Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e estabelecer culturas primárias de fibroblastos/miofibroblastos (MF) de células gástricas, pequenas intestinais e produtoras de tecido colônico congeladas com fenótipo MF. Essas células expressam CD90, α-SMA e vimentina. Os MFs podem ser usados para uma variedade de ensaios funcionais, incluindo atividade enzimática e produção de citocinas.
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Artigo de método
Isolamento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais Amostras
Neste artigo
Resumo
Resumo
Fibroblastos / miofibroblastos (MFS) têm vindo a ganhar cada vez mais atenção para o seu papel na patogênese e suas contribuições para ambos cicatrização de feridas e promoção do microambiente do tumor. Embora não existam actualmente muitas técnicas para o isolamento de CM (GI) de tecidos gastrointestinais, este protocolo introduz um novo elemento de isolamento destas células estromais de tecido congelado. Congelamento amostras de tecido GI não só permite que o pesquisador para adquirir amostras de colaboradores em todo o mundo, biobancos, e vendedores comerciais, ele também permite o tratamento tardio de amostras frescas. O protocolo descrito consistentemente produzir células fusiformes característicos com o fenótipo MF que expressam os marcadores CD90, α-SMA e vimentina. À medida que estas células são derivadas a partir de amostras de doentes, a utilização de células primárias também confere a vantagem de que imitam de perto MFs de estados de doença, ou seja o cancro e doenças inflamatórias do intestino. Esta técnica tem a abelhan validado em gástrica, intestino delgado e do cólon MF geração cultura primária. MF culturas primárias podem ser utilizados em uma vasta gama de ensaios ao longo de um número de passagem e a sua pureza avaliada por ambos imunocitoquímica e análise de citometria de fluxo.
Introdução
Miofibroblastos / fibroblastos (MFS) representam uma população abundante de células em gastrointestinal (GI) mucosa. Estas células estromais estão localizados logo abaixo do epitélio e formar uma rede interligada dentro da lâmina própria da mucosa no intestino. MFs não são apenas responsáveis pela deposição da matriz extracelular, mas através da regulação parácrina podem influenciar o transporte de electrólito, restituição e a função de barreira do epitélio adjacente 1, 2. Além disso, CM ter sido mostrado desempenhar um papel chave na inflamação e tecidos remodelação 3, 4. Miofibroblastos são uma parte crítica do microambiente do tumor, onde também são conhecidas como fibroblastos associados ao câncer, e contribuir para o crescimento de células tumorais e servir como um nicho de células-tronco do câncer 3. Dados emergentes sugerem que os CM também pode servir como células apresentadoras de antígenos locais. Além disso, a função MFs como reguladores importantes de respostas imune inata e adaptativa, producing uma variedade de citocinas e factores de crescimento 5.
Em indivíduos saudáveis, as células MFS são acreditados para diferenciar a partir de células-tronco mesenquimais e expressam na sua superfície celular, o marcador mesenquimal, CD90 3, 5. Estas células também são positivas para vimentina, mas negativo para epitelial e marcador de células hematopoiéticas, EpCAM e CD45 , respectivamente. Os miofibroblastos são sugeridos como sendo uma forma activada de fibroblastos e podem ser distinguidas a partir de fibroblastos não-activado pela expressão de α-SMA 5.
Ao longo da última década, várias abordagens para o isolamento de miofibroblastos da mucosa do cólon humano foram publicadas-principalmente com base no método originalmente descrito por Mahida et al. 5-8. Enquanto os estudos individuais relatar os procedimentos de isolamento a partir de vários mucosa intestinal, nenhum protocolo universal para o isolamento de CM a partir de várias áreas do tracto GI (por exemplo, úlcera gástrica, pequena e Lmucosa intestinal arge) foi publicada. O protocolo aqui apresentado foi testado e utilizado com êxito para todos os três tipos de tecido acima mencionados. . Além disso, não foram relatados os procedimentos para isolar MFs de mucosa GI congelados.
