HSV-Mediated expressão do transgene da quiméricos Construções para estudar a função comportamental de GPCR heterómeros em Ratos

Summary

Este artigo descreve como para injetar vetores virais no córtex frontal do rato para testar ensaios comportamentais que exigem formação heteromérica GPCR.

Abstract

O complexo receptor heteromérico entre 5-HT_2A e mGlu2 tem sido implicado em alguns dos fenótipos comportamentais em modelos de psicose em camundongos^1,2. Consequentemente, a investigação de detalhes estruturais da interação entre 5-HT_2A e mGlu2 afetando comportamentos relacionados à esquizofrenia representa uma poderosa ferramenta translacional. Como mostrado anteriormente, a resposta de contração da cabeça (HTR) em camundongos é provocada por drogas alucinógenas e essa resposta comportamental está ausente em camundongos 5-HT_2A knockout (KO)^3,4. Além disso, ao expressar condicionalmente o receptor 5-HT_2A apenas no córtex, foi demonstrado que as vias de sinalização dependentes do receptor 5-HT_2A nos neurônios piramidais corticais são suficientes para provocar o comportamento de contração da cabeça em resposta a drogas alucinógenas³. Finalmente, foi demonstrado que a resposta comportamental de contração da cabeça induzida pelos alucinógenos DOI e dietilamida do ácido lisérgico (LSD) é significativamente diminuída em camundongos mGlu2-KO⁵. Esses achados sugerem que o mGlu2 é, pelo menos em parte, necessário para os efeitos comportamentais semelhantes à psicose dependente do receptor 5-HT_2A induzidos por drogas semelhantes ao LSD. No entanto, isso não fornece evidências sobre se o complexo receptor 5-HT_2A-mGlu2 é necessário para esse fenótipo comportamental. Para resolver essa questão, construções do vírus herpes simplex (HSV) para expressar mGlu2 ou mGlu2ΔTM4N (construção quimérica mGlu2 / mGlu3 que não forma o complexo receptor 5-HT_2A-mGlu2) no córtex frontal de camundongos mGlu2-KO foram usadas para examinar se esse complexo heteromérico GPCR é necessário para os efeitos comportamentais induzidos por drogas semelhantes ao LSD⁶.

Introduction

Alucinógenos, como o LSD, a psilocibina e mescalina causar mudanças significativas na consciência humana, cognição e emoção ^7-9. Inactivação de sinalização do receptor de serotonina _5-HT2A por abordagens genéticas ou farmacológicas quer marcadamente atenuado provoca respostas comportamentais ao alucinógenos em ambos os modelos de roedores e seres humanos ^{3,10 11.} Embora alucinógenos ligar outros subtipos de receptores ^8, o receptor 5-HT _2A é considerado como necessário para a actividade comportamental única destes produtos químicos.

Grupo II receptores de glutamato metabotrópicos (ie., MGlu2 e mGlu3) têm sido alvo de considerável atenção sobre o mecanismo molecular de alucinógenos e seu papel fundamental subjacente a psicose ^12. Anteriormente, foi demonstrado que os ratinhos com nenhuma expressão de proteína de mGlu2 (ratinhos de mGlu2-KO) são insensíveis aos efeitos celulares e comportamentais de Hallucinogens ^5. Também tem sido sugerido que a 5-HT _2A e os receptores de mGlu2 formar um complexo heteromérico específico através do qual a serotonina e glutamato ligandos modular o padrão de acoplamento de proteínas G em células vivas ^1,2.

Estruturalmente, transmembranares (TM) domínios 4 e 5 do mGlu2 desempenham um papel fundamental na formação heteromérica com o receptor 5-HT _2A ^5. Adicionalmente, investigação adicional demonstrou que três resíduos localizados na extremidade intracelular de TM4 de mGlu2 são necessários para formar o heterocomplexo _do receptor _A2A -mGlu2 5-HT ⁶ em células vivas.

Com base nestes resultados observados em sistemas de expressão heterólogos, aqui descreve-se o uso da expressão de HSV-mediada de tipo selvagem de mGlu2 e mGlu2 / mGlu3 construções quiméricas no córtex frontal de ratos mGlu2-KO para testar se a formação heteromérica entre 5-HT _2A e mGlu2 é necessário para ocomportamento cabeça de contração induzida por agonistas dos receptores _5-HT2A alucinógenas.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos para a criação e dos cuidados dos animais foram realizados de acordo com o regulamento da Comissão de Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) de Icahn Faculdade de Medicina Mount Sinai. Certifique-se de usar luvas estéreis durante todo o procedimento.

