Artigo de método

Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

DOI:

10.3791/53715

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8 de agosto de 2017

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1Institute of NanoEngineering and MicroSystems, National Tsing Hua University, 2Department of Engineering and System, National Tsing Hua University

Neste artigo

Resumo

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Este artigo apresenta uma abordagem simples para fornecer não-contínuo gradientes cepas estáticas em um hidrogel de célula-carregado concêntrico para regular o alinhamento da célula para a engenharia de tecidos.

Resumo

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Orientação artificial para alinhamento celular é um tema quente no campo da engenharia de tecidos. A maioria da pesquisa anterior investigou único alinhamento celular induzida por tensão em um hidrogel célula carregada por meio de complexos processos experimentais e massa em sistemas de controlo, que são normalmente associados com problemas de contaminação. Assim, neste artigo, propomos uma abordagem simples para a construção de uma estirpe de estática gradiente usando um chip fluídico com uma tampa plástica de PDMS e um substrato de vidro transparente de UV para a estimulação do comportamento celular em um hidrogel 3D. Pré-polímero de célula foto-patternable sobrecarga na câmara fluídico pode gerar uma membrana PDMS curva convexa na capa. Após a reticulação de UV, através de um micropattern circular concêntrico sob a membrana PDMS curvada e tampão de lavagem, um microambiente para investigar célula comportamentos sob uma variedade de cepas de gradientes é self estabelecida em um único chip fluídico, sem instrumentos externos. NIH3T3 células foram demonstradas após observar a mudança da tendência de alinhamento celular sob orientação de geometria, em cooperação com a estimulação de estirpe, que variou entre 15-65% no hidrogel. Após uma incubação de 3 dias, a geometria de hidrogel dominou o alinhamento da célula sob baixa tensão compressiva, onde células alinhadas ao longo da direção de alongamento de hidrogel sob alta tensão compressiva. Entre estas, as células mostraram alinhamento aleatório devido a dissipação da orientação radical de alongamento de hidrogel e a orientação de geometria do hidrogel estampado.

Introdução

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Servindo como um material do bloco que imita um microambiente nativo, um hidrogel contendo a matriz extracelular (ECM) pode re-construir andaimes de tecido biomimético para apoiar o crescimento de células. Para possuir as funções de um tecido, o alinhamento da célula organizada é um requisito essencial. Vários 2D (isto é, células cultivadas sobre uma superfície) e 3D (i.e., células encapsuladas em um hidrogel) alinhamentos de células que foram alcançados pelo cultivo ou encapsular células em ou em substratos flexíveis com micro- ou nano-padrões1. Alinhamento da célula 3D na microarquitetura é mais atraente, como o microambiente aproxima-se do tecido nativo construção2,3,4. Uma abordagem comum para alinhamento de célula 3D é o cue geométrico de hidrogel forma2,3. Por causa do espaço restrito para proliferação celular na direção do eixo curto, células visam alinhar ao longo da direção do eixo longo em um hidrogel micromodelados. Outra abordagem é aplicar o estiramento elástico para o hidrogel para atingir o alinhamento da célula paralelo à direção de estiramento4,5.

Estimulação biofísica em hidrogel de ECM, tais como tensão compressiva ou um campo elétrico, pode regular funções de células de tecido adequada integração, proliferação e diferenciação1,2,3. Muita pesquisa tem sido feita para investigar o comportamento celular através da aplicação de uma condição de tensão de cada vez usando múltiplo controle mecânico unidades4,6,7,8,9. Por exemplo, o uso de motores de passo mecânico espremido ou esticada sobre um hidrogel de colágeno de célula encapsulada 3D tem sido comum uma abordagem7,10. No entanto, tal equipamento controlador requer espaço extra e enfrenta a questão da contaminação na incubadora7,9,11,12. Além disso, o grande instrumento não pode dar um ambiente de controle preciso para fornecer grande reprodutibilidade13.

Considerando que o hidrogel célula-carregado é normalmente utilizadas na microescala para aplicações biomédicas, é vantajoso combinar técnicas de MEMS para gerar uma gama de tensão/estiramento estimulação para investigar simultaneamente comportamentos de célula em 3D biomimetic construções em vitro2,14,15,16,17,18. Por exemplo, usando a pressão do gás a deformar-se a membrana PDMS em chips microfluídicos pode dar origem a várias cepas, dirigindo a diferenciação celular de linhagens diferentes9,16. No entanto, existem muitos desafios técnicos, tais como processos de fabricação de chip complicado em um quarto limpo e a integração de software controle de motores, bombas, válvulas e gases comprimidos.

