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Síntese de Cd-livre InP / ZnS Quantum Dots Indicado para aplicações biomédicas

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DOI:

10.3791/53684

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6 de fevereiro de 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Missouri State University, 2Center for Molecular Microscopy, Leidos Biomedical Research, Inc., Frederick National Laboratory for Cancer Research

Neste artigo

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Resumo

Neste protocolo, a síntese de pontos quânticos (QDs) InP/ZnS livres de CD é detalhada. Os QDs baseados em InP estão ganhando popularidade devido à toxicidade dos íons Cd2+ que podem ser liberados por meio da degradação de nanopartículas. Após a síntese, os QDs são solubilizados em água usando um polímero anfifílico para uso em aplicações biomédicas.

Resumo

Nanocristais fluorescentes, especificamente pontos quânticos, têm sido uma ferramenta útil para muitas aplicações biomédicas. Para uso bem-sucedido em sistemas biológicos, os pontos quânticos devem ser altamente fluorescentes e pequenos/monodispersos em tamanho. Embora os pontos quânticos à base de cádmio comumente usados possuam essas qualidades, eles são potencialmente tóxicos devido à possível liberação de íons Cd2+ por meio da degradação de nanopartículas. Os pontos quânticos à base de índio, especificamente InP / ZnS, foram recentemente explorados como uma alternativa viável aos pontos quânticos à base de cádmio devido às suas características de fluorescência e tamanho relativamente semelhantes. A síntese apresentada aqui usa técnicas padrão de injeção a quente para o crescimento efetivo de nanopartículas; No entanto, as propriedades das nanopartículas, como tamanho, comprimento de onda de emissão e intensidade de emissão, podem mudar drasticamente devido a pequenas mudanças nas condições de reação. Portanto, as condições de reação, como temperatura, duração da reação e concentração do precursor, devem ser mantidas com precisão para produzir produtos reprodutíveis. Como os pontos quânticos não são inerentemente solúveis em soluções aquosas, eles também devem sofrer modificações na superfície para conferir solubilidade em água. Neste protocolo, um polímero anfifílico é usado para interagir com ligantes hidrofóbicos na superfície do ponto quântico e moléculas de água solvente a granel. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para a síntese de pontos quânticos InP / ZnS altamente fluorescentes que são adequados para uso em aplicações biomédicas.

Introdução

Os pontos quânticos (QDs) são semicondutor nanocristais que exibem propriedades fluorescentes quando irradiado com luz 1. Devido ao seu pequeno tamanho (2-5 nm), que é semelhante a muitas biomoléculas grandes, e facilidade de biofunctionalization, QDs são uma ferramenta extremamente atraente para aplicações biomédicas. Eles têm encontrado utilização na rotulagem biológica, imagem única molécula-célula viva, a entrega de drogas, imagem in vivo, detecção de patógenos e rastreamento de celular, entre muitos outros usos 2-8.

QDs baseada em CD foram mais comumente usados ​​em aplicações biomédicas devido à sua intensa fluorescência e larguras de pico de emissão estreitas 9. No entanto, as preocupações foram levantadas devido ao potencial de toxicidade do Cd 2+ 10 que pode ser introduzida através da degradação das nanopartículas. Recentemente, QDs baseados em InP têm sido explorados como uma alternativa para QDs baseadas em CD porque eles mantêm muitas características de fluorescênciade QDs Cd-baseado e pode ser mais biocompatível 11. QDs baseadas em CD foram encontrados para ser significativamente mais tóxica do que QDs baseados em InP em ensaios in vitro para concentrações tão baixas quanto 10 pM, após apenas 48 h 11.

