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Artigo de método

Administrando e Detecção de Marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de Pesquisa

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DOI:

10.3791/53693

⸱

28 de janeiro de 2016

 , 
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

Neste artigo

Resumo

As proteínas são frequentemente usadas para marcar artrópodes para pesquisa de dispersão. Métodos para administrar marcas de proteínas internas e externas em artrópodes são demonstrados. Técnicas de detecção de marcas de proteínas, por meio de ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs) indiretos ou sanduíche, também são ilustradas.

Resumo

Monitoramento movimento artrópode é muitas vezes necessária para entender melhor a dinâmica da população, associados padrões de dispersão, preferências de planta hospedeira, e outras interações ecológicas. Artrópodes são geralmente acompanhados na natureza por marcá-los com uma marca única e, em seguida, re-coleta-los ao longo do tempo e espaço para determinar as suas capacidades de dispersão. Além de marcas físicas reais, tais como pó de cor ou tinta, vários tipos de proteínas têm se mostrado muito eficaz para a marcação de artrópodes para a investigação ecológica. As proteínas podem ser administrados internamente e / ou externamente. As proteínas podem então ser detectados em artrópodes recapturados com um enzyme-linked immunosorbent assay específico para a proteína (ELISA). Aqui nós descrevemos protocolos para marcação externa e internamente artrópodes com a proteína. Dois exemplos experimentais simples são demonstradas: (1) uma proteína de marca interna introduzida para um insecto, proporcionando uma dieta enriquecida em proteína e (2) uma marca de proteína externa um topicamentepplied para um insecto usando um nebulizador médico. Nós, então, relacionar um guia passo-a-passo do sanduíche e métodos indiretos de ELISA utilizados para detectar marcas de proteína sobre os insetos. Nesta demonstração, são discutidos vários aspectos da aquisição e detecção de marcadores de proteína em artrópodes para marca-release-recaptura, captura-marcação, e os tipos de auto de captura de marca-de investigação, juntamente com as várias maneiras que o procedimento imunomarcação tem sido adaptado para atender a uma ampla variedade de objectivos de investigação.

Introdução

Acompanhando o movimento de pragas de artrópodes, inimigos naturais (parasitóides e predadores), e polinizadores na natureza é essencial para compreender melhor como para melhorar os serviços ecossistêmicos. O componente-chave para a maioria dos tipos de pesquisa dispersão é ter um método confiável para marcar o artrópode (s) de interesse. Uma variedade de materiais (por exemplo, tintas, corantes, pós coloridos, tags, elementos raros, proteínas) têm sido utilizados para marcar os artrópodes para avaliar sua dinâmica populacional, capacidades de dispersão, alimentando comportamentos, e outras interações ecológicas 1,2.

A adequação de um marcador utilizado para qualquer dada pesquisa dispersão será dependente do tipo de estudo a ser conduzido. Há três grandes categorizações para a marcação artrópodes: (1) marca-release-recaptura (MRR), captura de marcação (2), e auto de captura-marcação-(3). Para a pesquisa marca de liberação e recaptura, o investigador normalmente marca os artrópodes coletivamente no laboratóry e libera-los em um ponto central no campo. Os artrópodes são então recapturado em vários intervalos espaciais e temporais, utilizando diferentes dispositivos de captação (por exemplo, rede de varredura, de vácuo, armadilha pegajosa) 3,4,5. Os espécimes recapturados são examinados para a marca específica para distinguir liberado de indivíduos nativos. Para a pesquisa de captura-marcação, o investigador geralmente se aplica a marca diretamente no campo usando equipamento de pulverização (por exemplo, pulverizador costal, lança e bico pulverizador). Os melhores marcadores para pesquisa captura-marcação são baratos e de fácil aplicação para o habitat do artrópode. Para a pesquisa de auto-captura marcação, o investigador geralmente se aplica a marcas de um artrópode bait 6,7 ou 8 ninho entrada. Por sua vez, o artrópode própria marca internamente por devorar a isca marcada ou externamente por "escovar" contra a marca à medida que sai do ninho.

Como mencionado acima, muitos tipos de marcadores têm sido nósed para marcar uma variedade de espécies de artrópodes. No entanto, muito poucos são úteis para todos os três destas categorias de investigação de dispersão. O desenvolvimento do processo de imunomarcação de proteínas foi um grande avanço para a marcação de insetos. Imunomarcação de proteínas coloca um rótulo em artrópodes interna ou externamente, que, por sua vez, é detectado através de um ensaio anti-proteína específica imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Os primeiros marcadores de proteínas utilizadas foram tais imunoglobulina de coelho (IgG) e IgG de galinha / IgY 9,10. Eles provaram ser muito eficazes para marcas MRR e pesquisa de auto-captura marcação (ver discussão). Infelizmente, as proteínas IgG / IgY são caros e não são, portanto, prático para a investigação captura-marcação ea maioria dos tipos de pesquisa de auto-captura marcação. Subsequentemente, os testes ELISA de detecção de proteína de segunda geração foram desenvolvidos para proteínas contidas na clara do ovo de galinha (albumina), leite de vaca (caseína) e leite de soja (inibidor de tripsina de proteína). Cada ensaio é altamente sensível, específico, e, maisimportante, utiliza proteínas que são muito menos caros do que as proteínas de IgG / 11 IgY. Estas proteínas têm se mostrado eficazes para MRR, captura-marcação e pesquisa de auto-captura marcação (ver discussão).