1. Preparação de drogas e vírus

1. Preparação da droga
   1. Prepare 15,0 ml de cetamina / xilazina anestésico por dissolução de 1,35 ml de 100 mg / ml de cetamina e 0,75 ml de 20 mg / ml de xilazina em 12,9 mL de 0,9% solução salina. Misture bem solução.
2. Preparação de vírus
   1. Clone a mGlu2 e mGlu2ΔTM4N constrói num vector bicistrónico vírus do herpes simplex (HSV) seguindo protocolos convencionais anteriormente descrito ^6. Compactar as partículas virais, como anteriormente descrito ^6,13,14. A substituição de resíduos de Ala-677 ^4,40, Ala-681 ^4,44 e ^4,48 em Ala685 mGlu2 para Ser686 ^4,40, PhE690 ^4,44 e Gli-694 ^4,48 em mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) foram descritos anteriormente ^6.
      NOTA: foi previamente demonstrado que a construção quimérica HA-mGlu2ΔTM4N é expresso na membrana plasmática intacta com G dependente de proteína de sinalização ^6.
   2. Armazenar vectores virais em -80 ° C quando não estiver em uso. Descongelar vector viral em gelo, e, em seguida, aliquotar em alíquotas de 10 ul. Para o procedimento cirúrgico, manter em gelo.

2. Cirurgia

1. Preparação cirurgia
   1. Pesar do mouse e injetar rato com dose apropriada de cocktail de cetamina / xilazina (para detalhes, ver 1.1.1).
   2. Verifique mouse para ver se devidamente anestesiados, espremer pé e cauda de resposta à dor, se não for possível obter uma resposta, o mouse está devidamente anestesiados.
   3. Raspar a cabeça do rato a partir da base do crânio até a ponta do nariz usando cortadores. Aplique gel oftalmológico à af ratoterward para prevenir a cegueira do mouse.
   4. Carregue cada seringa no quadro estereotáxico. Depois incline porção perpendicular de cada braço da armação estereotáxica de modo que eles estão 10 graus fora do normal. Certifique-se de que os braços são inclinadas, de modo que as agulhas estão enfrentando uns aos outros.
   5. Limpar cada seringa, enchendo a agulha com 70% de etanol. Encher a agulha de, pelo menos, três vezes para garantir que a seringa é limpa.
   6. Uma vez que a agulha foi limpa, lave a agulha, preenchendo a agulha com dupla _H2O destilada Uma vez liberado, encha cada agulha com 1,3 l de dupla _H2O destilada Torcer o êmbolo da seringa para libertar 0,3 ul de dupla _H2O destilada Se contas de água na ponta da agulha, cuidadosamente limpar a água. Se nada sai da seringa, empurre o êmbolo completamente para baixo e, em seguida, repita a limpeza da seringa.
   7. Depois de encher com água, em seguida, puxe a seringa encher a seringa com0,5 l de ar.
   8. Uma vez que o ar e a água está na seringa, cuidadosamente encher a seringa, com 1,3 ml de solução de vírus. Neste ponto a que o volume total da seringa é de 2,8 ul. Novamente torcer a ponta da seringa para libertar 0,3 mL de vírus. Se os grânulos de líquido na extremidade da agulha, cuidadosamente enxugar líquido. Se nada sai da seringa, empurre o êmbolo completamente para baixo e, em seguida, repita a limpeza da seringa.
2. Cirurgia
   1. Anexar o mouse para o quadro estereotáxico, certificando-se de ajustar o quadro estereotáxico para que o crânio é plana e na horizontal. Aplicar povodine-iodo para o couro cabeludo exposto. Utilizando um bisturi, fazer uma incisão sagital na linha média do crânio dentro da área rapada exposta. Em seguida, anexar os grampos buret para a pele no local da incisão para se certificar de que o crânio permanece exposta.
   2. Use H ₂ O ₂ a dissolver o periósteo para expor as suturas docrânio. Agora que o bregma e suturas são visíveis, não se esqueça de ajustar o quadro estereotáxico para se certificar de que o crânio é nível.
   3. Alinhar as pontas das agulhas das seringas com a bregma e gravar as coordenadas do bregma. Calcular as coordenadas do que as agulhas vão ser inseridas.
      1. Para o plano Rostral-Cauldal (RC), adicionar 1,6 mm para os gravados RC coordenadas bregma (+1,6 da bregma). Para o plano dorsal-ventral (DV), subtrair 2,4 mm a partir das coordenadas bregma DV gravadas (-2,4 partir de bregma).
      2. Finalmente, para o plano Medial Lateral (ML), adicionar 2,6 mm para os gravados ML coordenadas bregma (+2,6 da bregma). Para todas as coordenadas certifique-se de gravar ambas as coordenadas esquerda e direita, como esta é uma injeção bilateral.
   4. Traga as agulhas para as coordenadas desejadas. Marque os locais de onde as agulhas estão indo para ser inserido e com uma broca, perfurar as áreas marcadas.
   5. Com um aplicador de ponta de algodão wipe afastado qualquer fragmento de sangue ou osso excesso.
   6. Traga as agulhas para o crânio onde as pontas das agulhas estão em contacto a superfície do cérebro. Em seguida, abaixe as agulhas para as coordenadas desejadas lentamente abaixá-los.
   7. Uma vez que as agulhas são as coordenadas desejadas, lentamente injectar o conteúdo da seringa, rodando o êmbolo da agulha de 0,1 ul por minuto ao longo de 5 minutos (no total 0,5 mL).
   8. Depois de a injecção ter sido feita sair da seringa no córtex durante mais 5 min.
3. Fechando Up / Cuidados
   1. Retirar as agulhas a partir do córtex de rato de forma constante e lentamente. Em seguida, retire o mouse do quadro estereotáxico.
   2. Aplicar cianoacrilato (adesivo dérmico) para as abas de base de pele a partir da incisão com uma pinça e, em seguida, agarrar as abas de pele e colocá-los em conjunto.
   3. Permitir que o cianoacrilato para secar. Coloque o rato na gaiola sobre uma almofada de aquecimento (almofada de aquecimento é opcional se o surgsuíte iCal é mantida sob RT de 37 ° C - caso contrário, não é necessário). Certifique-se de colocar o mouse sobre uma toalha de papel para se certificar de que a cama não adere ao local da cirurgia.
   4. Dependendo da duração do processo cirúrgico, assegurar que os ratos é de anestesia dentro de 30 - 60 min após o procedimento. Após a cirurgia, o animal é colocado na sua própria gaiola e monitorizado até que se torne consciente antes de retornar ao seu ambiente para recuperar. Nenhum analgésicos são usados ​​no pós-operatório, porque podem alterar os resultados de nossos experimentos, modificando alguns dos caminhos bioquímicos cerebrais. No entanto, os animais são monitorizados até recuperarem da anestesia no dia da cirurgia, e pós-operação diariamente para sinais de infecção e avaliação de dor / desconforto.