A cor de emissão de fluorescência de QDs é tamanho-ajustável 1. Isto é, como o tamanho das QD aumenta, a emissão de fluorescência é vermelho-deslocado. O tamanho e dimensão dispersibilidade dos produtos QD pode ser modificada alterando a temperatura, duração da reacção, ou em condições de concentração de precursor durante a reacção 12. Embora o pico de emissão de InP QDs é tipicamente mais ampla e menos intensa do que QDs baseadas em CD, InP QDs pode ser feita numa grande variedade de cores, destinadas a evitar sobreposição espectral, e são suficientemente intensa para a maioria das aplicações biomédicas 12. A síntese detalhada neste protocolo produz QDs com um pico de emissão vermelha centrado em 600 nm.

Várias medidas são tomadas afsíntese ter dos núcleos QD para manter a integridade óptica dos QDs e torná-los compatíveis para aplicações biológicas. A superfície do núcleo QD deve ser protegida contra a oxidação ou defeitos superficiais, que podem causar têmpera; portanto, uma concha ZnS é revestido sobre o núcleo para produzir InP / ZnS (core / shell) qds 13. Este revestimento tem sido demonstrado para proteger o fotoluminescência do produto QD. A presença de iões de zinco, durante a síntese InP QD foi mostrado para limitar os defeitos de superfície, bem como a distribuição do tamanho de redução 12. Mesmo com a presença de Zn2 + no meio de reacção, a síntese de InZnP são altamente improvável 12. Depois do revestimento, resultantes QDs InP / ZnS são revestidos em ligandos hidrofóbicos, tais como o óxido de trioctilfosfina (TOPO) ou oleilamina 12,14. Um polímero anfifílico pode interagir com ligandos hidrófobos na superfície do QD, bem como moléculas de água em massa para conferir solubilidade em água 15. polímeros anfifílicos com carbogrupos químicos xylate pode ser utilizado como "alças" químicas para funcionalizar ainda mais os QDs.

Este protocolo detalha a síntese e funcionalização de solúveis em água InP / ZnS QDs com emissão de fluorescência muito intenso e relativamente pequeno em tamanho dispersity. Estes QDs são potencialmente menos tóxico do que QDs CdSe / ZnS vulgarmente utilizados. Nisto, a síntese de InP / ZnS QDs fornece uma alternativa prática para QDs baseadas em CD para aplicações biomédicas.

