Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em Arabidopsis Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Summary

A celulose cristalina é um constituinte importante da parede celular da planta. No entanto, sua quantificação em uma resolução celular é tecnicamente desafiadora. Aqui, relatamos o uso de tecnologia de luz polarizada e seções de choque radicular para obter informações da composição da parede celular em uma resolução espaço-temporal.

Abstract

As células vegetais são circundadas por uma parede celular, cuja composição determina seu tamanho e forma finais. A parede celular é composta por uma matriz complexa contendo polissacarídeos que incluem microfibrilas de celulose que formam estruturas cristalinas e cadeias de celulose de organização amorfa. A orientação das fibras de celulose e suas concentrações ditam as propriedades mecânicas da célula. Vários métodos são usados para determinar os níveis de celulose cristalina, cada um trazendo vantagens e limitações. Alguns podem distinguir a proporção de regiões cristalinas dentro da celulose total. No entanto, eles são limitados a análises de órgãos inteiros que são deficientes em informações espaço-temporais. Outros que dependem de imagens ao vivo são limitados pelo uso de corantes imprecisos. Aqui, relatamos um sistema sensível baseado em luz polarizada para quantificação específica do retardamento relativo à luz, representando o acúmulo de celulose cristalina em seções transversais de raízes de Arabidopsis thaliana. Nesse método, a resolução celular e os dados anatômicos são mantidos, permitindo comparações diretas entre os diferentes tecidos que compõem a raiz em crescimento. Essa abordagem abre uma nova dimensão analítica, lançando luz sobre a ligação entre a composição da parede celular, o comportamento celular e o crescimento de órgãos inteiros.

Introduction

A parede de célula de planta é uma estrutura dinâmica. células em crescimento são cercadas por uma parede celular primária, cuja organização permite que as células a se expandir. As células que param de crescer depósito de uma parede secundário mais rígido que reforça o suporte mecânico da planta. Ambas as paredes celulares são compostas de microfibrilas de celulose embebidas numa matriz de polissacáridos de estruturas diferentes (por exemplo, hemicelulose e pectina) que variam entre o estágio de desenvolvimento diferentes e tecidos ^1,2. A celulose é sintetizada na forma de cadeias de (1,4) -β-D-glucano que são fortemente alinhados para formar a micro fibrilas de uma estrutura cristalina. celulose amorfa refere-se às regiões onde as cadeias de glucano são menos ordenada. A relação entre o cristalino e os domínios amorfos é um parâmetro pensado para afectar as propriedades mecânicas da parede da célula, fornecendo resistência mecânica e característica viscoelástica, respectivamente ^3. Vários métodos têm sidodesenvolvidas para detectar e quantificar as duas formas de arranjo de celulose, entre eles de difracção de raios-X e polarização cruzada / ângulo mágico girando RMN de estado sólido ^4. Difracção de raios-X pode ser utilizada para determinar a proporção de cristalino contra domínios celulose amorfa na amostra ^5. Um método alternativo usa fraccionamento de parede celular conteúdo em material insolúvel em ácido e solúvel em ácido, para distinguir entre a cristalina e a celulose amorfa, ou outros polímeros, respectivamente. Nesta abordagem, a incorporação de glicose marcada ^([14 C] glucose) é utilizada para quantificar a ^6,7 de celulose. Estes métodos necessitam de grandes volumes de material de planta para análises de órgãos inteiros, na melhor das hipóteses, e, portanto, são inadequadamente sensível à variação específica do tecido na estrutura da parede celular. A visualização das microfibrilas de celulose com uma resolução celular pode ser obtida em estudos de imagem ao vivo combinados com corantes fluorescentes ^8,9, que podem identificar mudanças naa orientação das microfibrilas de celulose. No entanto, estes corantes não são utilizados para quantificação, eles não são específicos de celulose cristalina e pode interferir com a estrutura normal da parede celular ^8. Polscope é uma técnica de imagiologia que se baseia na capacidade de celulose cristalina para dividir os feixes de luz e retardar a parte da luz ^10. retardo de luz é mais forte para as microfibrilas que se situam perpendicularmente à direcção da propagação da luz. Para microfibrilas com orientação semelhante, quanto maior o grau de cristalinidade, quanto maior for o retardamento de luz ^11. Assim, polscope é utilizado para estudar ambos os níveis relativos e orientação das microfibrilas de celulose.

