Artigo de método

Proteínas Análise de imunofluorescência de endógenos e exógenos Centromere-cinetócoro

DOI:

10.3791/53732

⸱

3 de março de 2016

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui relatamos protocolos para detectar proteínas endógenas e exógenas de centrômero-cinetócoro em células humanas e quantificar esses níveis de proteína em centrômeros-cinetocoros por coloração imunofluorescente indireta através do uso de fixação (fixação de paraformaldeído, acetona ou metanol).

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Centrômeros" e "cinetocoros" referem-se ao local onde os cromossomos se associam ao fuso durante a divisão celular. A visualização direta das proteínas do centrômero-cinetócoro durante o ciclo celular continua sendo uma ferramenta fundamental na investigação do(s) mecanismo(s) dessas proteínas. Métodos avançados de imagem em microscopia de fluorescência fornecem resolução notável dos componentes do centrômero-cinetócoro e permitem a observação direta de componentes moleculares específicos dos centrômeros e cinetocoros. Além disso, métodos de coloração por imunofluorescência indireta (IFI) usando anticorpos específicos são cruciais para essas observações. No entanto, apesar de numerosos relatos sobre protocolos de IFI, poucos discutiram em detalhes problemas de proteínas específicas do centrômero-cinetócoro. 1-4 Aqui, relatamos protocolos otimizados para corar proteínas endógenas de centrômero-cinetócoro em células humanas usando fixação de paraformaldeído e coloração de IFI. Além disso, relatamos protocolos para detectar proteínas CENP-A exógenas marcadas com Flag em células humanas submetidas à fixação de acetona ou metanol. Esses métodos são úteis na detecção e quantificação de proteínas endógenas de centrômero-cinetócoro e proteínas CENP-A marcadas com Flag, incluindo aquelas em células humanas.

Introdução

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"centrômeros" foram classicamente definidos como regiões de recombinação meiótica suprimida em genética e, mais tarde reconhecida como a constrição primária de cromossomos mitóticos, que desempenha um papel essencial na segregação cromossômica precisas durante a mitose. "cinetócoros" foram descritos como as estruturas em camadas múltiplas que se ligam aos microtúbulos na superfície de centrómeros, conforme revelado por microscopia electrónica; "cinetócoros" foram definidos mais tarde, como o complexo macromolecular que localiza no centrômero dos cromossomos mitóticos. Apesar da divergência dramática de sequências de ADN centromérico entre os vertebrados, cinetócoro estrutura e composição são altamente conservadas. A interacção dinâmica entre os microtúbulos do fuso e do kinetochore é necessário para a segregação fiel de cromossomos durante a mitose e defeitos na função centrômero-kinetochore levam a aneuploidia e, assim, o câncer.

O centrómero na maioria dos eucariotasnão tem nenhuma sequência de ADN definida, mas é composto por matrizes grandes (0,3-5) Mb de ADN repetitivo consistindo alphoid de ADN satélite α-171-pb. Salvo em brotamento de levedura, identidade centrómero é conseguido não por a sequência de ADN mas pela presença de um nucleossoma especial que contém a variante histona H3 CenH3 (centrómero Proteína A [CENP-A] em seres humanos). 5 nucleossomas CENP-A localizar a placa interna de cinetócoros mamíferos 7 e se ligam ao DNA α-satélite 171 pb. centrômeros ativos requerem CENP-A contendo nucleossomos para dirigir o recrutamento de uma rede constitutiva associada ao centrômero (CCAN) e as proteínas cinetócoro, que em conjunto regulam a fixação dos cromossomas ao fuso mitótico e subsequente progressão do ciclo através do ponto de verificação do fuso.

À luz da evidência acima, CENP-A tem sido proposta para ser a marca epigenética do centrômero 8; No entanto, o processo pelo qual CENP-A é incorporada into de ADN centromérico e os fatores responsáveis ​​por essa incorporação ainda não foram bem caracterizados. Um domínio de direccionamento centrómero curta (CATD) reside na histona dobrar região de CENP-A, e a substituição da região correspondente de H3 com o CATD é suficiente para H3 directa ao centrómero. 9 Vários estudos sugeriram papéis funcionais para pós-translacional modificação (PTM) de CENP-A 12-16; No entanto, os mecanismos moleculares destes PTMs de CENP-A no recrutamento para centrómeros ainda não foram elucidados. Nós relatado anteriormente que a atividade ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 é necessário para CENP-A K124 ubiquitinação e localização de CENP-A para centrômeros 17.