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Protocolo

1. Síntese de fosfeto de índio / Zinc Sulfide (INP / ZnS) Quantum Dots

  1. Síntese de fosfeto de índio (InP) Quantum Dot Cores
    1. Caber um fundo redondo de 100 ml, 3-neck, garrafa com um condensador de 12 polegadas. Adicionar 30 ml de oleilamina (OLA), cloreto de 0,398 g de índio (III) (incl 3), (II), cloreto de 0,245 g de zinco (ZnCl2) e agita-se durante a evacuação, à TA utilizando um vácuo durante 1 hora. A solução deve aparecer incolor com um precipitado branco.
    2. Usando uma manta de aquecimento, com um termopar e controlador de temperatura proporcional-integral-derivativo (PID), aumentar a temperatura da solução a 120 ° C. Evacuar a solução sob vácuo durante 20 min para remover as impurezas de baixo ponto de ebulição que podem afectar o crescimento do núcleo.
      Nota: Embora seja possível utilizar um banho de areia e termómetro, usando uma manta de aquecimento e PID aumenta a uniformidade e a reprodutibilidade dos produtos da reacção.
    3. Sob um gás inerte (por exemplo,, N2), refluxo a solução e aumentar a temperatura para 220 ° C durante 15 min. O InCl3 e ZnCl2 dissolver completamente, resultando numa solução amarelo pálida. Permitir que a temperatura estabilize, durante 10 min.
    4. Purgar a, 3 ml seringa de plástico descartável e 4 polegadas, 22 G agulha com gás nitrogênio. Usando a seringa, para entregar rapidamente 0,5 ml de tris (dimetilamino) fosfina (TDMAP) à solução de InCl3. A temperatura da solução diminui ligeiramente e retorna a 220 ° C. A solução muda de transparente, amarelo pálido a opaco, preto.
    5. Após 9,5 min, remover o balão de reacção a partir da manta de aquecimento até que a temperatura diminui abaixo de 200 ° C. Para proteger a integridade dos núcleos de InP, seguir diretamente para a etapa de revestimento de ZnS em 1.2.1.
  2. Síntese de Sulfeto de zinco Conchas (ZnS) quantum dot
    1. Colocar o balão de reacção a partir do passo 1.1.5 em uma manta de aquecimento e estabilizar o temperatura a 200 ° C. Adiciona-se lentamente 3,58 g dodecanotiol (DDT) ao longo de 15 seg para a solução contendo InP QDs. Permitir que a solução reagir durante 1 h.
      Nota: a espessura da casca de ZnS pode ser variado aumentando ou diminuindo a quantidade de estearato de zinco adicionado no passo 1.2.4. Alterando a quantidade de ZnCl2 ou dodecanotiol em passos 1.1.1 e 1.2.1 podem ter impacto significativo na qualidade de QDs alterando a cinética da reacção.
      1. Depois, remover o balão de reacção a partir da manta de aquecimento e deixar a solução arrefecer até cerca de 60 ° C.
    2. Uma vez que a solução de InP / ZnS atinge ~ 60 ° C, adicionar 10 ml de hexanos e transferir toda a solução de cerca de 45 ml para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Centrifugar a amostra (3000 xg durante 10 min) para remover os precursores sólidos que não reagiram.
    3. Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um frasco de 250 ml de centrífuga de polipropileno, adicionar 200 ml de acetona, e a solução de centrífuga (3.000 xg durante 10 min) para precipitar QDs InP / ZnS. Este volume também pode ser dividido uniformemente em quatro tubos de 50 ml para centrifugação se uma centrífuga com as necessárias rotor / acessórios não está disponível. Decantar o sobrenadante e o sedimento secar QD cuidadosamente com azoto gasoso para remover a acetona.
    4. Volte a suspender as QDs em 20 ml OLA usando sonicação, transferir para um fundo redondo de 50 ml, 3-pescoço, frasco contendo 0,474 g estearato de zinco, e mexa. Evacuar a solução sob vácuo durante 20 min à temperatura ambiente.
    5. Sob atmosfera de azoto, aumentar a temperatura para 180 ° C e deixar a reacção prosseguir durante 3 horas. Embora não existam alterações visuais perceptíveis à solução de reacção que ocorrem durante esta reacção, a adição de estearato de zinco aumenta a espessura da casca de ZnS, aumentando, assim, QY, melhorando a passivação de superfície 12. QDs. Uma vez que a reacção está completa, remover o balão da manta de aquecimento e deixar a solução arrefecer até cerca de 60 ° C.
    6. Uma vez que a solução que InP / ZnSno ~ atinge 60 ° C, adicionar 20 ml de hexanos e transferir para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Centrifugar a amostra (3000 xg durante 10 min) para remover o estearato de zinco que não reagiu.
    7. Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um frasco de centrífuga de polipropileno de 250 ml, adicionar 200 ml de acetona, e centrifuga-se a solução (3000 xg durante 10 min) para precipitar InP / ZnS QDs. Cuidadosamente decantar o sobrenadante e completamente seco com azoto gasoso para remover a acetona.
    8. Dissolve-se o sedimento InP / ZnS QD em 30 ml de hexano. Vortex e sonicar a solução rapidamente para assegurar a dispersão completa.
    9. Repita os passos de purificação 1.2.6-1.2.8 mais duas vezes para assegurar a remoção completa do excesso de ligandos orgânicos. As interacções entre o polímero anfifílico e o QD na etapa 1.2 pode ser comprometida, na presença de ligandos em excesso.
    10. Com cálculos detalhado por Xie, et al. 16, determinar o tamanho ea concentração dos QDs InP / ZnS sintetizados usando UV-Vis.
      Nota: A característica espectral importante para esta análise é o ombro do pico de absorção. O valor do comprimento de onda e da absorvância máxima deste ombro é utilizada para calcular o tamanho e a concentração dos QDs, respectivamente. Esta reacção produz tipicamente cerca de 5 umol de QDs com um pico de emissão a 600 nm. Para sintetizar QDs de cores diferentes, a duração e / ou a temperatura da reacção pode ser alterada. Um maior tempo de reacção e / ou temperatura mais elevada dos resultados solução num pico de emissão vermelho-deslocado. Por exemplo, aumentando a temperatura da reacção a 240 ° C e mantendo o tempo de reacção de 10 min irá resultar em QDs com um pico de 680 nm no máximo as emissões. Da mesma forma, reduzindo o tempo de reacção de 2 min e dobrando o cloreto de zinco utilizado irá resultar em QDs com um pico de emissão máxima 470 nm. Estes QDs InP / ZnS são estáveis ​​durante pelo menos um mês a 4 ° C no escuro sob atmosfera de gás inerte.