Experiência 3. Cabeça Twitch Response

1. Configuração
   1. Realizar todos os testes comportamentais 10:00 - 14:00, 2 - 3 dias após stereotaCTIC injecção de partículas virais.
   2. Dissolve-se (±) -1- (2,5-dimetoxi-4-iodofenil) -2-aminopropano (DOI) em uma solução salina a 0,9% para 2,0 mg / kg. Também prepare uma solução salina a 0,9%.
   3. Prepare uma gaiola (28 x 18 x 15 cm), sem qualquer roupa de cama e usando um tri-pod, ajustar a câmera para que a vista da câmera de vídeo está diretamente acima da gaiola.
   4. Habituar os ratos ao ambiente durante pelo menos 4 horas antes do início da experiência.
   5. Configurar uma câmera de vídeo para gravar a contração cabeça.
2. Experimentar
   1. Posicione a câmera de modo que é diretamente sobre uma gaiola. Calibrar a câmara para que toda a gaiola está no campo de visão.
   2. Pesar ratinho e rato injectar por via intraperitoneal com a dose apropriada de qualquer de 0,9% de solução salina ou DOI (0,01 ml / g). NOTA: Se um rato pesa 25 gramas, administrar a dose para um volume total de 0,25 ml.
   3. Coloque cada mouse de volta em sua gaiola casa foR 10 min. Após 10 min, rato lugar no centro da gaiola vazio e validar que não existem pontos cegos no campo de visão da câmara. Pressione gravar na câmara de vídeo. Deixe o quarto.
      NOTA: Movimentos do mouse e várias respostas comportamentais nele (... A cabeça contração muscular, zero ouvido, etc Por favor, consulte a tabela de dados suplementar 1 de Gonzalez-Maeso et al 2007 para a lista completa de respostas comportamentais induzidas por DOI) ^3, será gravado por 30 minutos. Portanto, é importante não existem pontos cegos no campo de visão gravada.
   4. Após 30 min parar a gravação no mouse câmara de vídeo e lugar de volta na gaiola lar original. Repita esse processo para cada rato.
3. revisão
   1. Tem cada revisão árbitro as fitas cegar para as condições experimentais de rato (ie., Os medicamentos utilizados durante cabeça contração experiência ou vírus utilizado durante a injeção intracraniana)). registrar manualmente cada cabeça contração througHout o vídeo.
      NOTA: Head-contração é definido como um movimento rápido balançando a cabeça conduzida por um mouse (vídeo suplementar).
   2. Para cada rato, em média, a resposta HTR final os três totais dos árbitros cegos. Em seguida, agrupar esses valores por condição experimental e realizar análises estatísticas (ie., T-test ou ANOVA).