Aqui, apresenta-se um método aperfeiçoado, que se baseia na digestão enzimática, e ao mesmo tempo permite o isolamento da mucosa do intestino humano MFs para cultura e análise de citometria de fluxo em recém-digeridos, unicelulares, preparações mucosas. Esta técnica produz culturas primárias de forma fiável com um fenótipo MF. Além disso, os mesmos métodos podem ser utilizados para isolar MFs de amostras congeladas de tecidos intestinais gástricas e pequenas bem. Isolamento de miofibroblastos de tecido GI fresco foi previamente descrito; No entanto, a utilização de amostras congeladas apresenta muitas vantagens. Ou seja, os pesquisadores seriam capazes de coletar e armazenar tecidos de qualquer número de colaboradores em todo o mundo que têm a capabilidade para enviar amostras de tecidos congelados. Além disso, os pesquisadores podem encontrar a coleção de tecido descartado da sala de cirurgia e / ou do conjunto de endoscopia e imediato processamento do tecido para o isolamento de conflito com a sua programação experimentação atual. Além disso, devido à natureza imprevisível da cirurgia, recolha de tecidos pode ocorrer muito tarde no dia, o que irá limitar o tempo que resta para o tecido processamento. Congelamento de tecido para posterior processamento irá melhorar esses desafios.
Por fim, estes métodos têm sido utilizados com sucesso no isolamento de miofibroblastos intestinais do cólon, gástrico e pequenas em estados de doença tais como carcinoma colorrectal e doenças inflamatórias do intestino.
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Protocolo
O protocolo para a obtenção de tecidos humanos descartados de pacientes cirúrgicos e o estabelecimento de culturas primárias foi aprovado pela University of Texas Medical Branch e University of New Mexico Institutional Review Boards. Os requisitos gerais para a aquisição de amostras de tecidos humanos é descrito abaixo. Note-se que desde MFs pode ser isolado a partir de tecido congelado, biobanks e vendedores comerciais são também opções.
1. Obtenha Human Tissue
- Enviar um protocolo para obtenção de tecido do cólon humano para o conselho de revisão institucional para aprovação.
- Estabelecer colaborações com cirurgiões gerais e / ou cirurgiões colorretais, a fim de obter tecidos humanos para pesquisa. A colaboração com o departamento de patologia também é obrigatória, já que serão determinação do tecido que não é necessária para o diagnóstico e pode ser designado para a investigação.
- Aconselhar o patologista para fornecer tecido do tumor e, em seguida, Grosslmucosa normal Y, pelo menos, 5 cm do tumor. Coloque imediatamente as amostras em meios de lavagem gelada e colocar no gelo. O patologista irá determinar a quantidade de tecido que pode ser dada de forma segura para a investigação. O tecido mínima necessária para isolamento MF é de 1,5 mm 2.
- Utilizar o tecido obtido quer imediatamente, para estabelecer as culturas primárias ou congelar e entre -80 ° C para futuro isolamento.
- Se congelação para o isolamento posterior, cortar o tecido em cerca de 1 - 2 mm 2 peças, colocar num tubo criogénico com 1 ml de meio de congelamento (ver abaixo), e armazenar a -80 ° C. Nota: Utilizando este protocolo, foi observado o isolamento bem sucedido de CM a partir de tecido congelado por mais de 4 anos.
2. Prepare Reagentes
- Para a solução de colagenase: a preparação de 100 U / ml de colagenase I, II e IV em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) com Ca2 + / Mg2 + (ver Tabela Materiais ). CUIDADO: colagenase concentração unidade activa e pureza pode varia de fabricante para fabricante, o que pode impedir a eficiência da digestão do tecido e / ou preservação do epítopo na superfície da célula da mucosa. Para evitar que esses potenciais armadilhas, use colagenase com alto grau de pureza (≥95%) e preparar a solução estoque com base na concentração unidades ativa.