A descoberta e caracterização de proteínas cinetócoro levaram a nova visão sobre a segregação de cromossomas. 18 mais de 100 componentes cinetócoro foram identificados em células de vertebrados por várias abordagens. 19,20 Um sobpe de como cinetócoros montar e função também vem da caracterização das funções celulares de cada rede centrômero-kinetochore proteínas e proteína-proteína dentro das células. 19 visualização direta e de imagem avançados métodos de microscopia de fluorescência fornecer notável resolução de componentes centrômero-kinetochore e permitir observação direta de componentes moleculares específicos dos centrômeros e cinetócoros. Além disso, métodos de imunofluorescência indirecta (IIF) A coloração por utilização de anticorpos específicos são cruciais para estas observações. No entanto, apesar dos numerosos relatórios sobre protocolos de IFI, alguns problemas discutidos em de proteínas específicas de centrómero-cinetócoro detalhe. 1-4 Assim, o desenvolvimento de métodos e relatórios de coloração IIF e um ensaio quantitativo para o IFI analisar especificamente cada proteína centrómero-cinetócoro é extremamente importante. Na coloração IIF, deve-se proceder com o protocolo de coloração para evitar a perda da proteína de interesse ouo resto da célula. Contudo, a fixação destrói os locais antigénicos ocasionalmente, e diferentes combinações de anticorpos para o antigénio funcionar mal com um fixador, mas muito bem com a outra, 21 e escolha de fixador depende em grande parte da proteína (s) de interesse. Portanto, diferentes métodos fixadoras são cruciais na coloração IIF de proteínas centrômero-kinetochore.

Aqui métodos optimizados de imunofluorescência indirecta (IIF) e um ensaio de coloração para dirigir a localização de proteínas de centrómero-cinetócoro endógenos, incluindo CENP-A e CENP-A proteínas exógenas Bandeira-marcadas, e a quantificação destas proteínas em células humanas têm sido desenvolvidos. Estes métodos podem ser aplicados para a análise de proteínas de centrómero-cinetócoro em outras espécies.

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Protocolo

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1. Cultura de Células e Transfecção

  1. Colocar uma tampa de vidro (22 mm x 22 mm) numa placa de poliestireno de 6 poços. coat opcionalmente uma tampa de vidro com poli-L-Lisina, 0,1% w / v, em água (veja a lista de materiais / equipamentos) para manter as células mitóticas na tampa de vidro seguindo os passos abaixo:
    Nota: As condições óptimas deve ser determinada para cada linha celular e a aplicação.
    1. superfície da cultura, de forma asséptica revestimento com poli-L-lisina, 0,1% w / v, em água (0,4 ml / poço de uma placa de 6 poços de poliestireno). Balançar suavemente para assegurar mesmo o revestimento da superfície da cultura.
    2. Após 5 min, remover a solução por aspiração e lavar cuidadosamente a superfície com o tecido estéril água grau cultura.
    3. Seco, pelo menos 2 horas antes de introduzir células e meio.
  2. Sementes células HeLa 17 ou HeLa Tet-Off células 17,22 em uma tampa de vidro (22 mm x 22 mm) colocado em uma placa de poliestireno de 6 poços. Verifique se a densidade celular é de 5,4 x 10 5 por poço. células de culturaem DMEM de alto teor de glucose com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina.
    Nota: Para obter resultados óptimos, determinar empiricamente a densidade celular para usar em semeadura.
  3. Incubar as células a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 durante 18 h.
    Nota: No caso de células HeLa Tet-Off, a transcrição do gene exógeno é activo na ausência do indutor (ou seja, a tetraciclina / doxiciclina), por conseguinte, as células de cultura, sem tetraciclina / doxiciclina e transfectar transientemente com o vector de sobre-expressão pTRM4 (Tabela 2 ), cuja transcrição é regulada pelo promotor de TRE (ver abaixo).
  4. Dezoito horas após a sementeira de células, como se segue: transfectar
    1. Adicione solução A através da mistura de 1.5 ul de siRNA de oligo (20 uM banco de recozido; Tabela 1) e / ou 2,0 ug de plasmídeo (Tabela 2) em ul meio de soro reduzido 50 (ver lista de materiais / equipamentos), e incubar à TA durante 5 min .
      Nota: Nesta análise,CA-UTR siARN (uma mistura de 5 'e 3' UTR siARN; Tabela 1) foram co-transfectados para o uso em protocolos 3 e 4 (ver discussão).
    2. Adicione solução B por mistura de 0,75 mL de reagente de transfecção I (ver a Lista de Materiais / Equipment) em 50 ul de meio de soro reduzido, e incubar à TA durante 5 min.
      Nota: Um passo opcional é a adição de 1,0 mL de reagente de transfecção II (veja a lista de materiais / equipamentos).
    3. Misturar as soluções A e B, em conjunto, e incubar à TA durante 15 min.
    4. Lavam-se as células cultivadas uma vez com PBS e, em seguida adicionar 500 ul reduzidas meio de soro a cada poço da placa de poliestireno de 6 poços. Adicionar a mistura de soluções A e B (isto é, ARN e / ou de complexo de ADN-lípido) directamente a cada um dos indivíduos bem.
      Nota: A concentração final é de 3,3 ug / ml (plasmídeo); 50 nM (siRNA).
    5. Incubar as células a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 durante 4,5 h. Alterar o médio a alto de glicose DMEM with 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina.
    6. Incubar as células a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 durante 48-72 horas após transfecção.
      Nota: Para obter resultados óptimos, o tempo de incubação para o crescimento celular antes da fixação devem ser determinados empiricamente, e depleção de proteínas e / ou expressão tem de ser confirmada por análise de Western blot (ver Protocolo 6).
    7. Se a análise celular mitótica é de interesse, adicionar o paclitaxel (10 nM) a células cultivadas 24 horas antes da fixação, ou adicionar TN16 (0,5 uM) para a cultura de células de 2,5 h antes da fixação.

