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Artigo de método

Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo

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DOI:

10.3791/53712

⸱

28 de março de 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Pharmaqam, Université du Québec à Montréal

Neste artigo

Resumo

Aqui detalhamos protocolos projetados especificamente para monitorar defeitos morfogênicos que ocorrem durante as fases inicial e tardia do alongamento embrionário do nematóide Caenorhabditis elegans. Em última análise, esses protocolos são projetados para identificar genes que regulam essas fases e caracterizar suas necessidades diferenciais ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.

Resumo

Dissecar as vias de sinalização que controlam a alteração dos processos morfogênicos durante o desenvolvimento embrionário requer métricas robustas e sensíveis. O alongamento embrionário do nematóide Caenorhabditis elegans é um estágio tardio do desenvolvimento que consiste no alongamento do embrião ao longo de seu eixo longitudinal. Este estágio de desenvolvimento é controlado pela comunicação intercelular entre as células hipodérmicas e os músculos subjacentes da parede corporal. Esses mecanismos de sinalização controlam a morfologia das células hipodérmicas remodelando o citoesqueleto e as junções célula-célula. A medição da letalidade embrionária e da parada do desenvolvimento nos estágios larvais, bem como a alteração do citoesqueleto e das estruturas de adesão célula-célula em células hipodérmicas e musculares, são fenótipos clássicos que têm sido usados há mais de 25 anos para dissecar essas vias de sinalização. Estudos recentes exigiram o desenvolvimento de novas métricas visando especificamente o alongamento precoce ou tardio e caracterizando defeitos morfogênicos ao longo do eixo ântero-posterior do embrião. Aqui, fornecemos protocolos detalhados que permitem a medição precisa do comprimento e da largura dos embriões alongados, bem como do comprimento das larvas sincronizadas. Esses métodos constituem ferramentas úteis para identificar genes que controlam o alongamento, para avaliar se esses genes controlam as fases inicial e tardia desse estágio e são necessários uniformemente ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.

Introdução

Por quase 50 anos, os nematóides Caenorhabditis elegans estabeleceu-se como um modelo poderoso para estudar questões importantes no desenvolvimento, neurobiologia, evolução, interações patógeno-hospedeiro, etc. 1 A força deste modelo no estudo do desenvolvimento encontra-se em: seu ciclo de vida curta de 3 dias; a facilidade com que estes animais podem ser geneticamente alteradas; sua transparência que permite a observação de deslocamento e morfologia celular em animais vivos e seu desenvolvimento que é principalmente extra-uterina. As fases de desenvolvimento do nematóide envolvem embriogênese e quatro estágios larvais (L1 a L4), seguido por idade adulta. Durante o desenvolvimento embrionário, epidérmica morfogênese atraiu considerável atenção por sua capacidade de permitir uma melhor compreensão de como epitelial células migram como um grupo, como eles reorganizar suas junções e modificar sua morfologia individual, bem como o seu posicionamento relativo dentro de um epitélio funcional.morfogénese epidérmico é dividido em quatro fases: intercalação dorsal que consiste na reorganização das células epidérmicas dorsal, designado por hipoderme; ventral invólucro, que consiste na migração de células ventrais hipodérmicas para com a linha média ventral, assim, que encerra o embrião de uma monocamada de células epiteliais; início e alongamento final de transformação do embrião em forma de feijão em larvas vermiforme. Seguindo morfogênese, Vigia do embrião e as larvas L1 iniciar a alimentação por meio de bactérias disponíveis no seu ambiente imediato.

alongamento embrionário é, por conseguinte, uma fase tardia do desenvolvimento embrionário. Consiste na extensão do embrião ao longo do seu eixo longitudinal e uma redução do seu diâmetro transversal. Isto envolve uma modificação da forma dramática das células hipodérmicas. Alongamento é dividido em um precoce e uma fase tardia. A fase inicial começa na fase vírgula e termina quando os músculos do corpo de parede começam a contrair na fase de 1,75 vezes em wdo tipo DPI (em peso) de embriões - correspondente a embriões que são 1,75 vezes em comprimento em comparação com os embriões não alongado. Morfogênese que ocorrem nessa fase são impulsionadas principalmente pela contração de feixes de filamentos de actina (FBS) localizadas no pólo apical de células hipodérmicas que impulsionam seu alongamento ao longo do eixo antero-posterior do embrião 2. A contração dos corpos estranhos é o controle por fosforilação das cadeias de miosina-luz por três quinases LET-502 / Rock, MRCK-1 e Pak-1 5. A fase final do alongamento, começa quando os músculos do corpo de parede se tornar funcional e começar a contratação. Trata-se de sinalização mecanotransdução dos músculos do corpo de parede para as células dorsal e ventral hipodérmicas e termina quando os animais chocar 3.

