Artigo de método

Iniciando A diferenciação em células multipotentes imortalizadas Otic progenitoras

DOI:

10.3791/53692

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2 de janeiro de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Os protocolos atuais para manter células progenitoras óticas multipotentes imortalizadas (iMOP) e diferenciação ótica são descritos. As condições de cultura e os marcadores moleculares que indicam diferenciação em epitélio sensorial e neurônios ganglionares espirais (SGN) são destacados.

Resumo

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O uso de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) ou células-tronco embrionárias (ESC) para terapias de reposição celular é uma grande promessa. Várias limitações, incluindo baixos rendimentos e populações heterogêneas de células diferenciadas, dificultam o progresso das terapias com células-tronco. Uma linhagem celular de progenitor ótico multipotente imortalizado restrito ao destino (iMOP) foi gerada para facilitar a diferenciação eficiente de um grande número de células ciliadas funcionais e neurônios do gânglio espiral (SGN) para terapias de substituição de células do ouvido interno. A partir de culturas dissociadas de células iMOP únicas, foram descritos protocolos que promovem a saída e diferenciação do ciclo celular pela retirada do fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF). Uma diminuição significativa nas células em proliferação após a retirada do bFGF foi confirmada usando um ensaio de proliferação de células EdU. Concomitante com uma diminuição na proliferação, a diferenciação bem-sucedida resultou na expressão de marcadores moleculares e alterações morfológicas. A imunomarcação de Cdkn1b (p27KIP) e Cdh1 (E-caderina) em otosferas derivadas de iMOP foi usada como um indicador de diferenciação em epitélio sensorial da orelha interna, enquanto a imunomarcação de Cdkn1b e Tubb3 (β-tubulina neuronal) foi usada para identificar neurônios derivados de iMOP. O uso de células iMOP fornece uma ferramenta importante para entender as decisões de destino celular tomadas por progenitores neurossensoriais do ouvido interno e ajudará a desenvolver protocolos para gerar um grande número de células ciliadas derivadas de iPSC ou ESC e SGNs. Esses métodos acelerarão os esforços para gerar células óticas para terapias de reposição.

Introdução

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Os órgãos do ouvido interno, cóclea, utrículo, sáculo e três canais semicirculares, medeiam a capacidade de ouvir e equilibrar. Dentro da cóclea, as células ciliadas convertem sons em sinais elétricos que são retransmitidos para os neurônios do gânglio espiral (SGN). Os SGNs disparam potenciais de ação para propagar sinais neurais através do circuito auditivo. Mutações genéticas, drogas ototóxicas e exposição a sons altos contribuem para a morte das células ciliadas e do NSG que resultam em perda auditiva1-4. Uma vez perdidas, essas células não são substituídas. O uso de iPSC e ESC para gerar células ciliadas nascentes ou SGNs é uma grande promessa para terapias de reposição de células da orelha interna5-8. Uma enxurrada de progresso mostrou que células-tronco pluripotentes e progenitores derivados do ouvido interno podem se diferenciar em células ciliadas e SGNs em vários estágios de maturidade. Células-tronco embrionárias de mamíferos (ESC) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) podem ser usadas para gerar células ciliadas funcionais e SGNs9-11. Células-tronco e células progenitoras derivadas do ouvido interno de mamíferos também demonstraram formar células ciliadas e neurônios com propriedades de suas contrapartes celulares in vivo 12-16.

O uso de progenitores óticos derivados de iPSC ou ESC para substituir células ciliadas perdidas e SGNs requer diferenciação eficiente. A diferenciação inadequada ou a proliferação contínua de progenitores derivados do caule enxertados na orelha interna podem exacerbar a função da orelha interna e representar um risco tumorigênico, como a formação de teratomas na orelha interna17. Há uma clara necessidade de desenvolver condições de cultura e entender a diferenciação de progenitores óticos. Uma estratégia no desenvolvimento desses métodos é recapitular as decisões de destino celular tomadas por progenitores neurossensoriais durante o desenvolvimento do ouvido interno. Protocolos que previnem a proliferação e direcionam progenitores óticos para as células ciliadas ou SGNs ajudarão a melhorar a segurança e a eficácia das terapias de reposição.