2. águaSolubilização de InP / ZnS Quantum Dots Usando um polímero anfifílico

  1. A solubilização de água
    1. Usando os QDs InP / ZnS do passo 1.2.10, diluir uma parte dos QDs com hexanos para se obter 1 ml de 1 uM QDs.
      1. Num tubo de centrífuga, transferir 0,25 ml de InP / ZnS QDs em cada tubo. Adicionar 1 ml de acetona ou metanol para o tubo de centrífuga e centrifuga-se (3000 xg durante 10 min). remover cuidadosamente o sobrenadante e dissolve-se cada um precipitado em 1 ml de tetra-hidrofurano (THF).
      2. Transfira os QDs InP / ZnS dissolvidos em THF em um frasco de 100 ml de fundo redondo e diluir com 16 ml THF. Para reduzir o número de agregados em solução, sonicar as QDs durante 5-10 min.
    2. Dissolve-se 30 mg de poli (maleico alt andhydride- -1-octadeceno), 3- (dimetilamino) -1-propilamina (PMAL-d) em 10 ml de água de grau molecular. Banho-maria de ultra-sons ou agitação suave até a solução estar translúcida é suficiente para dissolver completamente o polímero. outilização de vortex ou agitação vigorosa pode produzir muitas bolhas, o que dificulta a interacção do polímero com o QD. Adicionar a solução de polímero de 10 ml para os 100 ml balão de fundo redondo contendo InP / ZnS QDs em THF.
    3. Evapora-se a solução de THF de QD / polímero utilizando um evaporador rotativo. Colocar o balão num banho de gelo enquanto evaporação para facilitar a interacção entre o polímero e QD. Dependendo da força do vácuo, a maioria de THF é evaporado após 10 minutos e a solução aparece turvo.
      1. Uma vez que a solução é evaporada para 10 ml, retirar o balão do evaporador rotativo e adicionar 30 ml de água de grau molecular. Devolver o balão no evaporador rotativo e continuar a evaporar-se a 2 ml. Esta etapa evaporação final pode levar várias horas; assegurar o banho de gelo é mantida.
    4. Remover os QDs InP / ZnS solúveis em água a partir do balão de fundo redondo com uma pipeta. Filtra-se a solução QD utilizando uma seringa de plástico de 3 ml ligado a um SY de nylon de 0,1 umRinge filtrar para um tubo de centrífuga de 5 ml.
    5. Coloque as QDs em uma unidade de diálise de membrana de MWCO 20000 e diálise contra tampão de borato 0,05 M pH 8,5 para remover o excesso de polímero. (Lentamente adicionar tetraborato decahidrato de sódio 0,05 M a 0,05 M de ácido bórico, com agitação vigorosa, até que o pH é de 8,5 a tornar esta solução tampão de borato.) Utilizando um concentrador de vácuo, concentrar os QDs em tampão de borato a 1 ml.
    6. Para o armazenamento, purgar a solução com azoto antes da selagem com Parafilm. Os QDs InP / ZnS solúveis em água são estáveis ​​durante pelo menos 4 meses a 4 ° C no escuro.

