Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

Resumo

Este artigo apresenta uma abordagem simples para fornecer não-contínuo gradientes cepas estáticas em um hidrogel de célula-carregado concêntrico para regular o alinhamento da célula para a engenharia de tecidos.

Resumo

Orientação artificial para alinhamento celular é um tema quente no campo da engenharia de tecidos. A maioria da pesquisa anterior investigou único alinhamento celular induzida por tensão em um hidrogel célula carregada por meio de complexos processos experimentais e massa em sistemas de controlo, que são normalmente associados com problemas de contaminação. Assim, neste artigo, propomos uma abordagem simples para a construção de uma estirpe de estática gradiente usando um chip fluídico com uma tampa plástica de PDMS e um substrato de vidro transparente de UV para a estimulação do comportamento celular em um hidrogel 3D. Pré-polímero de célula foto-patternable sobrecarga na câmara fluídico pode gerar uma membrana PDMS curva convexa na capa. Após a reticulação de UV, através de um micropattern circular concêntrico sob a membrana PDMS curvada e tampão de lavagem, um microambiente para investigar célula comportamentos sob uma variedade de cepas de gradientes é self estabelecida em um único chip fluídico, sem instrumentos externos. NIH3T3 células foram demonstradas após observar a mudança da tendência de alinhamento celular sob orientação de geometria, em cooperação com a estimulação de estirpe, que variou entre 15-65% no hidrogel. Após uma incubação de 3 dias, a geometria de hidrogel dominou o alinhamento da célula sob baixa tensão compressiva, onde células alinhadas ao longo da direção de alongamento de hidrogel sob alta tensão compressiva. Entre estas, as células mostraram alinhamento aleatório devido a dissipação da orientação radical de alongamento de hidrogel e a orientação de geometria do hidrogel estampado.

Introdução

Servindo como um material do bloco que imita um microambiente nativo, um hidrogel contendo a matriz extracelular (ECM) pode re-construir andaimes de tecido biomimético para apoiar o crescimento de células. Para possuir as funções de um tecido, o alinhamento da célula organizada é um requisito essencial. Vários 2D (isto é, células cultivadas sobre uma superfície) e 3D (i.e., células encapsuladas em um hidrogel) alinhamentos de células que foram alcançados pelo cultivo ou encapsular células em ou em substratos flexíveis com micro- ou nano-padrões¹. Alinhamento da célula 3D na microarquitetura é mais atraente, como o microambient....

Protocolo

1. Síntese de GelMA

1. Pese 10 g de gelatina em pó e adicione-o a um frasco de vidro com 100 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Coloque uma barra de agitação magnética no frasco e coloque-o em uma placa quente de agitação.
2. Cubra o frasco com papel alumínio para evitar a evaporação da água. Ajuste a temperatura da placa de aquecimento para 50-60 °C e o agitador a 100 rpm por 1 h para dissolver bem a gelatina em pó.
3. Depois que a gelatina se dissolver, adicione 8 mL de anidrido metacrílico muito lentamente (uma gota por segundo) usando uma pipeta. Deixar reagir a 60 °C durante 3 h.
4. Adicionar DPBS pré-aque....

Resultados

Para comparar as variações mecânicas entre cada hidrogel circular no chip estimulação concluído gradiente de tensão, medimos as larguras de linha de cada hidrogel circular em dois dos chips mesmos, com volumes de injeção de 0 µ l (figura 4a) e 40 µ l (figura 4b), respectivamente. Os alongamentos por cento em cada círculo foram calculados dividindo os alongamentos no chip 40 µ l-injetado pelas larguras de linha do hidrogel corresp.......

Discussão

Neste trabalho, relatamos sobre uma abordagem simples para comparar o comportamento de alinhamento de célula depois de hidrogel forma de orientação e de estiramento elástico. Uma membrana flexível de PDMS cria uma curvatura em forma de cúpula para a geração de diferentes alturas de hidrogel circulares concêntricos. Após liberar a pressão, a membrana PDMS aplica automaticamente a força para a micromodelados de hidrogel para formar o gradiente de tensão/alongamento, com um máximo no centro e um mínimo no limite do exterior.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de microcentrífuga preto de 1,5 mL	Argos Technologies	03-391-161	Este pode ser substituído por um tubo de cor neutra de 1,5 mL coberto com folha de alumínio
10x DPBS	Sigma-Aldrich	56064C
Alexa Fluor 488 faloidina	Invitrogen	A12379
Ponta de prova molecular	C1430	Calcein
CCD	PCO das pilhas viáveis. Imagem	Pixelfly qe
Solução de permeação de membrana celular	Sigma-Aldrich	X100	0,5% Triton X-100 para permear membrana celular
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	Coloração do núcleo celular
Membrana de diálise	Sigma-Aldrich	D9527	Corte de peso molecular = 14.000
DMEM	Gibco	11995-065
Fita dupla face	3M	8003
FBS	Hyclone	SH30071.03
Gelatina	Sigma-Aldrich	G2500	gel strength 300, tipo A, de pele suína
Gerador de corona eletrônico de alta frequência	Produtos eletrotécnicos	MODELO BD-20
Anidrido metacrílico	Sigma-Aldrich	276685
Micro seringa	Hamilton	80501	50 μ L
Microscópio	Olympus	IX71	Inclui dois conjuntos de filtros: LF405 / LP-B-000 e LF488 / LP-C-000 da máquina de plasma de
oxigênio	Semrock Plasma	Harrick PDC-001
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148	Para fixação de célula
PDMS	DOW CORNING	Sylgard 184	Mistura para fabricação de moldagem por fundição de chips PDMS
Pen-Strep	Gibco	10378-016	iniciador de penicilina / estreptomicina
	CIBA	Irgacure 2959
Iodeto de propídio	Sigma-Aldrich	P4170	Para rotular células mortas
Copo de filtração estéril	Millipore	SCGPT05RE
TMSPMA	Sigma-Aldrich	440159	Para imobilização de hidrogel
Ultrasonicator	Delta	D150H	150W, 43kHz
luz UV	DAIHAN	WUV-L10
Liofilizador	FIRSTEK	150311025
NIH3T3 (fibroblasto)	Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Indústria de Alimentos (FIRDI)	08C0011
MOXI Z Mini Contador de Células Automatizado	ORFLO	MXZ001

do de BSA Sigma A1595 para rotular o