Durante o desenvolvimento, o ouvido interno começa com o espessamento do ectoderma superficial em uma região restrita entre os rombomeros 5 e 6 para se tornar o placódio ótico. À medida que o placódio ótico invagina para formar uma taça ótica, uma coleção de células na região anterior da taça ótica dá origem ao domínio neural-sensorial-competente (NSD), que contém precursores de células ciliadas e neurônios da orelha interna18. Estudos de mapeamento de destino de camundongos, galinhas e peixes-zebra desenvolvendo o ouvido interno sugerem múltiplas populações de progenitores neurossensoriais que dão origem às células ciliadas sensoriais, ao redor das células de suporte e neurônios óticos19-22. O fator de transcrição do grupo de alta mobilidade, Sox2, tem sido implicado na especificação de células sensoriais e usado como marcador para progenitores da orelha interna23,24. Mutações hipomórficas que diminuem os níveis de expressão de Sox2 na orelha interna resultam na perda das células ciliadas, células de sustentação e SGNs na cóclea25,26.

Para estudar células progenitoras óticas submetidas a decisões de destino celular, uma linhagem celular de progenitor ótico multipotente imortalizado restrito ao destino (iMOP) de progenitores cocleares que expressam Sox2 foi previamente estabelecida. As células iMOP foram originalmente derivadas da cóclea embrionária E12.5-13.5 e infectadas com um retrovírus c-Myc27. As células iMOP podem proliferar continuamente como células formadoras de colônias conhecidas como otosferas e têm a capacidade de se diferenciar em células ciliadas, células de suporte e SGNs27. Compreender a capacidade das células iMOP de se diferenciar em linhagens óticas distintas permite a aplicação desses achados para gerar eficientemente células ciliadas derivadas de iPSC ou ESC e SGNs. Protocolos de diferenciação eficientes abrirão novos caminhos para terapias de substituição celular de doenças do ouvido interno que são recalcitrantes aos tratamentos convencionais. Uma questão crucial na geração de células óticas por cultura de células in vitro é ter marcadores de diferenciação que ajudem a determinar se as células estão passando por diferenciação. Cdkn1b (p27KIP) tem sido amplamente utilizado como um marcador precoce para diferenciação no desenvolvimento da orelha interna, no entanto, a expressão de Cdkn1b em células iMOP e como ela se correlaciona com a diferenciação não foi abordada. Neste estudo, são descritas as condições atuais da cultura e como a expressão de Cdkn1b se correlaciona com outros marcadores de diferenciação de iMOP.

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Protocolo

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1. Manter a auto-renovação em células IMOP

