Artigo de método

In Situ Caracterização de Proteínas hidratadas em água por SALVI e TOF-SIMS

DOI:

10.3791/53708

⸱

15 de fevereiro de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Fundamental & Computational Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho apresenta um protocolo para o manuseamento de líquidos e a introdução da amostra a um microcanal para in situ de tempo-de-voo de iões secundários análise de espectrometria de massa de biomoléculas de proteína numa solução aquosa.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho demonstra a caracterização no local de biomoléculas de proteína na solução aquosa utilizando o Sistema de Análise na Interface de líquidos de vácuo (SALVI) e espectrometria de massa de íons secundários time-of-flight (TOF-SIMS). O filme proteína fibronectina foi imobilizado sobre a membrana de nitreto de silício (SIN), que forma a área de detecção Salvi. Durante a análise TOF-SIMS, três modos de análise foram realizados, incluindo alta espectrometria de massa espacial resolução, imagens bidimensionais (2D) e perfis de profundidade. Os espectros de massa foram adquiridos em ambos os modos positivos e negativos. água desionizada, também foi analisada como uma amostra de referência. Os nossos resultados mostram que a película de fibronectina em água tem picos de fragmentação água mais distintos e mais fortes em comparação com água sozinha. Picos característicos de fragmentos de aminoácidos também são observáveis ​​na proteína hidratado TOF-SIMS espectros. Estes resultados ilustram que a molécula de proteína de adsorção sobre uma superfície pode ser estudada Dynamically usando SALVI e TOF-SIMS no meio líquido para a primeira vez.

Introdução

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A hidratação é crucial para a estrutura, uma conformação, 2 e 3, a actividade biológica das proteínas. Proteínas sem as moléculas de água em torno deles não têm atividades biológicas viáveis. Especificamente, as moléculas de água interagir com a superfície interna e estrutura das proteínas, e diferentes estados de hidratação de proteínas fazer tais interacções distinta. 4 A interacção de proteínas com superfícies sólidas é um fenómeno fundamental com implicações em nanotecnologia, biomateriais e processos de engenharia de tecidos. Estudos têm indicado que a longo alterações conformacionais podem ocorrer como uma proteína encontra uma superfície. TOF-SIMS foi visualizada como a técnica que tem o potencial para estudar a interface de proteína-sólido 7/5. É importante compreender a hidratação de proteínas sobre superfícies sólidas, o que potencialmente oferece uma compreensão fundamental do mecanismo da sua estrutura, conformação e biológicaactividade al.

No entanto, as técnicas analíticas superfície principal está baseada em vácuo e aplicações diretas para estudos líquidos voláteis são difíceis devido à rápida evaporação do líquido volátil sob o ambiente de vácuo. Nós desenvolvemos um vácuo de interface microfluídico compatível, Sistema de Análise na Interface de líquidos de vácuo (SALVI), para permitir a observação direta de superfícies líquidas e interações líquido-sólido utilizando time-of-flight ion secundário espectrometria de massa (TOF-SIMS). 8- 11 os aspectos originais incluem o seguinte: 1) a janela de detecção é uma abertura de 2-3 um de diâmetro permitindo imagem directa da superfície do líquido, 2) a tensão de superfície é utilizada para conter o líquido no interior da abertura, e 3) é SALVI portáveis ​​entre múltiplas plataformas analíticas 11,12.

SALVI é composta de uma membrana de nitreto de silício (SiN) como a área de detecção e um microcanal feito de polidimetilsiloxano (PDMS). É Fabricated na sala limpa, e os fatores de fabricação e design de chave foram detalhados em artigos e patentes anteriores. 8-12 As aplicações da TOF-SIMS como uma ferramenta analítica foram demonstrados usando uma variedade de soluções aquosas e as misturas de líquidos complexos, alguns dos que continha nanopartículas. 13-17 Especificamente, SALVI líquido TOF-SIMS permite dinâmica sondagem da interface líquido-sólido de sistemas vivos biológicos (ou seja, os biofilmes), células individuais, e interface de eletrólito sólido, abrindo novas oportunidades para a fase situ condensado estudos, incluindo líquidos usando TOF-SIMS. No entanto, o projeto atual não permite interações gás-líquido ainda. Esta é uma direção para o desenvolvimento futuro. Salvi foi usado para estudar o filme proteico hidratado neste trabalho pela primeira vez.