Alongamento defeitos são geralmente caracterizadas por a percentagem de animais que morrem como embriões (letalidade embrionária; Emb) e aqueles prender o seu desenvolvimento como larvas L1 (fenótipo prisão larval; Lva) e ser significativamente menor do que em peso. A identificação do estágio da prisão de desenvolvimento requer observação microscópica de embriões mortos e presos Larvas 3-6.

Recentemente, foi demonstrado que vários genes, tais como o regulador de Cdc42 / Rac efector e pix-1 e Pak-1, o controlo dos processos morfogénicas durante tanto precoce e tardia de alongamento 3,7. Nós também mostrou recentemente que os processos morfogénicas diferem ao longo do eixo ântero-posterior do embrião precoce durante o alongamento 3 7. Estes resultados motivou o desenvolvimento de novas métricas destinadas especificamente às etapas de alongamento precoce ou tardia e outras de medição, permitindo a caracterização da morfologia de embriões ao longo do seu eixo ântero-posterior durante o alongamento inicial.

Estes novos métodos consistem na medição do comprimento de embriões no início e no final de alongamento precoce, bem como a largura da sua eleanúncios e caudas. 7 Dois protocolos foram também desenvolvidos para medir o comprimento das larvas recém-nascidas, sincronizados em L1 estágio 7.

Os ovos dos embriões protegê-los contra o tratamento alcalino, enquanto hipoclorito larvas, e adultos bactérias presentes no meio de cultura são dissolvidos pelo tratamento. Este tratamento é, então, utilizada para purificar embriões a partir de uma população não sincronizada contendo a maioria dos adultos bem alimentados 8. restrição alimentar é usado para sincronizar as larvas recém-nascidas. Medindo a duração dessas larvas é então usada para detectar defeitos de alongamento. Esta medição é preferido em relação à medição de larvas preso em placas de cultura, porque as larvas que eclodem a partir de embriões não totalmente alongados pode recuperar a "comprimento normal" ao alimentar mas irá manter o seu tamanho reduzido, quando preso na ausência de comida.

Aqui, apresentamos protocolos detalhados que permitem a medição da length de alongar embriões, bem como a largura da sua cabeça e cauda utilizando lapso de tempo de microscopia DIC e análise de imagem (Protocolo 1). Nós também fornecemos protocolos detalhados para medir o comprimento de larvas sincronizados usando análise de imagem (Protocolo 2) e citometria de fluxo (Protocolo 3).