2. celular Fixação e imunofluorescência coloração para detectar proteínas endógenas Centromere-cinetócoro (paraformaldeído Fixation)

  1. Preparação do agente de fixao, tampões e reagentes.
    1. Recentemente preparar 50 ml de solução de paraformaldeído a 4% em PBS, pH 7,4.
      1. Adicionar 40 ml de 1 x PBS para uma proveta de vidro numa placa de agitação numa hotte ventilada. Calor enquanto mexendog a aproximadamente 60 ° C. Adicionar 2 g de paraformaldeído em pó para o PBS aquecido.
      2. Elevar-se lentamente o pH por adição de 1 mL de NaOH 1 N, no total, porque o pó não se dissolve imediatamente.
        Nota: A solução limpa após a adição de NaOH.
      3. Uma vez paraformaldeído se dissolveu, fresco e filtrar a solução.
      4. Ajustar o pH com HCl 1 N até pH 7,4 e o volume da solução com 1 x PBS a 50 ml.
        Nota: Alíquotas da solução pode ser congelada ou armazenada a 2-8 ° C durante o tempo que uma semana. A solução deve ser arrefecida com gelo ou armazenado a 4 ° C até que esteja a ser utilizado.
    2. Preparar 50 ml de tampão de KB1, que consiste em Tris-HCl a 10, pH 7,5; NaCl 150 mM; 0,5% de BSA; e 0,5% de Triton X-100.
      Nota: BSA deve ser adicionado de fresco.
      Nota: A KB série tampão baseiam-se em tampão de KB descrita em relatórios anteriores 1,2,4.
    3. Preparar 50 ml de KB2 tampão, que consiste em Tris-HCl a 10,pH 7,5; NaCl 150 mM; e 0,5% de BSA.
      Nota: BSA deve ser adicionado de fresco.
    4. Prepare 1 ml de tampão contendo DAPI KB3 (50 ng / ml).
    5. Preparação de 100 ml de meio de montagem, que consiste em 1 mg / mL de p-fenilenodiamina; 10% de PBS, e 90% de glicerol.
      1. Ajustar o pH de 1 × PBS para 9,8 com NaOH 1 N, dissolver-se p-fenilenodiamina na solução, e, em seguida, adicionar glicerol.
      2. Loja alíquotas de 1 ml a -80 ° C. Proteger da luz.
  2. Remova o meio de cultura por aspiração em 48-72 horas pós transfecção (ver Protocolo 1) para a fixação das células. células Enxaguar uma vez com PBS. Aplicar PBS para o lado das cavidades de cultura para evitar a perturbação da superfície das células.
    Nota: O ponto de tempo óptimo para a fixação das células deve ser determinada empiricamente.
  3. Fixar as células em 4% de paraformaldeído em PBS durante 30 min a 4 ° C. Lavar as células duas vezes com tampão de KB2 para remover suficientemente residual paraformaldeído a 4%.
  4. permeaLizé as amostras em KB1 tampão durante 30 min a RT. Lavar as células uma vez com tampão de KB2, e adicionar tampão de KB2 durante 5 min à temperatura ambiente para bloquear sites adicionais de ligação não específica.
    Nota: Tampão KB1 também contribui significativamente para o bloqueio.