Neste trabalho, vamos demonstrar uma abordagem simples para obter um chip de gradiente estático-estirpe microfluidic auto-sustentável, empregando-se um padrão de hidrogel circulares concêntricos e uma membrana flexível de PDMS. Ao contrário da maioria das abordagens existentes, a nossa plataforma é um dispositivo portátil e descartável em miniatura que podem ser fabricados fora um quarto amarelo e que possui a auto-geração de cepas gradientes em hidrogel concêntricos de célula encapsulada, sem equipamentos mecânicos externos durante a incubação. Comportamentos de células de fibroblastos 3T3 influenciaram por uma combinação de hidrogel forma e uma variedade de pistas de orientação estiramento elástico foram demonstradas durante a observação de alinhamento de célula dentro de ambientes 3D de ECM-mimética no chip gradiente de tensão para 3 dias.

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Protocolo

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1. Síntese de GelMA

  1. Pese 10 g de gelatina em pó e adicione-o a um frasco de vidro com 100 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Coloque uma barra de agitação magnética no frasco e coloque-o em uma placa quente de agitação.
  2. Cubra o frasco com papel alumínio para evitar a evaporação da água. Ajuste a temperatura da placa de aquecimento para 50-60 °C e o agitador a 100 rpm por 1 h para dissolver bem a gelatina em pó.
  3. Depois que a gelatina se dissolver, adicione 8 mL de anidrido metacrílico muito lentamente (uma gota por segundo) usando uma pipeta. Deixar reagir a 60 °C durante 3 h.
  4. Adicionar DPBS pré-aquecido (40 °C) ao balão até obter um volume final de 500 ml e deixar esta mistura bem durante 15 minutos para interromper a reação.
  5. Enquanto isso, corte uma membrana de diálise (peso molecular de corte de 14 kDa) em vários tubos de 25 cm de comprimento. Mergulhe-os em água deionizada (DI) por 15 min e faça um nó para fechar uma extremidade dos tubos de diálise.
  6. Carregue a quantidade apropriada (30 - 60 mL) da solução de polímero nos tubos de diálise e feche a outra extremidade. Coloque-os em um copo de plástico de 5 L com água DI por uma semana. Renove a água DI duas vezes ao dia e mantenha a solução a 40 - 50 °C durante o processo de diálise.
  7. Colete a solução do tubo em um frasco de vidro de 500 mL. Despeje ~ 450 - 500 mL de solução em um copo de filtro de 500 mL (tamanho de poro de 0,22 μm) e aplique um vácuo no copo do filtro para forçar a solução a passar pela membrana do filtro para esterilização.
  8. Transfira o polímero esterilizado para vários tubos esterilizados de 50 mL e armazene-os em um freezer a -80 ° C por 3 a 5 dias.
  9. Liofilize o polímero a -80 °C por 1 semana usando um liofilizador para formar GelMA. Armazene o GelMA em um freezer a -80 °C.

2. Modificação do metacrilato de propila 3-(trimetoxissilil) (TMSPMA)

  1. Corte as lâminas de vidro comerciais em dois pedaços pequenos (25 mm x 37,5 mm) e mergulhe-os em solução de NaOH 0,5 M por 4 h. Lave as lâminas com uma grande quantidade de água DI.
  2. Coloque a lâmina em uma grade dentro de um recipiente de vidro com etanol a 95% e limpe usando um ultrassônico a 43 kHz por 15 min. Seque a lâmina de vidro ao ar.
  3. Mergulhe as lâminas de vidro em TMSPMA a 5% em etanol a 99,5% por 1 h.
  4. Lave as lâminas em etanol a 95%, seque as lâminas ao ar e recoza o revestimento TMSPMA em um forno a 80 ° C por 2 h.