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Protocolo

1. Caracterização de Defeitos Alongamento adiantados em WT e mutantes Animais

  1. Embriões de montagem para Normarski DIC Microscopia
    1. Preparar o seguinte meios de cultura e do material:
      1. M9 buffer, dissolver 12,8 g / L de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 g / l KH 2 PO 4, 5 g / L de NaCl, 0,25 g / L MgSO 4 • 7H 2 O em água destilada e em autoclave para esterilizar.
      2. Placas NGM, dissolve-se 3 g / L de NaCl, 16 g / L de ágar, 2,5 g / l de bactopeptona em ddH 2 O. Autoclave e adicionar 1 mM de MgSO4, CaCl2 1 mM, tampão de fosfato 1 mM e 5 ug / ml de colesterol. Pour 6 ml de NGM por pratos de 60 mm. Permitir que a forma a solidificar durante 24 horas à temperatura ambiente. Adicione algumas gotas de uma cultura saturada de E. OP50 bactérias coli cresceram em caldo de Luria (LB). Deixe as bactérias crescem durante 48 horas e armazenar as placas a 4 ° C.
      3. Para gerar o pi vermeCK, um suporte de fio de platina de 0,01 "de diâmetro em uma pequena pipeta de Pasteur. Fixar o fio de platina para a extremidade da pipeta de vidro por aquecimento de essa extremidade com um queimador de benzeno. achatar a extremidade do fio para gerar uma espécie de pá.
    2. Crescer a tensão verme em 60 mm placas NGM com OP50 a 20 ° C.
      NOTA: alelos termossensível pode necessitar de crescimento dos animais, a temperaturas não permissivas a até 25,5 ° C. As placas devem conter muitos adultos jovens e ainda a abundância do alimento a fim de prosseguir os protocolos.
    3. Coloque uma lamela de microscópio entre duas lâminas de espaçamento cobertas por duas camadas de fita adesiva (Figura 1A).
    4. Prepara-se uma solução de agarose a 3% (peso / volume) em tampão M9 por dissolução de 0,6 g de pó de agarose em 20 ml de tampão M9 por aquecimento no forno de microondas durante 30 seg. Deixe a solução esfriar por 5 min.
      NOTA: A solução de agarose pode ser utilizado para alguns dias após a fusão em um forno de microondas. istotambém pode ser dividido em alíquotas e armazenado a 4 ° C durante semanas.
    5. Colocar uma gota da solução de agarose quente de 3% sobre a lâmina de vidro localizado entre os dois espaçadores-lâminas. Evitar a formação de bolhas.
    6. Rapidamente cobrir a agarose com outro slide como mostrado na Figura 1B e pressione suavemente. O deslizamento de topo irá achatar a gota de agarose e gerar um bloco com a espessura de duas camadas de fita adesiva.
    7. Permitir que a agarose solidificar durante pelo menos 1 min a temperatura ambiente ou até que os embriões são pronto para ser transferido para a almofada.
    8. Usando uma picareta verme, transferir 20 a 30 jovens adultos bem alimentados a partir da NGM-placa em um tubo de micro-centrífuga contendo 400 mL de tampão M9.
    9. Permitir que os vermes para sedimentar por gravidade durante aproximadamente 5 min e remove-se o sobrenadante utilizando uma micropipeta. Esta etapa tem o objetivo de remover o máximo de bactérias escolhidas com os nematóides.
    10. Adicionar 200 ul de tampão M9 a cada tubo.
    11. Usando um pip Pasteurette, transferir o conteúdo do tubo (tampão e nemátodos) para um vidro de relógio.
    12. Use uma ou duas 25G 5/8 "agulhas para cortar os animais no ponto médio do corpo (entre o spermatheca ea vulva).
      NOTA: Uma lâmina de bisturi, também pode ser usado como uma alternativa à agulha (s). Faça isso em nematóides natação e pode exigir alguma prática. A ideia é a utilização de agulhas como tesouras ou uma faca como dependendo de como muitas agulhas são utilizadas. Uma vez que os animais são cortados, hermafroditas libertar os seus embriões no buffer.
    13. Concentra-se os embriões no centro do vidro de relógio, através da geração de um vórtice circular no interior do líquido.
    14. Remover a maior parte da M9 a partir do vidro de relógio utilizando uma micropipeta. Deixar cerca de 30 ul de M9 com os embriões.
    15. Remover a corrediça de cobertura da almofada de agarose (Figura 1B), deslizando-o fora da almofada.
    16. Cortar a almofada com uma lâmina de barbear, de modo a ser capaz de cobrir completamente com uma lamela (Figura 1C).
    17. Com uma pipeta Pasteur, transferir todos os embriões (e detritos sem-fim) sobre o bloco de agarose.
    18. Grupo os embriões no centro do painel usando um cílio colado na extremidade de uma ponta usada para micropipetas 200 ul.
    19. colocar-se lentamente uma lamela na plataforma de evitar a formação de bolhas e selá-lo.
      NOTA: Vários cimentos podem ser utilizados. Usamos desenho goma encontrada em arte e artesanato lojas (geralmente usada como máscara de goma para a pintura aquarela). Esta goma é utilizado porque é hidrofílica e solidifica razoavelmente rápida e não é tóxico para os vermes. Slides também pode ser selado com unha polonês ou valap (mistura feita de vaselina, lanolina e cera de parafina).
    20. Permitir que o desenho seco gum por cerca de 15 min.
  2. Gravação precoce Alongamento usando Four-dimensional Normarski DIC Microscopia