A fibronectina é um dímero da proteína utilizada, consiste de dois monómeros quase idênticas ligadas por um par de ligações dissulfureto, 18 que is bem conhecido por sua capacidade de ligar as células 19,20. Ele foi escolhido como um sistema modelo para ilustrar que o filme proteína hidratado poderia ser sondado dinamicamente usando o líquido SALVI TOF-SIMS abordagem. A solução de proteína foi introduzido no microcanal. Após incubação durante 12 h, uma película de proteína hidratado formado no lado de trás da membrana SiN. Deionizada (DI) de água foi usada para enxaguar o canal após a introdução de proteínas. As informações foram coletadas a partir de moléculas de proteína fibronectina hidratados no microcanal SALVI usando dinâmica TOF-SIMS. DI água também foi estudada como um controlo para comparação com os resultados obtidos a partir de película fina fibronectina hidratado. Foram observadas diferenças distintas entre o filme de proteína hidratado e água DI. Este trabalho demonstra que a adsorção de proteínas na superfície no meio líquido pode ser estudada usando o novo SALVI e abordagem TOF-SIMS líquido. O protocolo de vídeo é destinado a fornecer orientação técnica para as pessoas que estão interessadasem utilizar esta nova ferramenta analítica para diversas aplicações de SALVI com TOF-SIMS e reduzir erros desnecessários na manipulação de líquidos, bem como a aquisição de dados TOF-SIMS e análise.

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Protocolo

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1. Limpeza e Esterilização do microcanal SALVI

  1. Esterilização do microcanal no SALVI
    1. Desenhar 2 ml de solução aquosa a 70% de etanol para uma seringa, conectar a seringa com a extremidade de entrada de Salvi e lentamente injectar 1 ml do líquido em 10 min. Remover a seringa no final da injecção. Em seguida, conecte a entrada e saída de SALVI usando um poliéter união (PEEK). Como alternativa, usar uma bomba de seringa para conduzir o mesmo procedimento. Por exemplo, definir a velocidade de fluxo de 100 mL / min.
    2. Manter o microcanal SALVI preenchido com uma solução de etanol a 70% à temperatura ambiente durante 4 h.
  2. Introduzir água desionizada (DI) em SALVI
    1. Desenhar 2 ml de água desionizada esterilizada para uma seringa, conectar a seringa com a entrada de Salvi e lentamente injectar 1 ml do líquido em 10 min. Retire a seringa e conecte a entrada e saída de SALVI usando uma união PEEK. Como alternativa, usar uma bomba de seringa, como mencionado emetapa 1.1.1.

2. A imobilização do Film Proteína em SALVI

  1. Imobilizar o Film Proteína em SALVI
    1. Desenhar 2 ml de fibronectina (10 ug / ml em tampão de fosfatos salino, PBS) solução para uma seringa, conectar a seringa com a entrada de Salvi lentamente injectam-se 1 ml do líquido em 10 min, remover a seringa, e ligar a entrada e na saída do SALVI usando uma união PEEK.
    2. Incubar a SALVI preenchido com a solução de fibronectina numa placa de cultura limpa, manter o prato na capa, à temperatura ambiente durante 12 h.
    3. Desenhar 2 ml de água desionizada esterilizada para uma seringa e ligar a seringa com a entrada de SALVI. Lentamente injectar 1 ml de água em 10 minutos, retire a seringa, e se conectar a entrada e saída de SALVI.
      Nota: Se equipado com um microscópio de luz, verifique a SALVI sob o microscópio para garantir que a membrana SiN está intacta antes da análise TOF-SIMS. Agora o dispositivo SALVI está pronto para TOF-SIMS umANÁLISE.

3. Instale SALVI no Loadlock Câmara TOF-SIMS

Nota: Devem ser usadas luvas em todos os momentos ao manusear o dispositivo SALVI e instalá-lo para o palco TOF-SIMS para evitar possíveis contaminações durante a análise de superfície.

  1. Mount SALVI para o Palco
    1. Coloque o estágio TOF-SIMS sobre uma superfície plana e limpa. Coloque o dispositivo SALVI para o palco com o wafer de silício e membrana SiN voltada para cima. Fixar o SALVI usando quatro de metal de fixação peças e parafuso as peças de metal segurando o canto do aparelho na placa de metal com quatro parafusos.
    2. Gentilmente enrolar o tubo de PTFE conectado ao canal microfluídico. Use quatro pedaços de metal e quatro parafusos para segurar a parte rígida para baixo. Certifique-se de que o dispositivo é posicionado no espaço aberto na fase SIMS de modo que não interfere com o feixe de iões primário durante a análise. imagem adicional e ilustração da fabricat SALVIion e instalação estão disponíveis em publicações anteriores. 8,9,11
  2. Monte a Copa Faraday para o Palco
    1. Fixe o copo de Faraday no palco por um parafuso.
  3. Carregar o palco para a TOF-SIMS Loadlock Câmara
    1. Abra o loadlock TOF-SIMS, manter e definir o cenário horizontalmente para a plataforma de carregamento, e feche a porta loadlock.