3. Fabricação de chips

  1. Pegue uma placa de polimetilmetacrilato (PMMA) de 2 mm e uma de 0,3 mm de espessura, aplique fita dupla-face em um lado da superfície do PMMA e solte o revestimento de um lado. Deixe duas placas de PMMA de 2 mm de espessura e uma placa de 1 mm de espessura sem fita dupla-face.
  2. Corte a laser uma placa de PMMA de 2 mm de espessura sem fita dupla-face em 42 mm x 30 mm para fazer a placa inferior. Corte uma placa de PMMA de 2 mm de espessura com fita dupla-face para fazer a moldura de limite, com dimensões externas de 42 mm x 30 mm e dimensões internas de 37,5 mm x 25 mm.
  3. Corte a laser a placa de PMMA de 0,3 mm de espessura com fita dupla-face em um círculo central de 12 mm com dois canais de fluxo de 2 mm de largura e 8 mm de comprimento em lados opostos do círculo (Figura 1a).
  4. Para preparar o molde de PMMA para fundir a tampa PDMS, monte as três peças de componentes de PMMA das etapas 3.2 a 3.3 (Figura 1b) usando fita dupla face.
  5. Corte a laser uma placa de PMMA de 2 mm de espessura com fita dupla-face em uma peça de 5 cm x 5 cm com uma matriz de 3 x 3 retângulos ocos de 8,5 mm x 8,5 mm. Corte outro pedaço de 5 cm x 5 cm com uma matriz de 3 x 3 de círculos ocos de 4 mm. Corte a laser uma placa de PMMA de 1 mm de espessura sem fita dupla-face em uma placa inferior de PMMA de 5 cm x 5 cm.
  6. Prepare o molde de PMMA para fundir o plugue PDMS montando as três peças de componentes de PMMA da etapa 3.5 (Figura 1c) usando fita dupla face.
  7. Preparar a tampa e a tampa PDMS misturando correctamente 30 g de elastómero PDMS e 3 g de agente de cura PDMS; desgaseificar a mistura numa câmara de vácuo durante 1 h.
  8. Moldar 1,8-2,0 g da mistura no molde de PMMA para a tampa do PDMS e usar a quantidade apropriada para preencher cada cavidade do molde de PMMA para o plugue PDMS. Moldar 10 g de mistura de PDMS não curada em uma placa plástica em branco de 10 cm. Coloque esses moldes em uma câmara de vácuo para desgaseificar por 30 min.
  9. Catalise o PDMS por 2 h a 80 °C. Depois de resfriar o PDMS curado no molde, solte as tampas do PDMS e os plugues do PDMS dos moldes de PMMA.
  10. Faça dois furos com diâmetros de cerca de 3 mm nas extremidades dos canais de fluxo das tampas PDMS.
  11. Corte a folha PDMS moldada a partir da placa de plástico de 10 cm em vários cubos de 1 cm x 1 cm e faça um furo de 3 mm em cada cubo PDMS. Cole dois cubos PDMS não curados de 1 cm x 1 cm nas aberturas da tampa PDMS (para servir como reservatórios médios e para auxiliar no processo de cura dos padrões circulares de hidrogel gradiente) e catalise por 1 h a 80 °C.
  12. Cole as tampas do PDMS com os dois reservatórios do PDMS em uma lâmina revestida com TMSPMA, pré-tratando o lado de ligação da tampa do PDMS e a lâmina revestida com TMSPMA sob uma máquina de plasma de oxigênio (potência de RF de 30 W (modo alto) e ar comprimido de 600 mTorr) ou um gerador corona eletrônico de alta frequência (115 V, 50/60 Hz, 0.35 A) por 90 s de tratamento com plasma de O2.
  13. Entre em contato com a superfície tratada com plasma das tampas PDMS e da lâmina TMSPMA e pressione-as estreitamente para uma ligação permanente através da formação de uma ligação Si-O-Si.
    NOTA: Colocar o chip em um forno a 80 °C por 1 h pode aumentar ainda mais a força de ligação.
  14. Após o resfriamento, mergulhe os cavacos em etanol a 95% por 15 min e seque ao ar. Em seguida, esterilize os cavacos sob irradiação UV por 1 h e guarde-os em uma caixa embrulhada em papel alumínio na coifa laminar.