    NOTA: O objectivo deste passo é para gravar o alongamento precoce de vírgula para o início da tarde alongamento- Definido como o momento quando os músculos do corpo de parede começar contratação. Também pretendemos gravar mais de um embrião no momento. Oito horas de gravação geralmente são obrigados a registrar o alongamento cedo para um grupo de embriões não-sincronizado.
    1. Coloque a-corrediça montada sobre a plataforma de um microscópio. Certifique-se de que o microscópio está equipado com 10X e 60X objectivos, bem como lentes de DIC, Prisma, câmera e software de captura que permitem microscopia de lapso de tempo e de geração de Z-stacks (Z-plataforma automatizada).
      NOTA: garantir que a temperatura é constante entre 20 e 23 ° C na sala de microscopia. Uma câmara de refrigeração de aquecimento podem ser necessários no palco microscópio, especialmente quando se utiliza mutantes termossensíveis.
    2. Identificar um grupo de embriões em fases pré-morfogénese usando a objectiva 10X.
    3. Uma vez localizado, deslize a objetiva de 10X e adicionar uma gota de óleo de imersão no slide.
    4. Usando o objetivo 60X, identificar a parte superior e inferior do embryos para configurar os parâmetros de imagem Z-stack.
      NOTA: Não hesita para definir o Z-pilha maior do que a espessura dos embriões. Defina a distância entre dois planos adjacentes como 0,8 mm. Isto irá permitir a cobrir a profundidade total dos embriões em 35 a 50 Z-planos.
      NOTA: Se o microscópio contém uma plataforma XY automatizado, embriões localizados em diferentes locais da almofada poderia ser gravados simultaneamente. Para fazê-lo, ficha coordenadas XY de cada localização na almofada que deseja analisar durante o decurso da experiência. Certifique-se de selecionar o xy ao definir o parâmetro de gravação e seguir o resto do protocolo, como indicado. Fina Z-secção do embrião durante a gravação não é necessariamente obrigatório para as medições detalhadas neste protocolo. Gravando o desenvolvimento embrionário dos animais WT e mutantes com a resolução máxima é no entanto uma boa prática, a fim de construir uma biblioteca de gravações capazes de suportar análises adicionais.
    5. Conjunto-se o lapso de tempo com intervalos de 2 minutos entre duas aquisições com duração de 8 horas.
      NOTA: O tempo de exposição dependerá da intensidade da luz para definir o microscópio. a movimentação das células durante o alongamento precoce é muito lenta; exposição em tempo poderia ser aproximadamente um quadro por segundo ou menos. Se os embriões estão em estágios iniciais morfogênese (intercalação dorsal, cerco ventral), alongamento no início seria registrada dentro de 1 hora. Certifique-se de obturador de luz está fechado entre cada aquisição.
    6. Executar a aquisição e guardá-lo.
  3. Medição de Defeitos Alongamento adiantado que usa Análise de Imagem
    1. Software Fiji-ImageJ Open ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
    2. No menu, selecione Analisar / Definir Medidas, selecione perímetro. Para cada embrião, ajustar a barra de escala Z a concentrar-se na faringe do embrião, como mostrado na Figura 2A. Isto irá assegurar que você se concentrar no centro do embrião.
    3. Para medir o comprimento do embrião, ajustar a barra de escala de tempo para que o embrião de interesse no início do início do alongamento (fase vírgula; Figura 2A). Observe o tempo ( "Time-início").
    4. Escolha a ferramenta de linha segmentada. Desenhar uma linha segmentada da ponta da boca do embrião até a ponta da cauda seguindo a linha média do embrião (figura 2A). Usando a guia do menu Analisar / Medida, obtenha o comprimento da linha desenhada ( "início Duração").
    5. Repetir esta medição para o mesmo embrião no final de alongamento precoce (momento quando os músculos começar a contrair-). Registar o tempo ( "time-end") e medir o comprimento do embrião ( "Corpo-end"), conforme descrito acima (Figura 2B).
    6. Calcula-se a duração (D) do alongamento inicial e o aumento de comprimento (L) durante esta fase da seguinte forma:
      D = "Time-end" - "Time-começo"
      & #160; L = "Comprimento-end" - "Comprimento-começo"
    7. Para medir a largura da cabeça, ajustar a barra de escala de tempo para ter um embrião em fase de interesse (fase de 1,2 vezes, ou no final de alongamento precoce). Escolha a ferramenta de linha reta. Desenhe a linha média transversal (eixo dorso-ventral) da cabeça. Esta seção é a parte mais espessa do embrião (Figura 2C). Usando o menu Analisar / Medir, obtenha o comprimento da linha correspondente à largura da cabeça.
    8. Ao mesmo ponto de tempo, repetir este passo a tiragem da linha média transversal da cauda (linha média entre a válvula intestinal e a ponta da cauda; Figura 2C) e medi-la para se obter a largura da cauda.
      NOTA: Use esta medida para comparar embriões no mesmo estágio em diferentes fenótipos. Para garantir a reprodutibilidade da medição, certifique-se de encontrar um local situado em torno do mid-line da cauda do animal que pode ser facilmente reconhecido de um animal para umnão ela.
    9. Para calcular a cabeça para largura cauda, ​​dividir a largura da cabeça pela largura da cauda.