Raízes exibem crescimento linear, durante o qual as células originárias no nicho de células-tronco, na ponta da raiz, são submetidos a uma série de divisões celulares, antes de se expandir rapidamente ^12. As células compreendendo a raiz expandir numa unidireccional (anisotrópica)forma, como ditado por pequenos hormônios molécula de sinalização que impactam as propriedades da parede celular ^13. Respostas diferenciadas aos hormônios, no tempo e no espaço, fornecer um meio de garantir o crescimento de órgãos equilibrada ^14. Assim, a análise de alta resolução da estrutura da parede celular podem fornecer informações importantes necessários para melhor compreender a relação entre as respostas específicas do tipo de células para crescimento de órgão inteiro. Aqui, nós relatamos a implementação de polscope para estudar a acumulação específica de tecido de celulose cristalina em raízes de Arabidopsis, como observado em seções anatômicas alta qualidade. Este método recentemente descoberto de acumulação específico do tipo de célula de celulose cristalina, em resposta à perturbação espacial da actividade hormonal ^15.

Protocol

1. Crescimento de Plantas

1. Superfície esterilizar as sementes.
   1. Esterilizar sementes (até 30 mg) por via húmida ou seca. Como um exemplo, para o método de esterilização a seco, adicionar 1 ml de HCl glacial a 37% em 50 ml de lixívia, num copo de vidro em um exsicador fechado durante pelo menos 4 horas e até durante a noite. Execute esta etapa em uma capa química.
2. Espalhe as sementes estéreis em placas com agar vegetal 0,8% em 0,5x Murashige e Skoog (MS). Enrole placas com Parafilm ou fita porosa e cobrir com folha de alumínio.
3. Armazenar as placas a 4 ° C durante 1 - 4 dias para promover a germinação uniforme.
4. Transferir as placas para uma câmara de crescimento adequado para o cultivo de plântulas de Arabidopsis. Colocar as placas verticalmente para manter o crescimento da raiz na parte superior do meio de agar e para evitar a penetração.
5. mudas de transferência para fixador 7 dias após a germinação (DAG).

2. Fixação

1. Preparar 50 ml de Richardson Solution através da combinação de volumes iguais de 1% bórax (agente de buffer), 1% de azul de metileno e 1% Azure (corantes histológicos) em água destilada duas vezes. Filtrar através de uma seringa Impulsionada 0,22 PVDF Filtro Unidade antes do uso.
2. Prepare 50 ml de fixador: 1,25% de glutaraldeído em 0,05 M de sódio cacodilato (agente tampão).
   Nota: Estes materiais são tóxicos e devem ser manuseados em uma capa química.
3. Adicionar 100 uL de solução de Richardson (ver 2.1) para a solução de fixação (ver 2.2) para se obter a solução final fixação.
4. Mark cada poço de uma placa de 6 poços com o nome da amostra correspondente.
5. Coloque 2 - 3 ml de solução final de fixação (ver 2.3) nas cavidades, de modo que as mudas, uma vez transferidos, serão totalmente cobertos em líquido.
6. transferir cuidadosamente, usando uma pinça, até 10 mudas para cada poço. Selar as placas usando Parafilm. Armazenar a 4 ° C, no escuro, durante pelo menos uma noite, e até uma semana.

3. desidratação

1. Desidratar mudas. Transferi-los entre poços de novas placas de 6 poços, contendo concentrações crescentes de etanol, como listados a seguir: 10% de etanol durante 15 min; Etanol a 30% durante 15 min; Etanol a 50% durante 15 min; Etanol a 70% durante 15 min; 85% de etanol durante 15 min; Etanol a 95% durante 15 min; 95% de etanol a 4 ° C, durante a noite, no mínimo. Lidar com mudas, segurando-os cuidadosamente por seus cotilédones, de preferência com uma pinça de plástico.

4. Infiltração

1. Prepare meio de infiltração. Misture o conteúdo de um saco do ativador kit historesina com 50 ml kit líquido resina básica em uma pequena garrafa de vidro. Mexa com ímã para 20 min. forma de infiltração pode ser mantida a 4 ° C durante algumas semanas.
2. Mark cada poço de uma nova placa de 6 poços com o nome da amostra correspondente e encher com 2 - 3 ml de meio de infiltração.
3. Transferir as mudas de solução de etanol a 95% ao meio de infiltração com a pinça. Certifique-se de que as mudas são fully coberto pelo meio.
4. Armazenar a 4 ° C durante pelo menos 4 dias, para assegurar o máximo de penetração nos tecidos da planta.