4. Aquisição de Dados TOF-SIMS

  1. Ligar a bomba de vácuo e garantir de vácuo adequada (por exemplo, da ordem de 10 mbar ou -6 Torr) é atingido na câmara loadlock.
  2. Mover o SALVI para dentro da câmara principal uma vez que o vácuo é estabilizado após cerca de 30 min.
    Nota: O vácuo deve ser inferior a 5 x 10 -6 mbar de vácuo na câmara principal durante a aquisição de dados. Caso contrário, maior vácuo é indicativo de uma fuga no sistema de SALVI.
  3. Ajustar o feixe de íons primário e analisador de TOF-SIMS com umresolução espacial de cerca de 400 nm de acordo com as recomendações do fabricante. A corrente de feixe primário é de 1.200 pA enquanto o tempo de ciclo é de 30 ms sob o modo DC.
    Nota: Este processo segue em grande parte as recomendações do fabricante.
  4. Localizar o canal microfluídico usando o microscópio óptico. Use o centro óptico de imagem como uma referência e alinhá-lo para ser coerente com o centro da imagem de íons secundários.
  5. Antes de cada medição, use um 1 KeV O 2 + feixe (~ 40 nA) para digitalizar na janela do pecado com uma área de 500 x 500 mm 2 para ~ 15 segundos para remover a contaminação da superfície. Além disso, use uma arma de inundação de elétrons para compensar o carregamento de superfície durante todas as medições. Use a função automática da arma de inundação no modo padrão para esta etapa.
  6. Selecione o modo positivo ou negativo antes de aquisição de dados. Use a 25 keV Bi feixe 3 + como o feixe de íons primário em todas as medições.
    Nota: Os passos são f semelhanteou aquisições de dados positivos e negativos. Por questões de espaço, o modo positivo é descrita em detalhes aqui.
    1. Profiling profundidade
      1. Digitalizar o feixe + Bi 3 em uma área circular com um diâmetro de ~ 2 mm com 32 pixels por resolução de 32 pixels.
      2. Para minimizar o tempo necessário para perfurar, através da membrana de SiN, utilizar uma largura de impulso de comprimento (isto é, 180 nanossegundos, a corrente do feixe ~ 1,0 Pa, a um tempo de ciclo de 100 ms) Bi + 3 feixe. As intensidades de iões secundários representante do aumento da superfície líquida quando punch-through é alcançado. O tempo de difusão de volume varia de 300 s a 500 s, de acordo com o lote da membrana SiN.
        Nota: Esta diferença parece estar relacionada com o lote de membranas SiN adquiridos de acordo com a nossa experiência. No entanto, o tempo de soco-through realmente não afeta a análise dos dados.
      3. Após a membrana SiN punch-through, manter o mesmo atual de cerca de 200 segundos paraobter dados suficientes para reconstruções de imagens 2D.
      4. Reduzir a largura de pulso para 80 nanossegundos para coleta de dados para adquirir espectros com melhor resolução de massa. Continue esta aquisição por cerca de outros 200 seg. Os dados do espectro mostrado na Figura 1 são obtidas a partir desta região.
    2. 2D Imaging and Mass Spectra
      1. Recolha de imagem 2D e dados de espectro de massa, ao mesmo tempo em que a medição dos dados de profundidade de perfil. O instrumento TOF-SIMS salva todas as informações de cada ponto durante o experimento. Os dados são apresentados em diferentes janelas (FPanel - Spectra, FPanel - Perfis e FPanel - imagens separadamente) do software de controle digital. Verifique os dados em cada painel judiciosamente durante a aquisição de dados.

Análise 5. TOF-SIMS Dados

Nota: A análise dos dados é inicialmente realizada utilizando o software instrumental IonToF TOF-SIMS.