- Preparar a solução estoque DNase à base de água em 10 mg / ml (3,55 UA / mg).
- Prepare media Wash: (MEM: 89 ml, antibiótico-antimicótico, 100x: 1 ml; FCS inativado pelo calor: 10 ml)
- Prepare crescimento de fibroblastos mídia: MEM: 500 ml garrafa; L-glutamina (200 mM): 5 ml; MEM não essenciais aminoácidos, 100x solução: 5 ml; Ciprofloxacina HCl (10 mg / ml): 570 l; O antibiótico-antimicótico, 100x solução: 10 ml; piruvato de sódio (100 mM): 5 ml; FCS inactivado pelo calor: 50 ml
- Prepare meio de congelamento: meios de crescimento de fibroblastos (Reagente de 2,4) com a adição de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), em seguida, filtrar-sterilize com um filtro de 0,22 um.
Tissue 3. Enzimaticamente Digest Humano
- Se o tecido foi congelado no meio de congelamento, em lugar cryovial (~ 37 ° C) água morna até que o tecido é descongelado e meios de comunicação.
- Para 4 - 5 de 2 mm, 2 peças de tecido, tecido lavar duas vezes com 10 ml de HBSS sem Ca2 + / Mg2 +.
- Uma vez que o tecido tenha resolvido pela gravidade, descartar cuidadosamente o sobrenadante sem fiação amostra.
- Adicionar 10 ml da solução de colagenase para a amostra e transferir a mistura tecido-solução para um tubo de DNase / RNase estéril com built-in rotores para amostra dissociação. Use colagenase a dissociar-se da matriz extracelular que rodeia o aspecto basal das células epiteliais e constitui a fracção não-celular da própria lâmina da mucosa.
- Feche bem tubo e anexá-lo de cabeça para baixo na luva do Dissociator (por exemplo, gentleMACS). Se o laboratório não tem o acesso a tele equipamento acima mencionado, aumentar o tempo de cada passo de digestão para se obter resultados comparáveis.
- Execute o Programa h_tumor_01, um perfil pré-definido fornecido com a máquina (duração total de 36 seg, com pulsos intermitentes que variam de 1.000 - 4.000 rpm, com 268 voltas por corrida).
- Após o término do programa, retire tubo do Dissociator.
- Incubar amostra durante 45 min a 37 ° C sob rotação contínua num agitador a 140 rpm. Nota: Para quantidades variadas de amostras de tecido, o tempo de digestão pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada (isto é, maiores quantidades de tecido pode necessitar de mais tempo).
- Aplica o tubo de cabeça para baixo na luva do Dissociator.
- Escolha e executar o Programa h_tumor_02 (duração total de 37 seg, com pulsos intermitentes que variam de 1.000 - 4.000 rpm, com 235 voltas por corrida).
- Após o término do programa, retire tubo do Dissociator.
- Adicionar 50 ul de solução de ADNase Estoque. Use DNAse dissociar / remover as células mortas e fração de DNA de restos celulares que leva a célula a aglutinação.
- Incubar amostra durante 30 min a 37 ° C sob rotação contínua num agitador a 60 rpm.
- Aplica o tubo de cabeça para baixo na luva do Dissociator novamente.
- Escolha e executar o Programa h_tumor_03 (duração total de 37 seg, com pulsos intermitentes que variam de 1.000 - 4.000 rpm, com 168 voltas por corrida).
Nota: Se o tecido não é completamente digerido, centrifugar a 250 x g durante 10 min a 20 ° C, descartar o sobrenadante, ressuspender em 2 ml de solução de dissociação de células e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. - Passe a suspensão de células através de estéril 70 um filtro de células.
- Centrifuga-se a suspensão de células a 250 x g durante 10 min a 20 ° C. Aspirar o sobrenadante completamente.
- Lavar sedimento celular duas vezes com 25 ml de HBSS sem Ca2 + / Mg2 + e desprezar o sobrenadante.