4. Deformação de gradiente estático no hidrogel carregado de células

  1. Imprima e corte um pedaço de fotomáscara, de 25 mm x 37,5 mm, imprimindo o layout em Figura 2b em um filme transparente. Ajuste o tamanho impresso de Figura 2b para corresponder à dimensão em Figura 2a.
  2. Prepare 100 mL de meio DMEM com 10% de FBS, 1% de Pen-Strep e 250 mL de DPBS em banho-maria a 37 °C para usar como meio de cultura de células.
  3. Pesar 25 mg de GelMA liofilizado em 0,3 mL de meio de cultura celular pré-aquecido (37 ° C) em um tubo de microcentrífuga preto de 1,5 mL. Coloque o tubo de microcentrífuga em um agitador de laboratório/placa quente até que o GelMA se dissolva no meio.
  4. Pesar 50 mg de fotoiniciador em 1 ml de DPBS num tubo de microcentrífuga e colocá-lo numa estufa a 80 °C durante 15 minutos ou até que o fotoiniciador se dissolva.
  5. Pegue 25 μL do fotoiniciador a 10% da etapa 4.4 e adicione-o ao tubo de microcentrífuga da etapa 4.3. Pipete várias vezes para misturar bem.
  6. Conte 3 x 106 células NIH 3T3 usando um contador de células automatizado. Centrifugue a suspensão a 200 x g durante 5 min, elimine o sobrenadante e ressuspenda as células em 175 μL de meio de cultura celular.
  7. Adicione a solução celular da etapa 4.6 ao tubo de microcentrífuga da etapa 4.5 para obter uma solução celular de pré-polímero de 5% de GelMA, fotoiniciador de 0,5% e ~ 6x 10 6 células 3T3 / mL. Após a mistura, coloque 100 μL de pré-polímero celular em uma microseringa de 100 μL.
  8. Alinhe manualmente (consulte Figura 3a) um pedaço da fotomáscara na lâmina inferior do chip de cepa de gradiente esterilizado e simplesmente fixe a posição usando uma pequena gota de água DI no meio. Conecte a microseringa de 100 μL carregada com solução de célula de pré-polímero à entrada do chip.
  9. Coloque (consulte Figura 3b) 50 μL de solução de célula de pré-polímero no canal de fluxo usando a microseringa e, em seguida, conecte a saída usando um plugue PDMS. Injete 40 μL extras de solução para criar uma protuberância convexa na membrana circular do PDMS.
  10. Mova o chip com a fotomáscara (inferior), a microseringa (entrada) e o plugue PDMS (saída) da etapa 4.9 sob uma lâmpada UV (365 nm, 9 mW / cm2) e exponha-o por 30 a 45 s para reticular o hidrogel circular concêntrico na câmara fluídica.
  11. Remova o plugue PDMS e a microseringa para liberar a pressão do líquido (consulte Figura 3c). Use uma seringa de 1 mL carregada com DPBS pré-aquecido para lavar as resinas não reticuladas 3 vezes, lavando da entrada para a saída.
  12. Encha o canal de fluxo com cerca de 100 μL de meio de cultura celular.
  13. Colocar a aparas numa placa de cultura esterilizada e cultivar numa atmosfera de CO2 a 5% a 37 °C durante uma semana. Atualize o meio todos os dias.
  14. Tire imagens de três chips no dia 0 após 4 h de incubação, como grupo controle, e três chips no dia 3, como conjunto experimental, usando um microscópio com objetiva de 20X. Meça a largura da linha de cada hidrogel da linha 1 à linha 12 usando um software (por exemplo, ImageJ) para calcular as deformações de compressão ( Figura 4).
    NOTA: A porcentagem de alongamento é calculada dividindo o valor da diferença de largura da linha entre 40 μL e 0 μL pela largura da linha a 40 μL.

5. Coloração de células para análise de alinhamento

  1. Use uma seringa para injetar paraformaldeído (PFA) a 4% em DPBS em RT no chip de fluxo por 15 min para a fixação do hidrogel carregado de células.
    NOTA: Cuidado. O PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.
  2. Substitua a solução por solução de permeação da membrana celular a 0,5% em DPBS por 10 min para permeabilizar a membrana celular em RT.
  3. A PBS lava as amostras 3 vezes com intervalo de 5 a 10 minutos entre as lavagens (usando uma seringa carregada, como na etapa 5.1).
  4. Carregue a solução de BSA a 1% no canal fluídico por 45-60 min em RT (usando uma seringa carregada através da porta de entrada).
  5. Adicione 1,5 mL de metanol no frasco para injetáveis com Alexa Fluor 488 faloidina para obter uma concentração final de 6,6 μM de solução estoque.
  6. Pegue 5 μL de faloidina Alexa Fluor 488 da etapa 5.5 e dilua-os em 200 μL de DPBS com 0,1% de BSA para formar uma concentração final de 0,165 μM de faloidina Alexa Fluor 488.
  7. Adicionar 200 μl da solução da mistura ao canal fluídico com uma micropipeta e incubar a lasca a 37 °C durante 45 a 60 minutos para a coloração com actina. PBS lave (como acima) as amostras 3 vezes.
  8. Prepare 1 μg / mL DAPI em PBS, flua através do chip e core os núcleos das células a 37 ° C por 5 min.
  9. Pipetar o DPBS para o canal fluídico para lavar a solução de coloração e encher novamente a câmara fluídica com a solução PBS para obter imagens com um microscópio de fluorescência.
  10. Capture as imagens fluorescentes das células 3T3 nos hidrogéis usando um microscópio de fluorescência invertida sob ampliação de 40X com um detector CCD e conjuntos de filtros de ex/em a 488/520 nm e 358/461 nm para Alexa Fluor 488 faloidina (actina) e DAPI (núcleo), respectivamente.