  1. Abra a umasoftware ANÁLISE da SIMS (Medição Explorer) e, em seguida, clique no botão "perfis", "espectros" e "botões de imagem ', respectivamente, para processar perfil de profundidade, espectro m / z, e dados de imagem.
  2. Abra os arquivos de dados que têm a extensão ".ita".
  3. Selecione picos de interesse, escreva o nome da espécie na caixa "ion", e rotulá-los com cores diferentes no espectro. Use a roda de rolagem do mouse para arrastar ao longo do eixo-x. Use Ctrl e roda de rolagem para ajustar alturas de pico e larguras. Letra "L" alterna entre os modos lineares e Log ao longo do eixo y.
  4. Realizar a reconstrução dos dados antes da calibração de massa. Caso contrário, é difícil escolher o espaçamento entre picos, no passo de calibração de massa.
    1. Selecione os dados de perfis de profundidade de interesse e reconstruir os espectros de acordo com a série temporal de perfil de profundidade.
    2. Clique no botão de reconstrução. Na janela "Iniciar Reconstrução", digite um intervalo de varrimento de interest. Clique em "OK" para reconstruir os dados do perfil de profundidade.
  5. Faça uma calibração de massa. Pressione "F3" para abrir a janela "calibração de massa". Escolha picos para calibração com base na amostra específica. 21 Neste trabalho, utilizar os seguintes picos CH3 + (m / z 15), o H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 o 5 + (m / z 99) e H 13 o 6 + (m / z 109) para o modo positivo. Use os seguintes picos CH - (m / z 13), ó - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), e C 4 H - (m / z 49) para o modo negativo.
    1. Selecione um pico,certifique-se de que a seta para baixo está apontado para o pico no canto inferior esquerdo da janela. Clique que o pico e digite o nome do pico na janela "calibração de massa", clique em "Adicionar", e o íon de interesse está incluído na calibração de massa.
    2. Finalmente, clique no botão "Recalibrate". Verifique se as áreas de picos estão nos lugares certos acordo com a sua massa e carga rácios. No menu "Spectrum", selecione e clique em "Aplicar Calibração de Massa" para "todos os espectros" ou "espectros selecionado", dependendo da análise específica a ser conduzida.
  6. Como a seleção de pico é necessário para a análise da amostra, determinar os picos característicos da amostra de acordo com a literatura ou de outras descobertas anteriores. Comparar a intensidade dos picos de interesse na m / z espectros. Se necessário, adicione novos picos ou excluir picos inúteis na lista de pico.
    1. Adicionar picos. Clique em um pico, encontrar as linhas vermelhas na janela inferior esquerda. hold a tecla "Ctrl", role o mouse horizontalmente para definir a largura de pico, o que acrescenta um pico à lista de pico automaticamente. Outra forma de adicionar um pico é selecionar um pico na janela espectro principal, e, em seguida, clique no botão "adicionar pico" acima da janela. Se houver muitos picos para adicionar, no menu "Spectrum", selecione "picos de busca", verificar as especificações relacionadas na nova janela aberta, em seguida, adicione picos, conforme necessário.
    2. Para exportar uma lista de pico, no menu "Lista de pico", selecione "Salvar ..." a lista de pico no formato "itmil". Use o Ctrl eo botão esquerdo para arrastar ao longo do espectro. Na janela de espectros, selecione um pico de interesse e arraste as duas linhas tracejadas a posições desejáveis.
    3. Para importar uma lista de pico, no menu "Mass Lista intervalo", selecione "Importar ...", localize um arquivo de lista de pico existente com a extensão de arquivo ".ITPL". Clique em "Abrir".
    4. Para usar um "itmil" lista de pico, emo menu "Mass Lista Interval", clique em "Abrir ...", localize o arquivo e clique em "Abrir".
  7. Aplicar uma lista de pico para analisar melhor os dados. No-inferior esquerdo da janela "Spectra", há uma janela chamada "Missa Lista Interval". A lista de pico importado é mostrado aqui em cima.
    1. Direito do mouse no arquivo de lista de pico a ser utilizado, aplicá-lo para o "espectro ativo" ou "todos os espectros".
  8. Visualizar os perfis de dados. Na janela "Perfil", Use letra "M" para se ajustar à janela (série completa) ea letra "N" para se ajustar ao eixo y. Use Ctrl e roda de rolagem para ajustar a largura do perfil. Ou use "/" e "*" na placa chave para alterar o intervalo de eixo-y e altura.
  9. Exportar dados para o traço mais usando outro software gráfico após a análise inicial.
    1. Para exportar um perfil de profundidade, na janela "Perfil", clique no menu "Arquivo" e selecione "Export & #34 ;, e selecione "Salvar como" um arquivo ".txt".
    2. Para exportar um arquivo de espectro m / z, na janela "Spectra", clique no menu "Arquivo" e selecione "Exportar" e selecione "Salvar como" um arquivo ".txt".
    3. Para exportar um arquivo de imagem, na janela, tela de impressão "Imagem" e salvar como arquivo de imagem.