Neste artigo, nós descrevemos e demonstrar como conduzir marca proteína estudos de retenção de laboratório. Tais estudos são a primeira fase da pesquisa necessária para qualquer tipo de estudo de campo de dispersão. Especificamente, é fundamental que os investigadores sabem quanto tempo a marca será mantida nas espécies de artrópodes segmentados antes de embarcar em estudos de dispersão de campo. Aqui, descrevemos e demonstrar como interna e externamente marcar insetos para MRR, captura-marcação e estudos tipo de campo auto-captura marca. Nós, então, demonstrar como detectar a presença das marcas com ELISAs indiretos e de sanduíche.

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Protocolo

1. Mark Interno, retenção e procedimento de detecção

  1. Procedimento de marcação interna
    1. Coletar insetos de interesse (n ≈ 100 indivíduos) de uma colônia de laboratório criados em dieta artificial ou a partir do campo e dividir em dois recipientes de criação limpas.
    2. Colocar 20 ml de uma dieta regular de pacotes (tratamento de controlo negativo não marcado) para um dos recipientes. Completar um segundo pacote de 20 ml de dieta artificial com 1,0 ml de uma solução / 1,0 mg ml IgG frango / IgY, misture bem, e colocá-lo em outro recipiente.
      Nota: Se o inseto de interesse não tem uma dieta artificial, a marca pode ser colocado sobre ou em qualquer dieta que eles são normalmente sustentada em (por exemplo, feijão verde, ovos da traça, água, açúcar, mel).
    3. Permitir que os insetos para retomar sua atividade alimentar durante 24 h.
  2. Procedimento de retenção de marca Interno
    1. Remova os pacotes de dieta de cada recipiente e fornecer os insetos wom outra fonte de alimento para mantê-las ao longo da duração da experiência (por exemplo, feijão verde).
    2. Recolha uma coorte (n = 20) de insectos por dia (ou em qualquer intervalo de tempo desejado) a partir de cada tratamento e congelar imediatamente a -20 ° C.
  3. Sanduíche procedimento ELISA
    1. Adicionar 50 ul de anticorpo de coelho anti-galinha IgY anticorpo primário diluído 1: 500 em tampão salino Tris (TBS) a cada poço de uma microplaca de ELISA limpo e incubar durante um mínimo de 1 hora à TA (nota: as microplacas também podem ser incubadas ó / N a 4 ° C).
    2. Descartar o anticorpo a partir da placa e bloquear cada cavidade com 300 uL de uma solução não gorda de leite seco a 1,0% durante 30 min.
    3. Enquanto espera para as etapas de incubação anteriores, colocar insetos congelados individualmente em 1,6 mL tubos de microcentrífuga com 1,0 ml de TBS.
    4. Moer cada insecto com um pilão limpa até completamente homogeneizada e adicionar 100 ul de cada amostra para um poço individual do ELISAprato. Deixar as amostras a incubar à TA durante 1 h.
    5. Adicionar 100 ul de negativo (TBS apenas) e positivos (clara de ovo em TBS) a poços de controlo na primeira coluna de cada placa de ELISA. Além disso, adicionar 100 ul de controlos negativos (insectos insectos não marcado) para os 8 poços na última coluna de cada placa (Figura 1). Permitir que as amostras de controlo a incubar à TA durante 1 h. Note-se que o molde fornecido na Figura 1 é o modelo que usamos para os nossos ensaios padronizados. A colocação das amostras nos poços é a critério do investigador.
    6. Lavar cada poço três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e em seguida, adicionar Tween 50 ul de anticorpo de coelho anti-IgG de galinha / IgY conjugado com peroxidase diluído a 1: 10000 em solução de leite a 1% e incubar durante 1 h à TA.
    7. Lavar cada poço três vezes com PBS-Tween e adicionar 50 ul de tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço.
    8. Após 10 min, ler os poçoscom um espectrofotómetro de microplacas fixado a um comprimento de onda de 650 nm.