  1. Prepare IMOP meios de cultura: DMEM / F12, suplemento B27 1X, 25 ug / ml e carbenecillin 20 ng / ml de bFGF. Adicione 50 ml de meio de cultura IMOP utilizando reagentes estéreis. Aquecer-se 49 ml de DMEM / F12 numa cónico de 50 ml num banho de água a 37 C °.
    1. Descongelar 50X suplemento B27 e 100 mg / ml carbenecillin alíquotas, esterilizadas por filtração para 5 min num banho de água a 37 ° C. Descongelar a 100 ug / ml de bFGF aliquota à TA. Adicionar 1 ml de 50X B27, 10 ul de 100 ug / ml de bFGF e 12,5 uL de 100 mg / ml em DMEM carbenecillin / F12.
  2. Use 3 ml de mídia em uma placa de 60 mm de cultura de tecidos para as células de cultura IMOP. Adicionar meio fresco às culturas a cada dois dias, dobrando o volume de mídia. Certifique-se de que a concentração de bFGF não cai abaixo de 5 ng / ml.
    1. IMOP células de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2. Células Passage após 5 - 7 dias em cultura como listadas nas etapas abaixo. Transferência de cultura até uma 15ml cônico com uma ponta de pipeta 10 ml.
  3. Adicione 1 mM de EDTA em HBSS por diluição de 0,1 ml de EDTA 0,5 M pH 8,0 em 50 ml de HBSS. Pré-quente EDTA 1 mM feita em HBSS em um banho de água a 37 ° C.
  4. Células colheita por sedimentação gravidade ou centrifugação a 200 xg durante 5 minutos. à TA. Por sedimentação por gravidade, colocar o cónico de 15 ml contendo as culturas no incubador a 37 ° C durante 5 - 10 min. Após esse tempo, observar os otospheres se acumulem na parte inferior da cónico de 15 ml.
    NOTA: força centrífuga excessivo pode causar danos às células.
  5. Cuidadosamente aspirado gasto de mídia usando uma pipeta 2 ml de aspiração sem perturbar o sedimento celular. Adicionar 0,5 ml de solução de pré-aquecido a 1 mM EDTA HBSS para a célula sedimento. Com uma pipeta P1000, pipetar suavemente para cima e para baixo 2 - 3 vezes. Coloque cónica a 37 ° C e incubar durante <5 minutos para facilitar a dissociação em células individuais.
  6. Agite suavemente a solução de células para determinar se otospheres são dissociados. Se nenhum otoesferas sedimentem no fundo do cone, as células são dissociadas. O tempo de incubação pode variar.
    NOTA: prolongada incubação com EDTA pode resultar em morte excessiva de células.
  7. Remover as células a partir de 37 ° C, adiciona-se 2 ml de meio para neutralizar e diluir o EDTA. Recolher as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar diluída EDTA usando uma pipeta 2 ml de aspiração e adicionar 5 ml de 1X PBS para lavar as células.
  8. Girar para baixo as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar para fora 1X PBS utilizando uma pipeta de 2 ml de aspiração. Ressuspender as células utilizando uma pipeta P1000 em 0,5 ml de meio de cultura IMOP cuidado pipetando para cima e para baixo 2 - 3 vezes.
  9. Contagem de células utilizando um contador de partículas microfluídico com as fitas apropriadas 28. Uma placa confluente de células IMOP conterá ~ 6 X10 6 células. Dilui-se as células de 1: 100 em meio e adicionar 75 ul de uma solução de células para a cassete para contagem. Placa 1 x 10 6 células em um prato de seis centímetros no IMOP culture meios (~ 1: 10 de diluição). IMOPs passagem a cada 5 - 7 dias.
    NOTA: As células que formam grandes otospheres ou se ligam à parte inferior do prato de cultura de tecidos irá diferenciar. As células também vão morrer se as culturas são mais confluentes.

2. congelamento e descongelamento IMOP Cells

  1. Preparar o meio de congelamento e descongelamento sintética por equilibrar a solução a 4 ° C antes de serem células de congelação.
  2. Recolher as células a partir de um disco de 6 cm confluente de células IMOP. Usar uma pipeta de 10 mL e de transferência de células (~ 6 - 8 x 10 6 células) num cónico de 15 ml.
  3. Células colheita por sedimentação por gravidade ou centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Se os otospheres são pequenas, as células não vai resolver por gravidade sedimentação. Opcional: Contagem de células usando passo 1,9 para determinar o número de células totais.
  4. Aspirar gasto de mídia usando uma pipeta 2 ml aspiração, deixando o sedimento de células solto para trás.
  5. Adicionar 0,25 ml de meio de congelamento sintéticos para voltar a suspender ceLLS a uma densidade de 5 x 10 ~ 5 a 3 x 10 6 células / ml. Pipeta suavemente as células com uma pipeta P1000. Transferir a suspensão de células para frascos criogénicos usando uma pipeta P1000 com 1 ml filtrados ponta.
  6. Colocar os tubos em um recipiente de congelamento de álcool livre e colocar o recipiente de congelação a -80 ° C para reduzir a temperatura de 1 ° C por minuto até a temperatura atingir -80 ° C.
  7. Para armazenamento a longo prazo de células, transferir os tubos de ensaio para a fase de vapor de um tanque de armazenamento de azoto líquido. Para descongelar células para a cultura, equilibrar criotubo contendo as células congelados a -80 ° C.
  8. Pré-quente meios de cultura IMOP em um banho de água a 37 ° C.
  9. Descongelar o frasco congelado rapidamente por agitação na parte inferior do frasco num banho de água a 37 ° C. Adicionar 1 mL de meios de cultura pré-aquecido a IMOP células descongeladas uma vez que o último cristal de gelo desaparece. Transferência de células para a 15 ml cônico e adicionar um adicional de 4 ml de meio de cultura IMOP
  10. Gire a 15 ml conica durante 5 min. a 200 xg e aspirar o meio gasto. Ressuspender as células em 2 ml de meio de cultura de células e IMOP placa num prato de 6 cm. Incubar as culturas a 37 ° C com 5% de CO 2 para a expansão.