- Antes da última erah, a contagem do número de células usando um sistema de contagem de células automatizado disponível no laboratório ou manualmente usando hemocitômetro. Para MF geração cultura primária prosseguir para a etapa 3.19.1, para a análise ou classificação da MFS por citometria de fluxo prosseguir para a etapa 3.19.2.
- Para o isolamento e o crescimento da cultura MF puro (Figura 1), descartar o sobrenadante da última centrifugação, sedimento de células ressuspender em a quantidade apropriada de meios de isolamento de fibroblastos necessária para semear até 4 x 10 6 células em 3 ml do meio por poço em 6 pratos bem, tratados com cultura de células. Prossiga para a etapa 3.20.
- Para a análise ou classificação da MFS por citometria de fluxo, coloque até 2 x 10 6 em 2 ml de meios de isolamento de fibroblastos em 24 poços, placa baixa de ligação e incubar O / N a 37 ° C com 5% de CO 2. Isto é para restaurar os epítopos de superfície celular que podem ser afectadas pelo processo enzimático. Em seguida, recolher suspensão de células e contagem de células recuperado e prossigapara a imunocoloração e citometria de fluxo análise 8.
- Crescer as células a 37 ° C com 5% de CO 2. Mudar meios cada 2 - 3 dias até formação de ~ 80% confluentes MF monocamada (Figura 1D-E).
- Células passagem em frascos T25 com placa de 6 poços, com a relação 1: 1 e crescer durante ~ 10 - 14 dias em meio de crescimento de fibroblasto para atingir 80 - 100% de confluência.
- Expandir cultura por passagem de células de T25 a T75 com células proporção de 1: 2. Uma vez que as células atingem a confluência, utilizar um frasco para análise de pureza MF isolado utilizando por citometria de fluxo como descrito anteriormente 5. Congelar ou passagem outro frasco T75 da cultura MF na proporção de 1: 3.
Nota: Quando analisados por citometria de fluxo, espera-se que GI mucosa estromal MF de origem mesenquimal, quando crescendo em cultura terão seguinte fenótipo: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentina +, α-SMA +, CD90 +.
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Resultados
Usando este protocolo digestão enzimática, que têm sido consistentemente capaz de isolar e cultivar células CD90 + do estroma da mucosa intestinal de MF população GI espécimes cirúrgicos e de biópsias (Figura 1). Visível MF proliferação de colónias pode ser observado no dia 2 - 5 após a sementeira de células mononucleares em suspensões placas de 6 cavidades (Figura 1A-B). As culturas primárias MF chegar ~ 50-70% de confluência por dia 7-11
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Discussão
Embora este protocolo foi desenvolvido para a aplicação de investigação única, à luz da cada vez maior importância crítica de células estromais como um cancro de biomarcadores potenciais prognósticos e alvo terapêutico, a capacidade de congelar biospecimens "funcionais" para uso posterior oferece uma vantagem significativa. Isto representa uma vantagem única para a criação de biorrepositório clínico, que pode servir como ferramentas adicionais servindo para fazer avançar o desenvolvimento da medicina personali...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) e pelo Instituto de Ciências Translacionais da University of Texas Medical Branch, e um Prêmio de Ciências Clínicas e Translacionais (8UL1TR000071).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Solução salina balanceada de Hanks | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Piruvato de sódio | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiótico-antimicótico, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacina HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamina, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Aminoácidos não essenciais | Corning | 25-025-CI | |
| Dimetil Sulfóxido (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Solução de DL-Ditiotreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Colagenase de Clostridium histolyticum, Tipo I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Colgenase de Clostridium histolyticum, Tipo II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Colgenase de Clostridium histolyticum, Tipo IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Solução de dissociação celular Accumax | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubos | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Contador de Células Automatizado Countess | Invitrogen | C10227 | |
| Filtro de Células (70 µ m) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actina, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
Referências
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Reimpressões e permissões