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Resultados

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Para comparar as variações mecânicas entre cada hidrogel circular no chip estimulação concluído gradiente de tensão, medimos as larguras de linha de cada hidrogel circular em dois dos chips mesmos, com volumes de injeção de 0 µ l (figura 4a) e 40 µ l (figura 4b), respectivamente. Os alongamentos por cento em cada círculo foram calculados dividindo os alongamentos no chip 40 µ l-injetado pelas larguras de linha do hidrogel corresp...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste trabalho, relatamos sobre uma abordagem simples para comparar o comportamento de alinhamento de célula depois de hidrogel forma de orientação e de estiramento elástico. Uma membrana flexível de PDMS cria uma curvatura em forma de cúpula para a geração de diferentes alturas de hidrogel circulares concêntricos. Após liberar a pressão, a membrana PDMS aplica automaticamente a força para a micromodelados de hidrogel para formar o gradiente de tensão/alongamento, com um máximo no centro e um mínimo no limite do exterior...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este projecto foi apoiado pela graduação aluno estudo no exterior programa (NSC-101-2917-I-007-010); o programa de Engenharia Biomédica (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); e o programa nacional de nanotecnologia (NSC-101-2120-M-007-001-), Conselho Nacional de ciência, do R.O.C, Taiwan. Os autores gostaria de agradecer a Prof Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya Paul e Ronglih Liao na Harvard Medical School para compartilhar a tecnologia de encapsulamento de hidrogel e célula.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de microcentrífuga preto de 1,5 mLArgos Technologies 03-391-161Este pode ser substituído por um tubo de cor neutra de 1,5 mL coberto com folha de alumínio
10x DPBSSigma-Aldrich56064C
Alexa Fluor 488 faloidina InvitrogenA12379 
Ponta de prova molecularC1430Calcein
CCDPCO das pilhas viáveis. ImagemPixelfly qe
Solução de permeação de membrana celularSigma-AldrichX1000,5% Triton X-100 para permear membrana celular
DAPISigma-AldrichD8417Coloração do núcleo celular
Membrana de diáliseSigma-AldrichD9527Corte de peso molecular = 14.000
DMEMGibco11995-065
Fita dupla face3M8003
FBSHycloneSH30071.03
GelatinaSigma-AldrichG2500gel strength 300, tipo A, de pele suína
Gerador de corona eletrônico de alta frequênciaProdutos eletrotécnicosMODELO BD-20
Anidrido metacrílicoSigma-Aldrich276685
Micro seringaHamilton8050150 μ L 
MicroscópioOlympusIX71Inclui dois conjuntos de filtros: LF405 / LP-B-000 e LF488 / LP-C-000 da máquina de plasma de
oxigênioSemrock PlasmaHarrick PDC-001
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148Para fixação de célula
PDMSDOW CORNINGSylgard 184Mistura para fabricação de moldagem por fundição de chips PDMS
Pen-StrepGibco10378-016iniciador de penicilina / estreptomicina
CIBAIrgacure 2959
Iodeto de propídioSigma-AldrichP4170Para rotular células mortas
Copo de filtração estérilMilliporeSCGPT05RE
TMSPMASigma-Aldrich440159Para imobilização de hidrogel
UltrasonicatorDeltaD150H150W, 43kHz
luz UVDAIHANWUV-L10
LiofilizadorFIRSTEK150311025
NIH3T3 (fibroblasto)Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Indústria de Alimentos (FIRDI)08C0011
MOXI Z Mini Contador de Células AutomatizadoORFLOMXZ001
do de BSA Sigma A1595 para rotular o

Referências

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