2. Caracterização de Defeitos Alongamento tarde Utilizando Análise de Imagem

  1. Sincronização de L1 Larvas usando Alkaline Hipoclorito Tratamento
    1. A partir de uma placa mm não esfomeados 60 contendo muitos adultos grávidos, recolher todos os vermes em um tubo de micro-centrifugação de lavagem dos nemátodos fora da placa com 1 ml de tampão M9 usando uma pipeta de Pasteur.
    2. nemátodos de sedimentos, a 3500 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante utilizando uma micropipeta, sem perturbar o sedimento sem-fim.
    3. Adicionar 1 ml de solução de hipoclorito de cada tubo (0,4 M de hipoclorito, NaOH a 0,5 M) e agitar durante 3 min.
      NOTA: solução de hipoclorito alcalino deve ser preparada e embriões nesta solução deve ser agitada suavemente, mas de forma contínua para otimizar a dissolução dos adultos e oxigenação do embryos. Após 3 minutos de agitação, a maioria dos adultos devem libertar os seus ovos na solução.
    4. Girar a 3500 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente e remover rapidamente o sobrenadante utilizando uma micropipeta, sem perturbar o sedimento.
    5. Lavar quatro vezes com 1 ml de tampão M9 seguido de centrifugação a 3500 xg durante 3 min.
    6. Após a quarta lavagem, remover os ovos de sobrenadante e ressuspender em 700 ul de tampão M9 sem pipetando-se os ovos (como os ovos furaria ao plástico da ponta).
    7. Tape o tubo num agitador orbital de 3 mm colocado em uma incubadora à temperatura de crescimento apropriado e agitar a 600 rpm durante a noite.
  2. Comprimento Medição da Synchronized Larvas
    1. Centrifugar preso larvas L1 a 3500 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. Ressuspender as larvas em 100 ul de tampão M9 e transferi-los para uma almofada de agarose utilizando uma pipeta de Pasteur (almofadas de agarose deve ser preparard conforme descrito no ponto 1.1.2 a 1.1.8). Coloque uma lamela sobre a almofada.
      NOTA: O bloco não necessita de ser selado com goma para esta experiência que envolve curto aquisição.
    2. Utilize uma objectiva de contraste de fase e iluminação 10X para medir o comprimento das larvas se uma câmara de alta resolução é usado. Aumentar a intensidade da luz deve ser capaz de capturar imagens dentro de alguns milésimos de segundo e, consequentemente, obter uma imagem clara das larvas (Figura 2D).
      NOTA: Enquanto os trashes de natação de larvas são reduzidos pela almofada de agarose, eles ainda estão se movendo. Portanto, a gravação rápida é essencial para obter uma imagem clara.
    3. Abra Fiji-ImageJ e repita o passo 1.3.1. Para medir o comprimento de larvas, escolha a ferramenta de linha segmentada. Desenhar uma linha segmentada a partir da ponta da cabeça até à ponta da cauda seguindo a linha média das larvas (Figura 2D, painel da direita).
    4. Usando o menu Analisar / Medida, obtenha o comprimento doA linha desenhada correspondente ao comprimento das larvas em micrómetros.