figure-protocol-1
Figura 1. Um diagrama esquemático que mostra as designações bem padronizados usados ​​para um típico de 96 cavidades de microplacas ELISA. Cada placa contém 7 poços dedicados a controlos negativos de solução salina tamponada com Tris (TBS), uma bem dedicados a um controlo positivo proteína (Pos Ctrl), 80 poços individuais dedicados a insetos recapturados (Amostra 1 ... 80), e 8 poços dedicados a não marcados (negativos) controles de insetos (Ctrl Neg 1 ... 8). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Mark Externo, Retenção, e procedimento de detecção

  1. Procedimento de marcação externo
    1. Coletar insetos de interesse (n ≈ 100indivíduos) de uma colônia de laboratório ou de campo e local em dois recipientes de plástico 1,0 L com um buraco de diâmetro 2,5 centímetros socou para fora do lado de cada recipiente.
    2. Pulverizar os insectos no primeiro recipiente com 1,0 ml de dH 2 O (tratamento de controlo negativo), utilizando um nebulizador médico. Pulverizar os insectos no segundo recipiente com 1,0 ml de uma solução 5.0% de clara de ovo de galinha utilizando um nebulizador médico.
    3. Prenda a mangueira do nebulizador a uma tomada de ar do laboratório padrão e, em seguida, inserir a boca do nebulizador para o 2,5 centímetros buraco do recipiente. Em seguida, ligue a saída de ar gradualmente até o nebulizador produz um vapor.
    4. Continue a pulverização (marcação) até a solução clara de ovo foi dispensado (aprox. 2-5 min).
    5. Remover o nebulizador e colocar uma rolha no orifício do recipiente de plástico. Permitir que os insetos para se situar em temperatura ambiente, até a solução secar completamente.
  2. Procedimento de retenção de marca externa
    1. Coloque cada tratamento dos insetos secos em um recipiente limpo criação separado para evitar mais exposição para a marca.
    2. Adicionar água e comida para os recipientes limpos para sustentar os insectos ao longo da duração do estudo.
    3. Recolha uma coorte (n = 20) de insectos a partir de cada tratamento diariamente e congelar imediatamente a -20 ° C.
  3. Procedimento ELISA indireto
    1. Coloque os insetos congelados individualmente em 1,6 mL tubos de microcentrífuga e adicionar 1,0 ml de TBS.
    2. Mergulhe as amostras para 1 hora em um conjunto agitador orbital a 120 rpm.
    3. Adicionar controlos negativos e positivos, tal como descrito no Passo 1.3.5.
    4. Após a imersão, pipetar uma aliquota de 100 ul de cada amostra para um dos 80 poços de amostra designado numa nova placa de 96 poços de ELISA tal como mostrado na Figura 1 Permitir que as amostras a incubar durante 1 hr à temperatura ambiente. (Nota: as microplacas também pode ser incubadas O / N a 4 ° C).
    5. Lavar os poços três vezes comPBS-Tween e depois adicionar 300 ul de solução salina tamponada com fosfato contendo 1% de albumina de soro bovino (PBS-BSA) a cada poço.
    6. Após 30 min à TA, lavar duas vezes com PBS-Tween.
    7. Adicionar 50 ul de anticorpo de coelho anti-albumina de ovo anticorpo primário diluído 1: 8000 em PBS-BSA-Silwet (0,05%) a cada poço e incubar durante 1 h à TA.
    8. Lavar cada poço três vezes com PBS-Tween e em seguida adicionar 50 uL de IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano diluído a 1: 2000 em PBS-BSA-Silwet (0,05%) durante 1 h à TA.
    9. Lavar cada poço três vezes com PBS-Tween e adicionar 50 ul de substrato TMB a cada poço.
    10. Após 10 min, ler os poços com um espectrofotómetro de microplacas fixado a um comprimento de onda de 650 nm.

Análise 3. Dados

  1. Calcular o valor da absorvância média dos insectos 8 de controlo negativo em cada placa de ELISA e, em seguida, calcular o desvio padrão com base nos controlos negativos reunidas from todas as placas de ELISA de um dado estudo 12.
  2. Adicionar seis vezes o desvio padrão combinado para a média obtida para cada placa de ELISA para se obter um valor limite positivo de ELISA. Qualquer amostra de insectos originando um valor de absorvância igual a ou maior do que este valor é considerado positivo para a presença da marca proteína.

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Resultados

Marcação interna:

Os resultados do teste de retenção marca interna são mostrados na Figura 2A. O ELISA valor limiar crítico calculada foi 0,054. No geral (todos os quatro tempos do estudo combinado), os insectos tratados sem proteína originou consistentemente valores baixos de ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Por outro lado, todos os insectos alimentados com a dieta...

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Discussão

O procedimento de imunomarcação de proteínas artrópode foi descrita pela primeira vez quase um quarto de século atrás 9. Desde então, o procedimento foi adaptado para estudar os padrões de dispersão de uma ampla variedade de artrópodes, usando administrados internamente e externamente de IgG / IgYs. Estas proteínas têm provado marcadores firmes para a grande variedade de espécies de insectos testadas até à data. No entanto, como mencionado acima, a principal limitação para a utilização de IgG / IgYs é que ele...