  5. Retirar uma tampa de vidro (22 mm x 22 mm) a partir de uma placa de poliestireno de 6 poços utilizando fórceps. Usando uma caneta barreira hidrofóbica (veja a lista de materiais / equipamentos), desenhe um quadrado verde pálido ou círculo para formar uma barreira hidrofóbica ao redor de cada amostra de tampa de vidro. Não toque nem chegar muito perto para as células com a caneta barreira hidrofóbica. Coloque a tampa de vidro em uma nova placa de poliestireno de 6 poços.
  6. Dilui-se um anticorpo primário ao centrómero ou proteína cinetocoro (razão de diluição de 1: 100 a 1: 200; ver também a Lista de Materiais / Equipment) e, ou um anticorpo anti-CENP-B (razão de diluição de 1: 400) ou um anti- anticorpo centrómero (ACA) (razão de diluição de 1: 2000) como um marcador de localização de centrómero em KB2 tampão.
    Nota: Para melhores resultados, a Concentra finaisção do anticorpo primário nesta solução deve ser determinada empiricamente.
  7. Aplicar um volume suficiente (cerca de 30 ul) do anticorpo primário diluído para mergulhar a amostra de células. Incubar a amostra de células durante 1 h a 37 ° C. Lavar as células 3 vezes com tampão de KB2.
  8. Usando tampão KB2, dilui-se um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (razão de diluição de 1: 100 a 1: 200) dirigido contra cada anticorpo primário.
    Nota: Para melhores resultados, a concentração final do anticorpo secundário nesta solução deve ser determinada empiricamente.
  9. Aplicar um volume suficiente (cerca de uma gota de 30 ul sobre a tampa de vidro) do anticorpo secundário diluído para mergulhar a amostra de células. Incubar a amostra de células durante 1 h a 37 ° C. Lavar as células KB2 5 vezes com tampão durante um período de 30 minutos (6 cinco lavagens mínimo).
    Nota: Para melhores resultados (isto é, para uma perda mínima de células), a condição de lavagem ideal deve ser determinada Empirically.
  10. Aplicar um volume suficiente de tampão KB3 contendo DAPI (50 ng / ml), para imergir a amostra de células. Incubar a amostra de células durante 5 min à TA. Lavar as células KB2 1-2 vezes com tampão.
  11. Monte a tampa de vidro que contém a amostra de células para o micro slide.
    1. Colocar uma gota de meio de montagem no centro da micro lâmina.
    2. Remover o líquido a partir da amostra celular e, usando as mãos ou os fórceps, posicionar a amostra no centro da micro lâmina. Evitar bolhas de ar.
    3. Retire o excesso de meio de montagem com uma toalha de papel.

3. celular Fixação e coloração por imunofluorescência de C-terminal marcado com bandeira de CENP-A Proteínas (acetona Fixação)