3. Caracterização de Defeitos Alongamento tardia utilizando citometria de fluxo

  1. sincronizar Larvas
    1. Purificar embriões que utilizam o tratamento Hipoclorito de Sódio, conforme descrito no ponto 2.1 do total de 100 placas mm de bem alimentados adultos jovens e deixar a escotilha embrião e a prisão L1 em ​​tampão M9 de 16 a 24 horas a 20 ou 25,5 ° C, dependendo da estirpe analisados.
      NOTA: Uma placa cheia de adultos bem alimentados por estirpe é suficiente para a análise descrito abaixo.
  2. A calibração do Sorter Worm
    NOTA: O citômetro de fluxo usado aqui é um fluxo grande de partículas citômetro (doravante referido como o classificador de verme). O classificador inclui um sem-fim 670 nm do laser de diodo vermelho, que está localizado em frente de um detector de extinção. O classificador de worm também contém um multi-linha laser de argônio para a excitação fluorescente. os standard instrumentos tem três detectores de tubos fotomultiplicadores (PMT) fluorescência usado para detectar emissões de fluorescência nas regiões verdes, amarelos e vermelhos do espectro. No protocolo aqui descrito, TOF vai ser utilizado para medir o tamanho das larvas, o canal vermelho será usado para identificar lagartas mortas que serão corados com iodeto de propídio (PI). GP (General Purpose) alta fluorescência de Controle partículas utilizadas para calibrar o instrumento e como um controlo interno em nosso experimento exibir alta fluorescência em verde, amarelo e vermelho. Eles serão os únicos objetos na amostra analisada com alta emissão detectada no canal verde e serão posteriormente identificados com base em esta característica.
    NOTA: Living animais são identificados com base na ausência de fluorescência no canal verde e vermelho, bem como sobre a TOF. autofluorescente emissão a partir do intestino das larvas não é detectável na fase L1.
    1. Ligar o bloco de laser, o computador, a um compressord o instrumento verme classificador. Pressione o botão START sobre o software classificador de minhoca aberto como indicado no manual de instruções do instrumento.
    2. Observe a janela pop-up do controle laser de argônio. Selecione o modo RUN e esperar que as potências de laser chegar a 10 ± 1 mW. Selecione FEITO na janela de controle de laser.
    3. Defina a bainha e as pressões de amostra para 5,10 ± 0,02 e 5,51 ± 0,01, respectivamente. Permitir que a pressão a equilibrar durante pelo menos 15 minutos e clique na caixa de verificação de pressão OK.
      NOTA: O caudal depende da bainha e as pressões de amostra.
    4. Certifique-se para eliminar todas as bolhas presentes nos túbulos de canais de escoamento entre o copo de amostra e da câmara de análise. Para fazer isso, clique em adquirir e suavemente dê pequenos toques túbulo até que nenhuma bolha são adquiridas (como visto na janela de aquisição).
    5. Configuração de todos os parâmetros de medição e detecção da seguinte forma fluorescente e TOF:
      1. Definir as escalas para TOF, Ext, Verde, Amarelo e Vermelho para256. Set ganho como descrito na Tabela 1. Set PMT Controle em 700 para o verde e amarelo e 900 para o vermelho.
        NOTA: Dois filtros de excitação estão disponíveis (488 nm e 514 nm) e pode ser utilizado para excitar, quer a proteína verde fluorescente (GFP) ou a proteína fluorescente amarela (YFP), ou quaisquer fluorocromos excitada a estes comprimentos de onda com o laser de árgon de várias linhas. filtros apropriados necessitam de ser inserido na câmara de filtro do equipamento. Utilizou-se o filtro de 488 nm para a experiência seguinte.
    6. Para calibrar o classificador de sem-fim, selecione "partículas de controle Executar" no menu de ferramentas. Coloque 20 ml de 1x GP (General Purpose) alta fluorescência de Controle de Partículas no copo (estas partículas são partículas fluorescentes de tamanho preciso, vendidos pelo fabricante citometria de calibrar seu instrumento).
    7. Clique no botão AQUISIÇÃO para começar a bainha e o fluxo da amostra.
      NOTA: Espere uma média relacionada com a distribuição de controle de partículas de 21 ± 6 e acoefficient de variação em torno dessa média (CV) ≤11. Se o CV é> 11 ea média é> 27 tente limpar os túbulos clicando várias vezes no botão limpa ou sacudindo o canal de fluxo.
  3. Aquisição de TOF animal
    NOTA: A luz dispersa quando um objecto passa na célula de fluxo entre a fonte de laser e o detector de extinção. O tempo que leva para que a luz seja dispersa por um objecto (tempo de voo, TOF) é usado para medir o comprimento axial do objecto. A extensão da luz mascarado pelo objeto (extinção, EXT) é utilizada como uma medida da sua opacidade densidade / óptico.
    1. Coloque 10 ml de sincronizada do tipo selvagem (wt) L1 em um vidro de relógio e estimar a percentagem de mortos-ovos usando um microscópio de dissecação.
      NOTA: sincronizado L1 exibindo alta Emb (superior a 20%) em peso não deve ser usado para posterior análise.
