Este protocolo descreve um ensaio de alto rendimento para testar as preferências de postura de ovos de Drosophila melanogaster em resolução de um único animal. Este ensaio fornece uma plataforma simples, eficiente e escalável para identificar genes e componentes de circuitos que controlam um processo simples de tomada de decisão.
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Artigo de método
High Throughput Ensaio para examinar Preferências de postura de Pessoa
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Resumo
Resumo
Recentemente, a preferência de postura de Drosophila tem emergido como um modelo geneticamente tratável para estudar a base neural dos processos de tomada de decisão simples. Ao selecionar locais para depositar seus ovos, as moscas fêmeas são capazes de classificar a atratividade relativa das suas opções e escolher o "maior dos dois bens." No entanto, a maioria dos ensaios de preferência poedeiras não são práticos quando se quer ter uma abordagem sistemática rastreio genético para procurar a base circuito subjacente a este processo de tomada de decisões simples, como elas são e trabalhoso para configurar base populacional. Para aumentar a taxa de transferência de estudar de preferências de postura de ovos das fêmeas individuais, desenvolvemos câmaras personalizados que cada um pode simultaneamente ensaio preferências de postura de até trinta indivíduo voa, bem como um protocolo que garante a cada fêmea tem uma alta taxa de postura (de modo a que a sua preferência é facilmente discernível e mais convincente). Nossa abordagem é simples de executare produz resultados muito consistentes. Além disso, estas câmaras podem ser equipados com acessórios diferentes para permitir a gravação de vídeo os animais que põem ovos e fornecer luz para estudos optogenética. Este artigo fornece os planos para fabricar estas câmaras e ao processo de preparação das moscas a ser analisadas nestas câmaras.
Introdução
Drosophila melanogaster é um poderoso organismo modelo genético para estudar a base neural dos comportamentos. O rápido desenvolvimento de ferramentas genéticas para manipular neurônios de maneira direcionada e o surgimento de ferramentas sofisticadas de análise comportamental melhoraram significativamente nossa capacidade de dissecar os mecanismos de circuito subjacentes aos processos de transformação sensório-motora de vários comportamentos inatos e aprendidos1-3.
A postura de ovos de Drosophila é um modelo adequado para estudar a base neural de processos simples de tomada de decisão. Em particular, as fêmeas de Drosophila demonstraram possuir a capacidade de comparar e classificar suas opções antes de "se comprometer" a depositar um ovo em uma determinada opção4-8. Por exemplo, quando recebem apenas um substrato simples (sem sacarose) ou apenas um substrato contendo sacarose, as fêmeas aceitam prontamente qualquer uma das opções para postura de ovos. No entanto, quando apresentadas a ambas as opções, as fêmeas rejeitam robustamente o substrato de sacarose em alguns contextos7,9,10. Relativamente pouco se sabe sobre os mecanismos neurais que permitem que as fêmeas "escolham o maior de dois bens", no entanto. Um grande obstáculo tem sido a falta de um método eficiente para testar as preferências de postura de ovos, de modo que se possa usar uma abordagem sistemática de triagem genética para estudar esse problema.
Neste relatório, descrevemos o protocolo que desenvolvemos que permite que as preferências de postura de ovos das fêmeas sejam testadas em resolução de um único animal e com rendimento e consistência substancialmente melhorados em relação aos métodos anteriores. Especificamente, fornecemos os projetos para a construção das câmaras que projetamos, o protocolo para preparar as fêmeas para que cada uma esteja preparada para botar muitos ovos e o protocolo para usar as câmaras.
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Protocolo
1. Preparar Flies a ser testada
- Cultura voa em melaço padrão / media farinha de milho na incubadora a 25 ° C e 65% de humidade. Tome cuidado para não sobrecarregar os frascos. Por exemplo, colocar 8 mulheres e 6 homens para um frasco de alimentos estreita.
Nota: O "comida frasco estreito" usado aqui tem um diâmetro interno de 2,3 cm. Nós normalmente dispensados cerca de 10 ml de alimentos voar em cada frasco. A receita mosca alimentos que usamos é descrito aqui: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 dias após a eclosão do sexo feminino, preparar frascos com pasta de levedura fresca, como mostrado na Figura 1E. Fazer a pasta de levedura fresco por mistura de 6 g de fermento activo com 10 ml de ácido proprionic 0,5%. Usar uma espátula para aplicar a pasta de levedura para a parede lateral dos frascos de alimentos. Colete 30 - 35 fêmeas eclosed juntamente com 20 - 25 machos em frascos.
- Em geral, recolher os machos de as mesmas frascos em que as fêmeas são recolhidos(De forma a poupar tempo e esforço). No entanto, se há uma preocupação com a fertilidade dos machos, use machos WT vez. Além disso, pasta de levedura é importante para estimular a produção de ovos, portanto, prepará-lo diariamente.
- Manter as fêmeas recolhidas / machos a 25 ° C, 65% de humidade, a menos que as moscas são sensíveis à temperatura.