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Divulgações

A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é somente para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo Departamento de Agricultura dos EUA. O USDA é um fornecedor de oportunidades iguais e empregador.

Agradecimentos

O financiamento foi fornecido pelo USDA CRIS 5347-22620-021-00D e, em parte, pela Agricultura e Alimentação Research Initiative Competitive Grant não. 2011-67009-30141 do Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura USDA. Somos gratos pelo apoio técnico de Johanna Nassif. Agradecemos também a Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, e Frances Sivakoff por fornecer algumas das imagens utilizadas na Figura 3.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Recipiente de armazenamento de alimentos (para criação de insetos)Rubbermaid / TupperwareVários tamanhosVários fabricantes e fornecedores. O tecido de malha é colado em uma janela
Nebulizador de pequeno volume (Micro Mist)Teleflex-Hudson RCI1881Disponível online e em lojas de suprimentos médicos. Outras marcas também funcionarão.
Tubos de microcentrífuga, 1.6 ml com tampaProdutos de Laboratório Continental4445.XQualquer tipo semelhante funcionará. Preferimos marcas que tenham tampas fáceis de abrir.
Caixa de armazenamento de isopor para tubos de microcentrífuga (grade 5x20)RPI Corp.145746Este design é bom porque não sobrecarrega os tubos.
Dispensador, repetidorEppendorf4982000322Qualquer coisa semelhante ajudará a acelerar a dispensação.
Pilões, moedores de lenços descartáveis de plástico, 1,5 mlKimble Chase749521-1500Disponível com vários fornecedores. Os pilões podem ser limpos e autoclavados para reutilização.
Placas BD Falcon ELISA, 96 poços (fundo plano)Pipeta BD351172
Ovation, manual (20-200 µ l)VistaLab1057-0200 ou 1070-0200Qualquer tipo semelhante funcionará. Este modelo é ergonômico.
Reservatórios, reagente estérilVistaLab4054-1000Qualquer coisa semelhante funcionará.
Pipeta eletrônica, 8 canais (50-1.200 µ l) (Biohit eLine)Sartorius730391Se você tivesse que escolher um modelo eletrônico, esse tamanho é mais útil.
Pipeta eletrônica, 8 canais (10-300 µ l) (Biohit eLine)Sartorius730361Qualquer coisa semelhante funcionará.
Arruela de placa múltipla (8 posições, reta)Sigma-AldrichZ369802 Qualquer coisa semelhante funcionará para a lavagem manual de pratos.
Leitor de microplacas com detecção de absorbânciaMolecular DevicesSpectraMax 250Qualquer coisa semelhante funcionará.
Frango IgG/IgYEstados Unidos BiológicoI1903-15RTambém disponível de outras fontes
Claras de ovoMercearia" Todos os brancos", " Batedores de ovos", etc.Misture 5 ml com 95 ml de dH2O para solução a 5%
Tris (Trizma Base)Sigma-AldrichT15032.42 g/L para fazer TBS
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma-AldrichS988829.22 g/L para fazer TBS e 8.0  g⁠/⁠ L para PBS
Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)Sigma-AldrichS08761,14 g/L para PBS
Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)Sigma-AldrichP56550,2 g/L para PBS
Cloreto de potássio (KCl)Sigma-AldrichP95410,2 g/L para PBS
Tween 20, Grau EIASigma-AldrichP1379Adicionar 0,5 ml por L ao PBS após a dissolução dos sais.
PBS com 1% BSASigma-AldrichP3688Misture 1 pacote em 1 L dH2O
Anti-Frango IgY (IgG) (molécula inteira) anticorpo produzido em coelho (1:500)Sigma-AldrichC6409Mix 100 µ l em 50 ml de Leite
Pó, Leite em Pó ou Fresco (1%)MerceariaMisture 10 g com 1 L dH2O para solução a 1%
Anticorpo Anti-Frango IgY (IgG) (molécula inteira)-Peroxidase produzido em coelho (1:10.000)Sigma-AldrichA9046Mix 100 µ l em 1 L de leite a 1%
Anti-Ovo de Galinha Albumina anticorpo produzido em coelho (1:8,000)Sigma-AldrichC6534Dilute 125 µ l em 1 L PBS-BSA
Conjugado de Peroxidase IgG Anti-Coelho de Cabra (1:2,000)Sigma-AldrichA6154Diluir 0,5 ml em 1 L PBS-BSA, depois adicionar 1,3  ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) copolímero de silício-poliéterLehle SeedsVIS-01Adicionar como último ingrediente
TMB Microwell One Component Peroxidase SubstrateSurModicsTMBW-1000-01
em

Referências

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