5. Preparação do bloco

1. Coloque etiquetas pequenas, lápis-marcados com nome da amostra, dentro de cada poço de incorporação de moldes.
2. Prepare a incorporação meio pela adição de 1 ml de endurecedor para 15 ml de meio de infiltração (ver 4.1). Não tente para preparar um volume menor do que 15 mL, para evitar problemas de polimerização.
3. Encha metade de cada cavidade no molde com 200 ul de meio de fixação e cobrir com uma peça de película de sobrecarga cortadas com a forma do molde, mas a um tamanho de um milímetro maior em cada lado. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas, para permitir que a polimerização. Não exceda 5 horas.
4. Preparar um lote adicional de incorporação de forma (ver 5.2) e manter em gelo, para evitar a polimerização durante a pontas de raiz são dispostos no molde.
5. Corte cada ponta da raiz sob um escopo de dissecação usando bisturi e posicionar i com muito cuidadot: verticalmente para seções transversais ou horizontalmente para o corte longitudinal, em cerca de 2-3 mm da periferia do molde. Encha o molde completamente com a solução e cobertura de bloqueio com um filme em cima. Note-se que a solução de bloqueamento vai encolher ligeiramente, uma vez que é polimerizada.
6. Mantenha a temperatura ambiente durante 2 horas, no mínimo.
7. Para secar os blocos, coloque em uma caixa com gel de sílica seca e deixar à temperatura ambiente durante a noite, no mínimo.

6. Seccionamento

1. Prepare facas de vidro de bastões de vidro com uma máquina de faca. Use as facas de vidro para o seccionamento de tecidos. Corte o bastão de vidro em um quadrado e depois cortar o quadrado na diagonal para produzir duas facas, usando uma ferramenta de pontuação diamante.
2. O bloqueio em 2 - 3 uM fatias de largura, utilizando uma máquina de corte. Coloque as fatias sobre uma lâmina de vidro, em cima de gotas de água destilada e coloque o slide em um bloco de aquecimento definido para fogo baixo (50 - 60 ° C), até que a água evapora.

7. Deslize Preparação para Polarizada Microscópio

1. Diluir solução Richardson (ver 2.1) a 0,2% da solução original e utilizar 1 ml de ele para cobrir as fatias. Coloque no bloco de calor durante 5 segundos e depois lave com água destilada.
2. Seque o slide em uma placa quente. Observar sob um escopo de dissecação e marcar a parte de trás da lâmina com um marcador, para indicar a posição das fatias de interesse, para facilitar a sua identificação mais tarde sob o microscópio.
3. Adicione 100 ml de meio de montagem e cobrir com uma lamela.

8. Aquisição de Imagem

1. Colocar a lâmina coberta contendo as secções de raiz com um microscópio óptico equipado com sistema Polscope adequado para se obter informação retardância e um filtro polarizador / interferência óptica (Figura 1 dC).
2. Escolha de ampliação que permite a visualização clara de toda a amostra (por exemplo, 40X neste estudo) e concentrar a microscope em um campo vazio que contém seção do bloco, mas nenhuma raiz seção. Tente encontrar uma região limpa, sem manchas. Utilizar esta região para definir o fundo.
3. Defina o sistema de imagem e parâmetros de software: Definir intervalo para 17 nm. Aplicar "Exposição Automática" e obter uma imagem de fundo do campo vazio (ver 8.2). Uma imagem de fundo é usado por experimento.

9. Análise Polscope de Celulose microfibrila Orientação

1. Análise de secções longitudinais.
   1. Coloque uma lâmina contendo secções longitudinais sob o microscópio e obter uma imagem de retardamento que. Concentre-se o microscópio em uma seção de raiz de interesse. Fornecer um novo nome de arquivo.
   2. Capturar uma imagem abriu (imagem com informações retardo) através da janela "Viva abriu". Certifique-se de capturar uma secção que inclui a parede celular, que pode ser identificado por a celulose corada correndo ao longo da periferia da célula, tal como mostrado na Figura 2C.
2. análise de imagem.
   1. Dê um duplo clique sobre a imagem relevante na pilha de imagens. Selecione "color Orientação Pseudo" na guia "Configurações de vídeo".
   2. Para estimar o ângulo de microfibrilas de celulose, combinar com a cor correspondente da parede da célula para que, na roda de cores.
      NOTA: A roda de cores na Figura 2C reflecte o eixo lento da luz encontra-se ao longo da microfibrilas que indica a direcção ao longo do eixo das microfibrilas. O ângulo de microfibrilas de celulose é o ângulo indicado pela cor e o eixo longitudinal da célula. Por exemplo, a célula de alongamento na inserção mostra a cor ciano, inclinado por cerca de 90 ° em relação ao eixo longitudinal das células.
   3. Para quantificar o ângulo médio microfibrilas na parede celular, use a ferramenta "retardance e Azimute Stamp" a partir da barra de ferramentas do software. Ao selecionar a ferramenta, aponte e clique sobre a região de interesse na imagem obtida.
      NOTA: Este will resultado no visor dos ângulos (azimute) em graus (Figura 2C).
   4. Em um acesso aberto na luz software análise alternativa polarizada, almoço "Pol-Analyzer" plug-in a partir do menu plugin. Na nova janela aberta, selecione a guia "Birefringence" e aberto e, em seguida, salve o arquivo de fundo e o arquivo de imagem.
   5. Na janela de imagem, selecione "Specs". e ajustar o "tamanho do pixel ROI '(use 5 pixels para este estudo). No "Specs". janela, selecione "Mostrar valores na tabela de resultados".
   6. Use a ferramenta Polígono para marcar a região de interesse na janela de imagem. Seleccionar "Linhas de orientação" para obter a orientação da microfibrilas de celulose.
      Nota: Isto irá resultar na exibição dos ângulos (azimute) em graus.
      NOTA: O ângulo médio calculado por um dos dois métodos deve ser em seguida normalizada para o posicionamento da secção de raiz ao longo da corrediça. Para corrigir desvio dao posicionamento horizontal de toda a secção de raiz ao longo da corrediça, quantificar o ângulo médio de micro fibrilas da parede celular que flanqueia a célula ao longo do seu eixo longitudinal (isto é, perpendicular à secção e ao longo do eixo de crescimento da raiz, a Figura 2C). Este ângulo é de 180 ° quando a seção de raiz é posicionada com precisão ao longo do slide. Para calcular o ângulo de microfibrilas, subtrair o ângulo microfibrila média medida da parede celular de flanco de 180 °. Adicionar a diferença resultou ao ângulo de microfibrilas médio medido da parede da célula que se encontra plana sobre a lâmina.