- Depois de ~ 4 - 5 dias, verifique os frascos para ver se as fêmeas estão prontas para experimentos de postura de ovos. Eles estão prontos quando a superfície do meio alimentar está molhado a partir de larvas escavando ativamente na alimentos (ver Figura 1E - F).
Nota: As fêmeas geralmente reter colocar ovos uma vez a superfície do alimento torna-se molhado e cheio de larvas. Essa etapa assegura que as fêmeas estaria pronto para colocar muitos ovos quando se deparam com substratos com textura desejada (por exemplo., ~ 1 agarose%).
2. Câmara de Construção, Montagem, Configuração Assay
- Tem uma loja de máquina construir câmaras poedeiras acrílico (Figura 1A - D). O desenho de engenharia de diferentes peças foram mostrados em Suplementar Figura 1 -. 3 imagens de alta resolução também pode ser encontrada aqui (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Inserir folhas de plástico em carregamento (topo) pedaço da câmara, como mostrado na Figura 1C. Isso serve como a superfície inferior durante o carregamento voa em arenas individuais de postura de ovos.
- Anestesiar fêmeas em uma almofada de CO 2 e carregá-los individualmente em cada arena de postura. Permitir ~ 30 min para as moscas para se recuperar do CO 2 e para se aclimatar ao novo ambiente.
- Prepare os substratos de agarose.
- Por conveniência, manter uma garrafa de premade derretido 1% de agarose, num banho de água a 55 ° C.
- Adicionar a quantidade desejada de solução de sacarose (2 M) em um tubo de 50 ml e misturando-a com a quantidade apropriada de agarose. Por exemplo, para preparar o substrato de sacarose 150 mM, PLAce 750 ul de uma solução 2 M de sacarose para dentro do tubo e, em seguida, encher o tubo com agarose para a marca de 10 mL.
- Prepara-se o substrato liso, da mesma maneira, mas adicionar água destilada em vez da solução de sacarose.
Nota: A concentração final de agarose, este protocolo é ligeiramente inferior a 1%. Na nossa experiência, a concentração exacta de agarose não interessa, desde que ele é controlado para estar dentro de ~ 0,9-1,1% e que os dois substratos são da mesma concentração de agarose.
- Aqui a peça do substrato (em baixo) da câmara de pipeta e 1000 ul de substrato de agarose em cada calha como pode ser visto na Figura 1D.
- Permitir agarose para solidificar para ~ 30 min.
- Uma vez que os substratos de agarose e moscas estão prontos, montar todas as três peças da câmara de postura e em seguida, retire as folhas de plástico.
- Coloque as câmaras em incubadoras de voar.
Nota: O comprimento de experimentos de postura de ovos pode variar dependendo expenecessidades rimental. Nós normalmente executar o experimento O / N (14-16 h). Além disso, não se observou qualquer impacto significativo de temporização circadiana nas preferências de postura de ovos. - Anestesiar fêmeas por injecção de CO 2 para dentro da câmara. Desmontar a câmara, descartar as moscas anestesiadas em necrotério mosca (ie., Um café vazia pode preenchido com um pouco de óleo de milho). Tire fotos dos resultados para manutenção de registros (ver Figura 2).
- Contar o número de ovos manualmente e o cálculo dos índices de preferência para análise. Calcule preferência índice como (N a - N b) / (N a + N b) onde N a e N b representam número de ovos no local um site vs. b, respectivamente.
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Resultados
As câmaras de postura de ovos são compostos de várias peças: um pedaço de substrato (inferior), um pedaço divisor (meio), uma carga (parte superior) peça, e 2 portas de correr (Figura 1A - D). Estas peças são usadas para independentemente moscas configuração e substratos antes experimentos poedeiras. Figura 1F mostra como frascos devem olhar quando as moscas fêmeas estão prontas para postura de ovos. Quando as moscas recebem uma escolha entre um substrat...
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Discussão
As câmaras e protocolos aqui descritos têm várias melhorias em relação ensaios poedeiras anteriores. Em primeiro lugar, aumentar a taxa de transferência de doseamento preferências dos animais individuais de forma significativa. Cada câmara pode testar 30 fêmeas individuais e leva menos de uma hora de configurar. Em segundo lugar, eles aumentam a consistência das preferências de postura em relação aos métodos anteriores. A padronização das dimensões da arena, o tamanho dos substratos de postura e distância entre substrat...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos à Duke Physics Shop, especialmente Phil Lewis, por nos ajudar a construir o aparato comportamental e os anexos e criar o desenho. Este trabalho é financiado pelo National Institutes of Health sob o número de concessão R01GM100027.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agarose UltraPura | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Banho-maria | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| LEDs vermelhos | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Câmaras de postura de ovos | Suportes de câmera personalizados | ||
| Suportes de LED | |||
| Genesee | 32-116 aC |
Referências
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Reimpressões e permissões