6. TOF-SIMS Plotagem de dados e Apresentação

Nota: Use uma ferramenta gráfica para traçar os dados após os dados SIMS são processadas utilizando o software instrumental.

  1. Use uma ferramenta gráfica para importar os dados.
  2. Fazer um lote utilizando o m / z como o eixo dos x e a intensidade do pico como o eixo Y a mostrar o espectro reconstruído. Um exemplo é dado na Figura 1.
  3. Fazer um lote utilizando o tempo de descarga eléctrica como o eixo dos x e a intensidade do pico como o eixo Y a mostrar a séries temporais perfil de profundidade reconstruída. Um exemplo é dado na Figure 2.
  4. Combinar imagens 2D reconstruídas de diferente m / z e formar uma matriz para mostrar o mapeamento de iões. Um exemplo é dado na Figura 2.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um par de resultados representativos são apresentados para demonstrar as vantagens do protocolo proposto. Usando a interface microfluídico SALVI, o feixe de íons primário (Bi 3 +) podem bombardear diretamente sobre o filme fibronectina hidratada em água DI. Assim, o mapeamento químico molecular da superfície do líquido pode ser adquirido com sucesso.

A Figura 1A e 1B most...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SALVI é uma interface que permite microfluídico superfície do líquido dinâmico e análise de interface líquido-sólido por instrumentos de vácuo com base, tais como TOF-SIMS e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Devido ao uso de pequenas aberturas para expor o líquido directamente no vácuo, SALVI é adequado para muitas técnicas de espectroscopia de imagiologia e finamente focados sem quaisquer modificações; 22 a portabilidade e versatilidade de microfluidos tornar-se um verdadeiro plataforma de imagem mu...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somos gratos ao fundo LDRD da Iniciativa de Imagens Químicas do Laboratório Nacional do Noroeste do Pacífico (PNNL) - Pesquisa e Desenvolvimento Dirigido por Laboratório (CII-LDRD) e Síntese e Simulação de Materiais em Escalas (MS3) pelo apoio. O acesso instrumental foi fornecido por meio de uma Proposta Temática de Ciências do Laboratório de Ciências Moleculares Ambientais (EMSL) da WR Wiley. O EMSL é uma instalação científica nacional patrocinada pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental (BER) do PNNL. Os autores agradecem ao Sr. Xiao Sui, ao Sr. Yuanzhao Ding e à Sra. Juan Yao pela revisão do manuscrito e pelo fornecimento de feedback útil. O PNNL é operado pela Battelle para o DOE sob o Contrato DE-AC05-76RL01830.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ToF-SIMSIONTOFTOF. Resolução do SIMS 5: >10.000 m/Δ m para resolução em massa; >4.000 m/Δ m para alta resolução espacial 
Sistema de Análise na Interface de Vácuo Líquido (SALVI)Laboratório Nacional do Noroeste do PacíficoN/ASALVI é uma ferramenta analítica única, autônoma e portátil que, pela primeira vez, permite que instrumentos científicos baseados em vácuo, como espectrometria de massa de íons secundários por tempo de voo (ToF-SIMS), analisem superfícies líquidas em seu estado natural no nível molecular.
PEEK UnionValcoZU1TPKpara conectar a entrada e saída do SALVI
5 Eixos Estágio de AmostraIONTOFN/AO estágio é feito por você mesmo para montagem de SALVI em ToF-SIMS
Sistema de Purificação de Água Nanopure BarnsteadThermo Fisher ScientificD11921ROpure LP Módulo de filtração por osmose reversa (D2716)
SeringaBD309659pipeta de 1 ml
Thermo Fisher Scientific21-377-821Faixa: 100 a 1.000 ml
Ponta de PipetaNeptune2112.96.BS1.000 µ l
Tubo de CentrífugaCorning43079115 ml
de FibronectinaSigma-AldrichF11411 mg/ml
EtanolThermo Fisher ScientificS25310A95% Desnaturado
Gibco PBSThermo Fisher Scientific10010-023pH 7.4

Referências

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