10. Análise de Polscope Celulose cristalina Acumulação

1. Use as seções transversais (transversais). Note que a acumulação de celulose cristalina só pode ser comparada entre as células quando as microfibrilas de celulose, são alinhados em um ângulo semelhante (tal como determinado em 9).
2. Dê um duplo clique sobre a imagem relevante na pilha de imagens. Selecione "Pseudo cor "no guia" Configurações de vídeo ".
3. Para medir retardance. Zoom-in na imagem. Selecione "Região" e marque todas as regiões de interesse. Mover para a guia "medidas" e "Copiar para área de transferência" todos os valores.
   1. Transferir os dados para o Excel e extrair informações necessárias (região de retardance dizer). Normalizar os dados.
      NOTA: Para explicar as diferenças de espessura entre fatias, expressar os valores relativos a uma borda da parede celular específico no slide. Para normalizar, dividir o retardância à média correspondente à parede da célula de interesse pela retardância média de uma parede celular diferente na mesma imagem. Por exemplo, a parede exterior da célula epidérmica foi normalizada para o interior da parede celular cortical no nosso estudo.
4. Repita as medições durante pelo menos 3 secções por raiz, com um mínimo de 3 raízes por amostra.

Results

Nós estudamos os efeitos de respostas específicas do tipo de células para brassinosteróides (BRS), usando a raiz de Arabidopsis como um modelo de órgão ^15-17. Quando o receptor de BRI1 BR é orientada, no fundo do mutante BRI1, para um subconjunto de células epidérmicas, chamadas de células não-capilares (Figura 2A, B), que inibe a expansão das células unidireccional de células vizinhas, e todo o crescimento da raiz ^15. Polscope aná...

Discussion

Aqui, apresentamos um método para determinação do acúmulo de celulose cristalina em diferentes tecidos que compõem as raízes de Arabidopsis, mantendo informações anatômicas. Como tal, ela fornece uma etapa adicional para a compreensão de processos de crescimento em plantas com uma resolução celular. Este método pode também ser aplicado para o estudo de espécies de plantas adicionais e órgãos.

Um número de pontos devem ser considerados quando se aplica o método. Em primeiro lugar, a ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog (MS)	Duchefa	M0221
Borax	LOBA CHEMIE	6038
Azul de Metileno	Sigma	M-9140
Azure	Sigma	861065
Acionado por Seringa Filtro PVDF de 0,22 mm	MILLEX-GV
Glutaraldeído	EMS	16220
Cacodilato de Sódio	Sigma	C-0250
Kit Leica historesina	Leica	7022 18 500
moldes de incorporação	Agar Scientific	AGG3530
filme 100 µ P.P.C.			filme aéreo
Knivemaker	LKB	7800
Ultratome III	LKB	8800	Ultratome
Shandon imumount	Microscópio	média de montagem	em 9990402
	térmica Nikon	Eclipse 80i
Sistema de imagem Abrio		CRI Sistema de imagem Abrio Software
Abrio V2.2 Software		CRI	Abrio V2.2
Software de análise de imagem de luz polarizada de acesso aberto	OPS	OpenPolScope	http://www.openpolscope.org/