HSV-Mediated expressão do transgene da quiméricos Construções para estudar a função comportamental de GPCR heterómeros em Ratos

Summary

Este artigo descreve como para injetar vetores virais no córtex frontal do rato para testar ensaios comportamentais que exigem formação heteromérica GPCR.

Abstract

O complexo receptor heteromérico entre 5-HT_2A e mGlu2 tem sido implicado em alguns dos fenótipos comportamentais em modelos de psicose em camundongos^1,2. Consequentemente, a investigação de detalhes estruturais da interação entre 5-HT_2A e mGlu2 afetando comportamentos relacionados à esquizofrenia representa uma poderosa ferramenta translacional. Como mostrado anteriormente, a resposta de contração da cabeça (HTR) em camundongos é provocada por drogas alucinógenas e essa resposta comportamental está ausente em camundongos 5-HT_2A knockout (KO)^3,4. Além disso, ao expressar condicionalmente o receptor 5-HT_2A apenas no córtex, foi demonstrado que as vias de sinalização dependentes do receptor 5-HT_2A nos neurônios piramidais corticais são suficientes para provocar o comportamento de contração da cabeça em resposta a drogas alucinógenas³. Finalmente, foi demonstrado que a resposta comportamental de contração da cabeça induzida pelos alucinógenos DOI e dietilamida do ácido lisérgico (LSD) é significativamente diminuída em camundongos mGlu2-KO⁵. Esses achados sugerem que o mGlu2 é, pelo menos em parte, necessário para os efeitos comportamentais semelhantes à psicose dependente do receptor 5-HT_2A induzidos por drogas semelhantes ao LSD. No entanto, isso não fornece evidências sobre se o complexo receptor 5-HT_2A-mGlu2 é necessário para esse fenótipo comportamental. Para resolver essa questão, construções do vírus herpes simplex (HSV) para expressar mGlu2 ou mGlu2ΔTM4N (construção quimérica mGlu2 / mGlu3 que não forma o complexo receptor 5-HT_2A-mGlu2) no córtex frontal de camundongos mGlu2-KO foram usadas para examinar se esse complexo heteromérico GPCR é necessário para os efeitos comportamentais induzidos por drogas semelhantes ao LSD⁶.

Introduction

Alucinógenos, como o LSD, a psilocibina e mescalina causar mudanças significativas na consciência humana, cognição e emoção ^7-9. Inactivação de sinalização do receptor de serotonina _5-HT2A por abordagens genéticas ou farmacológicas quer marcadamente atenuado provoca respostas comportamentais ao alucinógenos em ambos os modelos de roedores e seres humanos ^{3,10 11.} Embora alucinógenos ligar outros subtipos de receptores ^8, o receptor 5-HT _2A é considerado como necessário para a actividade comportamental única destes produtos químicos.

Grupo II receptores de glutamato metabotr....

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos para a criação e dos cuidados dos animais foram realizados de acordo com o regulamento da Comissão de Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) de Icahn Faculdade de Medicina Mount Sinai. Certifique-se de usar luvas estéreis durante todo o procedimento.

1. Preparação de drogas e vírus

1. Preparação da droga
   1. Prepare 15,0 ml de cetamina / xilazina anestésico por dissolução de 1,35 ml de 100 mg / ml de cetamina e 0,75 ml de 20 mg / ml de xilazina em 12,9 mL de 0,9% solução salina. Misture bem solução.
2. Preparação de vírus
   1. Clone a mGlu2 e mGlu2ΔTM4N c....

Results

Constatações anteriores demonstram que a cabeça de contração resposta comportamental murino é confiável e robusta provocada por alucinógenos, e é ausente em 5-HT _2A ratos -Ko ^3. Além disso, demonstrou-se que a resposta da cabeça de contração induzida por alucinogénios os agonistas de 5-HT _2A e DOI LSD foi significativamente diminuída em ratinhos KO ^mGlu2-5. No entanto, apesar de resultados anteriores demonstram de forma convincente que a 5-HT <.......

Discussion

Juntamente com os resultados anteriores em ratinhos KO-mGlu2 ^5, os resultados com mGlu2 e mGlu2 / mGlu3 construções quiméricas que não formam o complexo receptor _2A -mGlu2 5-HT, em células cultivadas sugerem que o 5-HT _2A -mGlu2 complexo receptor heteromérico em rato córtex frontal é necessário para induzir o comportamento cabeça de contração por agonistas dos receptores _5-HT2A alucinógenos semelhantes ao LSD. Uma limitação deste método é que ele não mede proximidade molecular.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
mGlu2 vetor do vírus herpes simplex (HSV) bicitrônico	O MIT Core		mGlu2 e o mGlu2DTM4N foram subclonados no vetor do vírus bicistrônico HSV-GFP p1005+ HSV expressando GFP sob o controle do promotor do CMV. As partículas virais foram produzidas pelo Viral Core Facility do McGovern Institute (MIT). Para mais informações, entre em contato com a diretora, Dra. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
mGlu2Δ TM4N vetor do vírus do herpes simplex (HSV) bicitrônico	O MIT Core		mGlu2 e o mGlu2DTM4N foram subclonados no vetor do vírus bicistrônico HSV-GFP p1005+ HSV expressando GFP sob o controle do promotor do CMV. As partículas virais foram produzidas pelo Viral Core Facility do McGovern Institute (MIT). Para mais informações, entre em contato com a diretora, Dra. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
GFP vetor do vírus herpes simplex bicitrônico (HSV)	O MIT Core		mGlu2 e o mGlu2DTM4N foram subclonados no vetor do vírus bicistrônico HSV-GFP p1005+ HSV expressando GFP sob o controle do promotor do CMV. As partículas virais foram produzidas pelo Viral Core Facility do McGovern Institute (MIT). Para mais informações, entre em contato com a diretora, Dra. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
Xilazina	Lloyd	List no. 4811-20ml, NADA #139-236, Código(s) NDC: 61311-481-10	1,35 ml de cetamina (100 mg/ml) + 0,75 ml de xilazina (20 mg/ml) são diluídos em 12,0 ml de solução salina a 0,9%
Cetamina	Vedco	KetaVed-10ml, NADA #200-029, Código(s) NDC: 50989-161-06	1,35 ml de cetamina (100 mg/ml) + 0,75 ml de xilazina (20 mg/ml) são diluídos em 12,0 ml de solução salina a 0,9%
Gel oftálmico	Fisher Scientific	NC0550805
Clipes Burret Fisher	Scientific	NC9268369
Lâmina cirúrgica Feather	Fisher Scientific	NC9032736
Hydrogen Peróxido	Fisher Scientific	19-898-919
Seringa Hamilton	Fisher Scientific	14815203
Hamilton™ Agulhas Removíveis de Cubo Pequeno (33 Ga)	Fisher Scientific	14816206
Micro Broca Sem Fio	Fisher Scientific	NC9089241
Dermabond Adesivo Dérmico	Fisher Scientific	NC0690470
(±)Cloridrato de -1-(2,5-dimetoxi-4-iodofenil)-2-aminopropano (DOI)	Sigma-Aldrich	42203-78-1	Dissolvido em solução salina a 0,9% na concentração de 2,0 mg/kg