  1. Preparação
    1. Prepare gelada 75% de acetona.
    2. Recentemente preparar 50 ml de PBS (pH 7,4) contendo 0,5% de leite desnatado e 0,5% de BSA.
    3. Recentemente preparar 50 ml de PBS (pH 7,4) contendo 0,1% de leite desnatado e 0,1% de BSA.
    4. Prepare 1 ml de PBS (pH 7,4) contendo DAPI (50-100 ng / ml).
    5. Preparação de 100 ml de meio de montagem tal como descrito em 2.1.5.
  2. Remova o meio de cultura por aspiração em 48-72 horas pós transfecção (ver Protocolo 1) para a fixação das células. células Enxaguar uma vez com PBS. Aplicar PBS para o lado do poço de cultura para evitar a perturbação da superfície das células.
    Nota: O ponto de tempo óptimo para a fixação das células deve ser determinada empiricamente.
  3. Fixar as células em gelo-acetona fria a 75%, e incuba-se as células durante 10 min a -20 ° C. células de secar sobre a tampa de vidro numa hotte durante 30-60 minutos a RT.
    Nota: Para obter resultados óptimos, o período de tempo necessário para a fixação de células e de secagem deve ser determinada empiricamente.
  4. Usando a caneta barreira hidrofóbica (veja a lista de materiais / equipamentos), desenhe um quadrado verde pálido ou círculo para formar uma barreira hidrofóbica ao redor de cada amostra de tampa de vidro. Não toque nem chegar muito perto para as células com a caneta barreira hidrofóbica.
  5. bloco nonspecific locais sobre as células de ligação pela adição de PBS contendo 0,5% de leite desnatado e 0,5% de BSA durante 5 min à TA.
  6. Utilizando PBS contendo 0,1% de leite desnatado e 0,1% de BSA, dilui-se um anticorpo anti-Flag (proporção de 1: 1000 de diluição) e, ou um anticorpo anti-CENP-B (razão de diluição de 1: 200) ou ACA (proporção de 1: 2000 de diluição ) como um marcador de local centrômero.
    Nota: Para melhores resultados, a concentração final do anticorpo primário nesta solução deve ser determinada empiricamente.
  7. Aplicar um volume suficiente (cerca de 30 ul) do anticorpo primário diluído para mergulhar a amostra de células. Incubar a amostra de células durante 1 h a 37 ° C. Lavar as células 5 vezes com o tampão de bloqueio durante um período de 30 min.
    Nota: As células podem ser lavadas com PBS. Para melhores resultados (isto é, para evitar a perda de células), as condições de lavagem óptimas devem ser determinadas empiricamente.
  8. Dilui-se um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (razão de diluição de 1: 100 a 1: 200) dirigido contraa cada anticorpo primário em PBS contendo 0,1% de leite desnatado e 0,1% de BSA.
    Nota: Para melhores resultados, a concentração final do anticorpo secundário nesta solução deve ser determinada empiricamente.
  9. Aplicar um volume suficiente (cerca de 30 ul) do anticorpo secundário diluído para mergulhar a amostra de células. Incubar a amostra de células durante 1 h a 37 ° C. Lavar as células 2 vezes com PBS contendo 0,1% de leite desnatado e 0,1% de BSA.
    Nota: PBS sozinho também pode ser usada para lavar as células.
  10. Aplicar um volume suficiente de PBS contendo DAPI (50-100 ng / ml), para imergir a amostra de células. Incubar a amostra de células durante 5 min à TA. Lavar as células 1-2 vezes com PBS.
  11. Monte a tampa de vidro contendo a amostra de células para o micro de slides como descrito em 2.11.