    2. Transferência sincronizada de L1 a partir da microcentrífuga (umproximadamente 700 ul de M9 contendo L1) para um tubo de 15 ml. Adicionou-se iodeto de propídio (PI) a uma concentração final de 10 ug / ml (diluição 1/100 de uma solução mãe de 1 mg / ml) e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
      NOTA: Os ovos e as larvas mortos serão coradas utilizando PI e detectado como objetos altamente fluorescentes utilizando o canal vermelho.
    3. Adicionar 10 ml de tampão M9 para diluir populações coradas. Tomar 5 ml de as populações diluído e diluí-los quatro vezes por adição de 15 ml de M9. Coloque esta diluição no copo de amostra.
    4. Execute o fluxo de amostra por ACQUIRE clicando e observar a taxa de fluxo.
      NOTA: Para se ter uma medição precisa, o caudal deve ficar entre 15 e 25 objetos / seg.
    5. Se necessário, ajustar a quantidade de animais no copo para atingir a vazão desejada.
      NOTA: A vontade caudal depende das pressões (bainha e da amostra) que são constantes como indicado em 3.2.3 e na concentração de larvas in copo. Se a taxa de fluxo é maior do que 25 objetos / sec adicionar algum tampão no copo. Se for menor do que 15 objetos / sec Adicionar L1 concentrado (a partir do passo 3.3.3) no copo.
    6. Uma vez que a concentração adequada de objeto for atingido, avaliar o volume no copo e adicione 1/4 th deste volume em solução alta fluorescente GP Controle de Partículas 4x.
    7. Ajuste o parâmetro gating e classificação. Para fazer isso, clique em "gating" no menu e selecione 'vs. TOF' e "verde". Clique em "Triagem" no menu e selecione 'TOF vs.' e 'Red'. Gating e classificação de gráficos irá aparecer como mostrado na Figura 3A.
      NOTA: Isto irá permitir a visualização das partículas de controle (emissão em verde e vermelho), animais mortos corados pelo PI e bolhas (emissão em vermelho e não Verde) e animais vivos (sem emissão em canais nem verdes, nem vermelhas) (Figura 3A ).
    8. Executar o experimento clicando ACQÙire.
      NOTA: Para identificar as diferenças pequenas entre larvas, analisar cerca de 10.000 objetos, para que cerca de 8.000 animais. Interromper a experiência e exportar os dados como formato .txt, clicando no STORE.
  4. Medição do tamanho de vida relativo Animals in Sincronizadas Populações
    1. Abra o arquivo .txt usando um software capaz de gerenciar grandes tabelas de dados.
    2. A partir dos objectos analisados ​​extrair os valores TOF associados com partículas de controlo que são caracterizados pela emissão no canal verde mais elevado do que 100 unidades arbitrárias (este valor depende dos parâmetros definidos na secção 3.2.5). Criar uma nova coluna e chamá-lo "partículas de controle '. Criar uma coluna que contém todos os outros objetos, exceto as partículas de controle chamado "amostra". NOTA: a emissão de fluorescência de novas necessidades de lote de partículas a serem verificados antes de iniciar as aquisições. Isto irá definir o limite fluorescente que permite a identificação departículas de controlo de mais de L1.
    3. Para cada cepa analisada identificar a parte da experiência, em que a taxa de fluxo foi alterada (devido à presença de um tampão de ovos, por exemplo). Para fazer isso:
      1. Traçar a TOF de "partículas de controle 'para cada amostra como um fator de tempo (Figura 3B).
      2. Desenhe a linha de tendência linear utilizando a ferramenta de linha de tendência e exibir a equação no gráfico.
        NOTA: O TOF de partículas de controle deve ser constante ao longo do tempo (linha horizontal, Figura 3B). Considerando-se a equação da linha de tendência linear desenhado na dados y = ax + b, garantir que o 'a' valor é menor que 10 -4. Todas as medições feitas nas secções de tempo que indica uma ruptura no alinhamento das partículas de controlo deve ser removido a partir da análise.
    4. Remover os embriões mortos e as bolhas de emissão (maior do que 15 no vermelho), bem como de pequenos detritos grandes e tampões de ovo (TOF inferior a 10 e de altaer de 70 respectivamente) a partir da medição 'sample'.
    5. Traçar a distribuição de 'partículas de controle' para cada cepa analisada. Como pode ser visto na Figura 3C estas distribuições devem sobrepor quase perfeitamente. Isso garante que as medições TOF obtidos para diferentes estirpes podem ser comparados. NOTA: normalização de elementos de amostras de TOF sobre partículas de controlo pode ser usado se as distribuições de partículas de controlo de uma amostra de não sobreposição com a de amostras de controlo. TOF normalizada são calculados como se segue:
      1. Normalizar TOF para o genótipo G = (TOF amostra para G) / ( 'partícula de controle' TOF média para G) x (média 'partícula de controle' TOF de peso), onde peso é a amostra de controlo.
    6. Traçar distribuição Larvas TOF para cada estirpe incluindo amostra de controlo, no nosso caso em peso animais (Figura 3D). Medir a média e o erro padrão da média (SEM) para cada população ( Figura 5A e B).

