoso.
   6. Faça uma incisão na pele sobre a parte de trás com uma lâmina e em seguida, remover os músculos ao lado da vertebrados. Após o corte dos arcos vertebrais de um lado e lançando-os para o outro lado, levar a medula espinal da coluna vertebral com uma tesoura fina.
3. Limpando o cabo do rato Spinal
   1. Coloque a espinal medula em 15 ml de solução de hidrogel durante a noite a 4 ° C.
   2. Retirar 10 mL da solução de hidrogel e despeje o resto da solução com os segmentos da medula espinhal de um tubo de 5 ml. Encher o tubo de 5 ml com a solução de hidrogel até que esteja completamente cheia.
   3. Estende um pequeno pedaço de parafilme sobre a parte superior do tubo de 5 ml e, em seguida, enrolar em torno do pescoço parafilme do tubo. Nota: Certifique-se os contactos parafilme a solução de hidrogel e não há bolhas entre a solução de hidrogel e o parafilme.
   4. Colocar o tubo de 5 ml de uma 37   ° C forno durante a noite. Observe a solução hidrogel até que se torna um gel.
   5. Aqui o tubo de 5 ml de sair do forno e remover o gel a partir do tubo com uma chave de fendas (por exemplo, uma ponta de pipeta de 1 ml pá). Remover o gel do tecido da medula espinhal furando o tecido grosseiro ao gel e em seguida, tomar o tecido grosseiro de distância (o gel vai ficar com o tecido e, portanto, serão removidos pelo tecido).
   6. Após a remoção do gel a partir do tecido da medula espinal, lava-se a medula espinal 4 vezes com 1x de PBS (pH 7,4) durante 24 horas num agitador.
   7. Preparar a solução de compensação CUBIC por dissolução de 3,85 g de ureia e 3,85 g de N, N, N ', N'-tetraquis (2-hidroxipropil) ethylenediamine em 5,38 ml de água destilada.
      Nota: Um agitador quente é usado. Adicionar 2,31 g de polietileno-glicol mono-p-isooctylphenyl éter / Triton X-100 à solução, uma vez que é clara e arrefece até à temperatura ambiente.
      Nota: 10 g destes três produtos químicos são para um rato.
   8. Cortar a medula espinhal de rato coronariamente em longos segmentos de 2-3 mm com uma lâmina de barbear e colocá-los em 5 ml da solução de limpeza CUBIC acima. Colocar num agitador no forno a 37   ° C durante 3 dias.
   9. Três dias mais tarde, mudar a solução de limpeza para uma fresca. Nota: a solução acima é preparada antes da utilização.
   10. Dois a três dias mais tarde depois de atualizar a solução de compensação cúbicos, verificar a transparência do tecido contra um papel com tipo de letra 8 letras. Se é transparente, as letras podem ser vistas através do tecido limpo. Remover a solução de compensação e adicionar 4 ml de PBST (0,1% de Triton-X100) para lavar o tecido 4 vezes por dia (a cada 6 horas).

2. imunofluorescência coloração

1. Incubar os segmentos da medula espinhal na solução de anticorpo primário (anti-serotonina, produzidos em coelho, diluído a 1: 100 em PBST) durante 3 dias num agitador numa estufa de 37 ° C.
2. Remover a solução de anticorpo e adicionar 4 ml de PBST (0,1% de Triton-X100) para lavar os segmentos da medula espinhal 4 vezes por dia (a cada 6 horas) num forno de 37 ° C.
3. Remover a solução de PBST, e adicionar a solução de anticorpo secundário (594 anti-IgG de coelho de cabra conjugada, diluídos 1: 100 em PBST) a incubar o tecido durante 3 dias num agitador numa estufa de 37 ° C.
4. Remover a solução de anticorpo secundário e adicionar 4 ml de PBST para lavar os segmentos da medula espinhal 4 vezes por dia (a cada 6 horas) num agitador num forno de 37 ° C. No dia seguinte, o tecido é preparado para imagiologia.

3. Imagem

1. Remover a solução de PBST e adicionar 4 ml de 85% de glicerol para tornar o índice de refracção do tecido mesmo.
2. Verifique a clareza do tecido. Uma vez que é evidente em aproximadamente 1 hora, colocar o tecido para uma grande lâmina de vidro, fino que se encaixa o quadro realização da multi-foto fluorescente microscópio.
3. Coloque algumas gotas de 85% de glicerol ao lado do tecido da medula espinhal e que lamela de vidro com uma lamela de 22 x 50 mm ^2.
   Nota: A orientação da medula espinhal decide como a imagem se parece.
4. Colocar a lâmina de vidro sobre a armação de retenção do microscópio fluorescente multi-fotão e mover o tecido para a via de luz.
5. Escolha do Hélio Néon linha de laser 594 nm e ajustar a intensidade do laser para o nível óptimo, verificando o brilho do sinal positivo na imagem real.
6. Seleccione a área de leitura do tecido da medula espinal utilizando a objectiva de 20x (em água, NA 0,7) e preparam-se para criar um z-pilha, e a profundidade de cada degrau definir a 3 um.
7. Digitalizar o tecido a partir do topo para o fundo da pilha-Z sob o objec 20Xtiva e, em seguida, objectiva 63X (em óleo, NA 1.4) (tamanho do passo foi de 1? M), respectivamente. Reconstruir vídeos em 3D usando um software 3D ^28.

Resultados

Esta secção mostra os resultados de coloração de anticorpos de serotonina na medula espinal do rato transparente usando uma combinação de a clareza e protocolos cúbico. Mostramos que as fibras serotoninérgicas estão presentes em todas as lâminas da medula espinhal com predominância na porção ventral do corno ventral (Figura 1, também vemos Video 1). O tecido de controlo não têm fibras positivas (resultado não foi apresentado). No corno ventral, fibras se...

Discussão

O protocolo descrito mostra como fibras imagem serotoninérgicos na medula espinhal de rato com a clareza combinadas e técnicas cúbico. Ele apresenta um processo de limpeza mais rápido em comparação com o protocolo de compensação passiva desenvolvido por Cheung et al. ¹⁴ e Tomer et ai. ¹⁵ e permite que o tecido da medula espinal a ser bem suportado pelo hidrogel durante a limpeza.

Um passo importante durante a fixação da medula espinhal de rato, como re...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fotoiniciador VA044	Wako	va-044/225-02111	http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
solução de acrilamida a 40%	Bio Rad	161-0140	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
solução Bis a 2%	Bio Rad	161-0142	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldeído	Sigma	158127	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU
ureia	Merck Millipore	66612	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N',N'-tetrakis (2-hidroxipropil) etilenodiamina	Merck Millipore	821940	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100	Merck Millipore	648462	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sacarose	Sigma	S0389
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU anticorpo de serotonina	Merck Millipore	AB938	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
anti coelho de cabra IgG (H+L) Anticorpo Secundário, Alexa Fluor® 594 conjugado	Life Technologies	A-11012	https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
microscópio multifóton	Leica	Leica TCS SP5 MP STED	http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/