Results

Constatações anteriores demonstram que a cabeça de contração resposta comportamental murino é confiável e robusta provocada por alucinógenos, e é ausente em 5-HT _2A ratos -Ko ^3. Além disso, demonstrou-se que a resposta da cabeça de contração induzida por alucinogénios os agonistas de 5-HT _2A e DOI LSD foi significativamente diminuída em ratinhos KO ^mGlu2-5. No entanto, apesar de resultados anteriores demonstram de forma convincente que a 5-HT <...

Discussion

Juntamente com os resultados anteriores em ratinhos KO-mGlu2 ^5, os resultados com mGlu2 e mGlu2 / mGlu3 construções quiméricas que não formam o complexo receptor _2A -mGlu2 5-HT, em células cultivadas sugerem que o 5-HT _2A -mGlu2 complexo receptor heteromérico em rato córtex frontal é necessário para induzir o comportamento cabeça de contração por agonistas dos receptores _5-HT2A alucinógenos semelhantes ao LSD. Uma limitação deste método é que ele não mede proximidade molecular...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
mGlu2 vetor do vírus herpes simplex (HSV) bicitrônico	O MIT Core		mGlu2 e o mGlu2DTM4N foram subclonados no vetor do vírus bicistrônico HSV-GFP p1005+ HSV expressando GFP sob o controle do promotor do CMV. As partículas virais foram produzidas pelo Viral Core Facility do McGovern Institute (MIT). Para mais informações, entre em contato com a diretora, Dra. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
mGlu2Δ TM4N vetor do vírus do herpes simplex (HSV) bicitrônico	O MIT Core		mGlu2 e o mGlu2DTM4N foram subclonados no vetor do vírus bicistrônico HSV-GFP p1005+ HSV expressando GFP sob o controle do promotor do CMV. As partículas virais foram produzidas pelo Viral Core Facility do McGovern Institute (MIT). Para mais informações, entre em contato com a diretora, Dra. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
GFP vetor do vírus herpes simplex bicitrônico (HSV)	O MIT Core		mGlu2 e o mGlu2DTM4N foram subclonados no vetor do vírus bicistrônico HSV-GFP p1005+ HSV expressando GFP sob o controle do promotor do CMV. As partículas virais foram produzidas pelo Viral Core Facility do McGovern Institute (MIT). Para mais informações, entre em contato com a diretora, Dra. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
Xilazina	Lloyd	List no. 4811-20ml, NADA #139-236, Código(s) NDC: 61311-481-10	1,35 ml de cetamina (100 mg/ml) + 0,75 ml de xilazina (20 mg/ml) são diluídos em 12,0 ml de solução salina a 0,9%
Cetamina	Vedco	KetaVed-10ml, NADA #200-029, Código(s) NDC: 50989-161-06	1,35 ml de cetamina (100 mg/ml) + 0,75 ml de xilazina (20 mg/ml) são diluídos em 12,0 ml de solução salina a 0,9%
Gel oftálmico	Fisher Scientific	NC0550805
Clipes Burret Fisher	Scientific	NC9268369
Lâmina cirúrgica Feather	Fisher Scientific	NC9032736
Hydrogen Peróxido	Fisher Scientific	19-898-919
Seringa Hamilton	Fisher Scientific	14815203
Hamilton™ Agulhas Removíveis de Cubo Pequeno (33 Ga)	Fisher Scientific	14816206
Micro Broca Sem Fio	Fisher Scientific	NC9089241
Dermabond Adesivo Dérmico	Fisher Scientific	NC0690470
(±)Cloridrato de -1-(2,5-dimetoxi-4-iodofenil)-2-aminopropano (DOI)	Sigma-Aldrich	42203-78-1	Dissolvido em solução salina a 0,9% na concentração de 2,0 mg/kg