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Resultados

Os núcleos de InP não revestidos não demonstram fluorescência visível substancial a olho nu. No entanto, InP / ZnS (core / shell) pontos quânticos parecem apresentam forte fluorescência por olho sob irradiação UV. A fluorescência de InP / ZnS QDs foi caracterizado usando espectroscopia de fluorescência. O espectro de fluorescência de QDs em hexanos (Figura 1) excitado a 533 nm demonstra um pico principal centrado a 600 nm com uma largura total a meia altura (FWHM) de 73 ...

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Discussão

Este protocolo detalha a síntese das altamente fluorescentes QDs InP / ZnS que podem ser utilizados em muitos sistemas biológicos. Os produtos sintetizados QD aqui exibiu um único pico de emissão de fluorescência centrada a 600 nm com um FWHM de 73 nm (Figura 1), que é comparável a outras sínteses descritas anteriormente 12. O tempo de reacção e temperatura da reacção são extremamente passos cruciais, devido ao seu profundo efeito sobre a qualidade de síntese QD e repetibilidade. Após solubil...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem o Departamento de Química e da Faculdade de Pós-Graduação da Universidade Estadual do Missouri para o seu apoio a este projeto. Reconhecemos também o Electron Microscopy Laboratório do Laboratório Nacional Frederick para Pesquisa do Câncer para o uso de seu microscópio eletrônico de transmissão e redes revestidas de carbono.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
OleylaminaAcros129540010
cloreto de zinco (II)Sigma030-003-00-2
Cloreto de índio (III)Chem-Impex24560
Tris (dimetilamino) fosfinaAbranger50-901-10500
1-dodecanetiolAcros117625000
HexanesFisher SciH292-4
AcetonaTransQuímicaUN 1090
Estearato de ZincoAldrich Chem307564-1KG
TetrahidrofuranoAcros34845-0010
Água MolecularFisher SciBP2470-1
Poli (anidrido maleico-alt< / em>-1-tetradeceno), 3- (dimetilamino) -1-propilamina derivadoSigma90771-1G
Ácido bóricoFisher SciBP168-500
Tetraborato de sódio decahidratadoFisher SciBP175-500
Rodamina BAldrich ChemR95-3
Gás nitrogênioAirgasUN1066
Azul tripanoThermo SciSV30084.01
Seringa Luer-lock de plástico de 3 mlBD309657
Luer-lock AgulhaAir-Tite83000144714 polegadas, calibre 22
50 mlFalcon352098
frasco de centrífuga de 250 mlThermo Sci05-562-23Nalgene PPCO
tubos de centrífuga de 5 mlArgos-TechT2076
tubos de microcentrífuga de 1,5 mlBio Plas4150
0,1 μ m Filtro de seringaWhatman6786-1301Puradisc Filtro de nylon de 13 mm
Slide-A-Lyzer MINI Unidade de DiáliseThermo Sci6959020,000 MWCO
Evaporador RotativoHeidolph
Centrifuge 5072Balde Oscilante Eppendorfcom 50  adaptadores de tubo
ml Lambda 650 UV/VIS EspectrômetroPerkin ElmerUV-Vis Espectrômetro
LS 55 Espectrômetro de FluorescênciaPerkin ElmerFluorômetro
Axio Observer.A1Microscópio de epifluorescênciaZeiss
AxioCam MRmZeissCCD
Câmera Tecnai TF20 MicroscópioFEIInstrumento
de espalhamento de luz dinâmicoNanoBrook Omni DLSBrookhaven
câmera NanoBrook do CCDáguia TEM
tubo de centrífuga de polipropileno de da da FEI FEI TEM do elétron do miscroscópio TEM do elétron de Transmisison

Referências

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Errata


Formal Correction: Erratum: Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications
Posted by JoVE Editors on 2/29/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications. There was an error with an author's given name. The author's name was corrected to:

Katye M. Fichter

from:

Kathryn M. Fichter

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