3. diferenciação de células IMOP em Sensorial Epithelia

  1. Prepare 50 ml de IMOP media diferenciação epitélio sensorial: DMEM / F12, suplemento 1X B27, 25 ug / ml carbenecillin. Faça 50 ml de IMOP sensorial media diferenciação do epitélio. Aquecer-se 49 ml de DMEM / F12 numa cónico de 50 ml num banho de água a 37 C °. Descongelar 50X suplemento B27 e 100 mg / ml carbenecillin alíquotas para 5 min. num banho de água a 37 ° C. Adicionar 1 ml de 50X B27 e 12,5 uL de 100 mg / ml em DMEM carbenecillin / F12.
  2. Para a colheita, se dissociam, ressuspender e contagem de células repetir os passos 1,4-1,9
  3. Placa 1 X 10 6 células num prato de 6 cm no dia -3 IMOP utilizando meios de cultura. No Dia 0, as culturas de transferência utilizando uma pipeta de 10 ml para uma cónico de 15 ml. Recolher o otoesferas por gravidade sedimentação como indicado na etapa 1.6. Aspirar gasto de mídia usando uma pipeta 2 ml de aspiração e deixar as otospheres na parte inferior do cone.
  4. Delicadamente adicionar em 2 ml de diferenciação do epitélio sensorial mídia. Transferência otospheres para um prato de 6 cm, usando um grande furo pipeta de 10 mL.
    NOTA: corte mecânica de pipetagem dura pode dissociar as células dos otospheres.
  5. Adicionar 2 ml de meios sensoriais diferenciação epitelial fresco às culturas a cada dois dias. Se necessário, as células podem ser coletadas por sedimentação gravidade e mídia substituído.
  6. Recolha otospheres no dia 10, transferindo para a 15 ml cônico e permitindo que os otospheres para sedimentar como indicado na etapa 1.6.Aspirate os meios gastos usando uma pipeta 2 ml de aspiração e deixar as otospheres imperturbável.
  7. Fix otospheres por incubação em 4% de formaldeído em PBS 1X durante 15 min à TA. Remover solução de formaldeído, lavar otospheres com tampão de lavagem (1X PBS contendo 0,1% de Triton X-100) antes da incubação num tampão de bloqueio (1X PBS contendo 10% de soro normal de cabra e 0,1% de Triton X-100) durante 1 h.
    1. Substituir tampão e incubar as amostras em tampão de bloqueio com anticorpo diluído. Incubar a 4 ° C. Lavar as amostras com 1X PBS contendo 0,1% de Triton X-100 sujeita a otosphere para imunocoloração 27. Transferência otospheres em 1X PBS e colocar otospheres em meio de montagem numa lâmina de vidro usando uma pipeta P1000. Coloque uma lamela sobre a amostra e permitir a montagem de meios para secar a 4 ° C.
  8. Adquirir imagens de epifluorescência, utilizando uma configuração de microscópio invertido equipado com uma câmera CCD de 16 bits e quer um ar 20X 0,75 ou um NA objetivo de imersão em óleo de 40X 1.3. Recolha de fluorescência de diferentes canais de cores usando a comprimentos de onda listado (excitação e emissão): azul (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), verde (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), vermelho (562 ± 20nm / e 625 ± 20 nm) e infravermelhos (628 ± 20nm / e 692 ± 20nm).

4. Assaying EdU Incorporação

  1. No Dia -3, placa 1 x 10 6 células IMOP em um disco de 6 cm. Três dias mais tarde, no dia 0, colheita, dissociar, ressuspender e contar as células, repetindo os passos 1,4-1,9.
  2. Placa de 2,5 x 10 5 células em meio de cultura e IMOP 5 x10 5 células em diferenciação epitélio sensorial meios diferentes em poços de uma placa de 6 poços.
  3. Determinar a percentagem de células em fase S por EdU incorporação no dia 3 utilizando um ensaio de incorporação de EdU
    1. Adicionar estoque EdU directamente às culturas IMOP para se obter uma concentração final de 1 uM EdU no meio de cultura.
    2. Incubar EdU em culturas IMOP durante 2 horas e incubar a 37 ° C com 5% de CO 2. Colheita, dissociam e coletar células repetir os passos 1,4-1,9. Adicionar em 4% de formaldeído em PBS 1X durante 15 min. à TA para fixar as células. Células colheita por centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remoção da solução de formaldeído e properly dispor.
    3. Núcleos do rótulo de células com Hoechst e incorporada EdU com verde fluorescente dye-azida de acordo com o protocolo do fabricante.
      NOTA: Todas as lavagens são feitas com 1X PBS, BSA a 3% e 0,1% de células Tween 20. Lavar com 1X PBS duas vezes.
    4. Células de montagem em um slide usando antifade reagente e coloque um copo 1,5 tampa sobre a amostra. Adquirir imagens fluorescentes de células marcadas utilizando um microscópio de epifluorescência.