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Resultados

Cabeça-, Cauda e Rácio de cabeça / cauda de largura são métricas robusto.

Os protocolos aqui descritos têm sido utilizados com sucesso para caracterizar a função dos reguladores e dos efectores de Rho GTPases pix-1, Pak-1 e deixou-502 durante o alongamento precoce 7.<...

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Discussão

Este protocolo descreve novas métricas para caracterizar início e fases tardias de alongamento embrionário.

Na seção 1, o passo crítico é a potencial presença de bactérias no teclado. Os embriões são hermeticamente fechado entre a almofada e a lamela durante a aquisição de imagem. Selagem a lâmina é necessário para evitar a dessecação dos animais durante a aquisição que dura mais do que duas horas. Para nosso conhecimento, nenhum dos cimentos usados ​​para montar almofadas de agarose entre l...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) do Canadá e da Fundação Canadense para Inovação. Obrigado ao Dr. Paul Mains (Universidade de Calgary, Calgary, Canadá) pela cepa let-502(sb118ts). Algumas das cepas foram fornecidas pelo Caenorhabditis Genetics Center, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ágar BioShopAGR001.500
AgaroseBioshopAGA001.500
CaCl2 (Cloreto de Cálcio)Bio Basic Inc.CT1330
ColesterolSigma-aldrichC8667
Solução de limpeza union Biometrica300-5072-000
Lamínulas de vidroFisherbrand12-542B
Corrediças de vidroFisherbrand12-552-3
Partículas de controle de altafluorescência união Biometrica310-5071-001
K2HPO4 (fosfato de potássio, dibásico)Bio Basic Inc.PB0447
K2HPO4 (fosfato de potássio, monobásico)Bio Basic Inc.PB0445
MgSO4 (sulfato de magnésio)Sigma-aldrich230391
Na2HPO4(fosfato de sódio, dibásico)Bio Basic Inc.
NaCl (cloreto de sódio)Bio Basic Inc.DB0483
Goma de Desenho Pebeo 45  mlpé bé oPDG033000qualquer loja de arte/artesanato
PeptoneBioShopPEP403.500
tampão de bainhaBiometrica300-5070-100
COPAS Biosortunião Biometrica
SDB0487União

Referências

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
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