Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo Caenorhabditis elegans

Summary

Aqui detalhamos protocolos projetados especificamente para monitorar defeitos morfogênicos que ocorrem durante as fases inicial e tardia do alongamento embrionário do nematóide Caenorhabditis elegans. Em última análise, esses protocolos são projetados para identificar genes que regulam essas fases e caracterizar suas necessidades diferenciais ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.

Abstract

Dissecar as vias de sinalização que controlam a alteração dos processos morfogênicos durante o desenvolvimento embrionário requer métricas robustas e sensíveis. O alongamento embrionário do nematóide Caenorhabditis elegans é um estágio tardio do desenvolvimento que consiste no alongamento do embrião ao longo de seu eixo longitudinal. Este estágio de desenvolvimento é controlado pela comunicação intercelular entre as células hipodérmicas e os músculos subjacentes da parede corporal. Esses mecanismos de sinalização controlam a morfologia das células hipodérmicas remodelando o citoesqueleto e as junções célula-célula. A medição da letalidade embrionária e da parada do desenvolvimento nos estágios larvais, bem como a alteração do citoesqueleto e das estruturas de adesão célula-célula em células hipodérmicas e musculares, são fenótipos clássicos que têm sido usados há mais de 25 anos para dissecar essas vias de sinalização. Estudos recentes exigiram o desenvolvimento de novas métricas visando especificamente o alongamento precoce ou tardio e caracterizando defeitos morfogênicos ao longo do eixo ântero-posterior do embrião. Aqui, fornecemos protocolos detalhados que permitem a medição precisa do comprimento e da largura dos embriões alongados, bem como do comprimento das larvas sincronizadas. Esses métodos constituem ferramentas úteis para identificar genes que controlam o alongamento, para avaliar se esses genes controlam as fases inicial e tardia desse estágio e são necessários uniformemente ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.

Introduction

Por quase 50 anos, os nematóides Caenorhabditis elegans estabeleceu-se como um modelo poderoso para estudar questões importantes no desenvolvimento, neurobiologia, evolução, interações patógeno-hospedeiro, etc. ¹ A força deste modelo no estudo do desenvolvimento encontra-se em: seu ciclo de vida curta de 3 dias; a facilidade com que estes animais podem ser geneticamente alteradas; sua transparência que permite a observação de deslocamento e morfologia celular em animais vivos e seu desenvolvimento que é principalmente extra-uterina. As fases de desenvolvimento do nematóide envolvem embriogênese e quatro estágios larvais (L1 a L4), seguido....

Protocol

1. Caracterização de Defeitos Alongamento adiantados em WT e mutantes Animais

1. Embriões de montagem para Normarski DIC Microscopia
   1. Preparar o seguinte meios de cultura e do material:
      1. M9 buffer, dissolver 12,8 g / L de Na ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O, 3 g / l KH ₂ PO _4, 5 g / L de NaCl, 0,25 g / L MgSO ₄ • 7H ₂ O em água destilada e em autoclave para esterilizar.
      2. Placas NGM, dissolve-se 3 g / L de NaCl, 16 g / L de ágar, 2,5 g / l de bactopeptona em ddH ₂ O. Autoclave e adicionar 1 mM de _{MgSO4, CaCl2} 1 mM, ta....

Results

Cabeça-, Cauda e Rácio de cabeça / cauda de largura são métricas robusto.

Os protocolos aqui descritos têm sido utilizados com sucesso para caracterizar a função dos reguladores e dos efectores de Rho GTPases pix-1, Pak-1 e deixou-502 durante o alongamento precoce ^7.<.......

Discussion

Este protocolo descreve novas métricas para caracterizar início e fases tardias de alongamento embrionário.

Na seção 1, o passo crítico é a potencial presença de bactérias no teclado. Os embriões são hermeticamente fechado entre a almofada e a lamela durante a aquisição de imagem. Selagem a lâmina é necessário para evitar a dessecação dos animais durante a aquisição que dura mais do que duas horas. Para nosso conhecimento, nenhum dos cimentos usados ​​para montar almofadas de agarose entre l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ágar	BioShop	AGR001.500
Agarose	Bioshop	AGA001.500
CaCl2 (Cloreto de Cálcio)	Bio Basic Inc.	CT1330
Colesterol	Sigma-aldrich	C8667
Solução de limpeza	union Biometrica	300-5072-000
Lamínulas de vidro	Fisherbrand	12-542B
Corrediças de vidro	Fisherbrand	12-552-3
Partículas de controle de alta	fluorescência união Biometrica	310-5071-001
K2HPO4 (fosfato de potássio, dibásico)	Bio Basic Inc.	PB0447
K2HPO4 (fosfato de potássio, monobásico)	Bio Basic Inc.	PB0445
MgSO4 (sulfato de magnésio)	Sigma-aldrich	230391
Na2HPO4(fosfato de sódio, dibásico)	Bio Basic Inc.
NaCl (cloreto de sódio)	Bio Basic Inc.	DB0483
Goma de Desenho Pebeo 45  ml	pé bé o	PDG033000	qualquer loja de arte/artesanato
Peptone	BioShop	PEP403.500
tampão de bainha	Biometrica	300-5070-100
COPAS Biosort	união Biometrica