5. Diferenciar neurônios derivados-IMOP

  1. Adicione 50 ml de meio de diferenciação neuronal: meios Neurobasal, 1X suplemento B27, 2 mM de L-Glutamina. Descongelar garrafa de 50X B27 e 200 mM de L-glutamina em 37 ° C num banho de água durante 5 min. Adicionar 1 ml de 50X B27 e 0,5 ml de 200 mM de L-glutamina, para 48,5 ml de meio neurobasal.
  2. Brasão lamela, colocando 12 mm redondas 1,5 lamelas de vidro em um estéril placa de 10 cm e adicionar 70% EtOH a placa para esterilizar e limpar as lamelas.
  3. Agite suavemente a enseadarslips para garantir que eles estão cobertos de etanol. Deixar a placa durante 10 minutos à TA. Lavar as lamelas 3 vezes com estéril 1X PBS para lavar o etanol remanescente. Lavar as lamelas uma vez com H 2 0 estéril para lavar restante 1X PBS.
  4. Aspirar o H 2 0 usando a 2 ml de aspiração pipeta e deixar as lamelas seco. Expor as lamelas a luz UV na capa de tecido de cultura durante 15 min. Loja lamelas em um ambiente estéril se não for usado imediatamente.
  5. Coloque uma lamela 12 milímetros rodada em cada poço de um prato de 24 poços. Agitar placa suavemente para assegurar que as lamelas ficar na posição horizontal na parte inferior do poço.
  6. Descongelar 2 mg / ml de poli-D-lisina da solução à TA e diluir para uma concentração de 10 ug de poli-D-lisina / ml em 1X PBS. Adicionar 0,25 ml de 10 ug / ml de poli-D-lisina para os poços. Deixar a placa na incubadora a 37 ° C durante 1 h.
  7. Lavar os poços 3 vezes com PBS estéril 1X. Descongelar / solução de estoque de 10 mg mL laminina à RT e dilui-se a 10 ug / ml em PBS 1X. Adicionar 0,25 ml de 10 ug / ml de laminina solução de trabalho em um único poço de uma 24 multi-poços prato. Incubar a placa a 37 ° C incubadora. Aspirar a solução laminina utilizando uma pipeta de 2 ml de aspiração.
  8. Lava-se a lamela 3 vezes com PBS 1X, adicionando em 1 ml de PBS 1X com uma pipeta P1000 e remover o PBS 1X por aspiração com uma pipeta de 2 ml de aspiração. Deixar 1X PBS a partir última lavagem no poço até que as células estão prontas a ser revestida. Iniciado diferenciação neuronal pela colheita, dissociando e contagem de células em passos 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 células em um prato de seis centímetros no Dia -3.
  9. No Dia 0, colheita, dissociar e contar as células repetindo 1,4-1,9. Semente de 1 x 10 5 - 1,5 x 10 5 células em 0,5 ml IMOP media diferenciação neuronal pré-aquecido por cavidade em um 24 multi-poços prato. Aspirar e adicionar meios diferenciação neuronal pré-aquecido para culturas em dias alternados.
  10. Corrigir neurônios IMOP derivados em formaldeído 4% por 15 min. umat RT no dia 7. Remover solução de formaldeído, lavar neurónios IMOP derivados com tampão de lavagem (1X PBS contendo 0,1% Triton X-100) antes da incubação num tampão de bloqueio (1X PBS contendo 10% de soro normal de cabra e 0,1% de Triton X-100) durante 1 h.
    1. Substituir tampão e incubar as amostras em tampão de bloqueio com anticorpo diluído. Incubar a 4 ° C. Lavar as amostras com PBS 1X contendo 0,1% de Triton X-100 As células sujeitas a imunocoloração 27. Lavar a lamela com 1X PBS, antes de colocar em suportes de montagem. Permitir que os meios de montagem para secar a 4 ° C antes de adquirir imagens de epifluorescência como listado no passo 3.8.

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Resultados

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bFGF retirada diminui a proliferação em células IMOP

Para diminuir a capacidade proliferativa de células IMOP e iniciar a diferenciação de células IMOP, bFGF foi retirado das culturas. Para confirmar que o fator de crescimento retirada diminui a proliferação, EdU incorporação foi empregado como um ensaio de proliferação. Foi comparada com a percentagem de células que incorporaram EdU de otospheres cultivadas c...

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Discussão

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Monitoramento culturas IMOP

Um protocolo para a manutenção de auto-renovação e promover a diferenciação de uma linhagem celular IMOP romance é descrito e formatos chapeamento adicionais são incluídos (Tabela 1). Vários passos críticos que ajudam com a expansão e diferenciação de células IMOP rotina são anotados. Semelhante a culturas de células estaminais pluripotentes, células IMOP tem, teoricamente, um tempo de vida indeterminado. Para garantir que as linh...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O trabalho foi apoiado em parte pelo Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) e Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CoolCell LX Recipientes de Congelamento de Células Sem ÁlcoolFrascos Criogênicos BioCisionBCS-405
(2 ml) Corning430654
1.5 Espessura de lamínula de vidro (Redondo 12 mm)Ciências de Microscopia Eletrônica72230-01
DMEM/F12Life Technologies11320-082
Neurobasal MediumLife Technologies21103
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7.4Life Technologies10010-023
Hank's Solução Salina Balanceada (HBSS)Life Technologies14025-092
Suplemento B27 (50X) Serum FreeLife Technologies17504-044Armazenado como alíquotas de 1 ml
L-Glutamina(200 mM) Life Technologies25030-081Armazenado como alíquotas de 5 ml
Laminina de Rato NaturalLife Technologies23017-015Armazenado como alíquotas de 1 mg/ml
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Life TechnologiesC10337
Synth-A-Freeze Mídia de CriopreservaçãoLife TechnologiesA12542-01
Prolong Gold Antifade MountantLife Technologies47743-736Armazenado como 10 mg/ml 100 µ l alíquotas
Moxi Z Mini Contador de Células AutomatizadoOrflo MXZ001
Moxi Z Tipo SOrflo MXC002
Fator de crescimento de fibroblastos murinos recombinantes, básico (bFGF)Peprotech450-33ressuspenso em 0,1% BSA em H20 e armazenado como alíquotas de 20 mg / ml
Poly-D-LysineSigmaP7886ressuspenso em 1X PBS e armazenado como 10 mg / ml 100 µ l alíquotas
Carbenicilina, Sal DissódicoThermo Fisher ScientificBP2648-1Ressuspensa em Hepes de 10 mM pH 7.4 e armazenada como alíquotas de 100 mg/ml
Pipeta de 5 ml embalada individualmente em brochura (200/caixa)Thermo Fisher Scientific1367811D
10 ml pipeta embalada individualmente brochura (200/caixa)Thermo Fisher Scientific1367811E
Placa de 24 Poços Biolite Tratada para Cultura de TecidosThermo Fisher Scientific130188
Placa de 6 Poços Biolite Tratada com Cultura de TecidosThermo FisherScientific 130184 
Prato de 6 cm para Cultura de TecidosThermo Fisher Scientific130181 
Filtro estéril da seringa PVDF de EMD Millipore Millex Tamanho do poro: 0,22 μ mThermo Fisher ScientificSLGV033RS
TipOne pontas de pipeta de filtro 0.1 - 10 μ l ponta de filtro alongadaUSA Scientific1120-3810
TipOne pontas de pipeta de filtro 1 - 20 μ l ponta de filtroUSA Scientific1120-1810
TipOne pontas de pipeta de filtro 1 - 200 μ l  ponta de filtroUSA Scientific1120-8810
Pontas de pipeta de filtro TipOne 101 - 1000 μ l ponta de filtroUSA Scientific1126-7810
tubos cônicos de 15 ml estéreis 20 sacos de 25 tubos (500 tubos)USA Scientific1475-0511
tubos cônicos de 50 ml estéreis 20 sacos de 25 tubos (500 tubos)USA Scientific1500-1211

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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