4. Fixação celular e imunofluorescência Coloração de terminal-N marcada com Flag CENP-A Proteínas (Metanol fixação)

  1. Preparação
    1. Prepare a metanol arrefecido em gelo.
    2. Prepare TBS (pH 7,4) contendo soro de cabra a 4%.
    3. Prepare 1 ml de TBS (pH 7,4) contendo DAPI (50-100 ng / ml).
    4. Preparação de 100 ml de meio de montagem tal como descrito em 2.1.5.
  2. Remova o meio de cultura por aspiração em 48-72 horas pós transfecção (ver Protocolo 1) para a fixação das células. células Enxaguar uma vez com TBS. Aplicar TBS para o lado das cavidades de cultura para evitar a perturbação da superfície de células.
    Nota: O ponto de tempo óptimo para a fixação das células deve ser determinada empiricamente.
  3. Fixar as células em metanol arrefecida com gelo, e incuba-se as células durante 6 minutos à temperatura de -20 ° C. Lavar as células duas vezes com TBS para remover metanol residual suficientemente.
  4. Usando uma caneta barreira hidrofóbica (veja a lista de materiais / equipamentos), desenhe um quadrado verde pálido ou círculo para criar uma barreira hidrofóbica ao redor de cada amostra de tampa de vidro. Não toque nem chegar muito perto para as células com a caneta barreira hidrofóbica.
  5. Bloquear os locais de ligação não específicos no cells por TBS acrescentando contendo soro de cabra 4%. Incubar durante 10 min à TA.
  6. Dilui-se um anticorpo anti-Flag (diluição 1: 1000) e, ou um anticorpo anti-CENP-B (razão de diluição de 1: 200) ou ACA (1: 2000 razão de diluição) como um marcador de localização de centrómero em TBS contendo soro de cabra a 4% .
    Nota: Para melhores resultados, a concentração final do anticorpo primário nesta solução deve ser determinada empiricamente.
  7. Aplicar um volume suficiente (cerca de 30 ul) do anticorpo primário diluído para mergulhar a amostra de células. Incubar a amostra de células durante 1 h a 37 ° C. Lavar as células 5 vezes com o tampão de bloqueio durante um período de 30 min. Para melhores resultados (isto é, a mínima perda de células), a condição de lavagem ideal deve ser determinada empiricamente.
  8. Dilui-se um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (razão de diluição de 1: 100 a 1: 200) dirigido contra cada anticorpo primário em TBS contendo soro de cabra a 4%.
    Nota: Para melhores resultados, a finaL concentração do anticorpo secundário nesta solução deve ser determinada empiricamente.
  9. Aplicar um volume suficiente (cerca de 30 ul) do anticorpo secundário diluído para mergulhar a amostra de células. Incubar a amostra de células durante 1 h a 37 ° C. Lavar as células 3 vezes com o tampão de bloqueio.
  10. Aplicar um volume suficiente de TBS contendo DAPI (50-100 ng / ml) para imergir a amostra celular. Incubar a amostra de células durante 5 min à TA. Lavar as células 1-2 vezes com TBS.
  11. Monte a tampa de vidro que contém a amostra de células para o micro de slides como descrito em 2.11.

5. Imunofluorescência Observação Imagem, Aquisição, quantificação e análise

  1. Observe a amostra de células através de um microscópio de fluorescência motorizado equipado com uma lente de 63X e 100X imersão em óleo, uma fonte de luz compacta externa, e uma câmera CCD digital.
  2. Realizar a aquisição de imagens e processamento, incluindo deconvolução, utilizando SoftwareA, ou Softwares B1 e B2 (veja a lista de materiais / equipamentos). Por favor, veja Suplementar Código Files (5.2.1) para todos os comandos usados ​​no Software A. Para todos os comandos usados ​​em Softwares B1 e B2, consulte (5.2.2) em Supplemental arquivos de código.
  3. Usar um método previamente descrito 23-25 ​​para quantificar os sinais de proteínas de centrómero-cinetocoro (por exemplo, mantendo-se sinais de CENP-A no centrómero) com as seguintes pequenas modificações:
    1. Selecionar área das proteínas centrômero-kinetochore ea do fundo da seguinte forma:
      1. células mitóticas: (região centrômero-kinetochore) Selecionar área sobrepondo-se cromossomas corados com DAPI; (região de fundo) e fora da área cromossomos, mas dentro da célula única idênticos (região, ou seja, citosólica).
      2. celular interfase: (região centrômero-kinetochore) Selecionar área sobreposição com cromatina corada com DAPI; (Região de fundo) e fora da área da cromatina, mas dentro da célula única idênticos ( isto é, a região citosólica).
        Nota: Ver também Suplementar arquivos de código (5.2.1.4.3) ou (5.2.2.6.4) para seleção de área com Software A ou B2 Software, respectivamente.
    2. Quantificar a percentagem de sinais restantes nos centrômeros usando Software A ou B. Para esta tarefa, use a seguinte fórmula:
      Restante sinais de proteína centrômero-kinetochore no centrômero-kinetochore
      figure-protocol-1
      em que s é o brilho do sinal da área seleccionada, o que é confirmado por coloração ACA ou CENP-B; b é o brilho sinal de fundo; amostra r é os sinais de referência ou ACA CENP-B para ARNsi (s) de células tenha sido tratada com; e R ctrl é a ACA referência ou sinais de CENP-B para células Luc siRNA-transfectadas.
      Nota: Nesta análise, os sinais de CENP-B foram utilizados como sinais de referência para CUL4A e RBX1 como descrito em relatórios anteriores.
    3. Use um arquivo do Excel para esse cálculo depois de copiar e colar os dados brutos do software quantificação sinal descrito acima. Veja também Suplementar arquivos de código: (5.2.1.4) e (5.2.2.6) para obter detalhes. Um exemplo de cálculo é mostrado na Tabela 3.
  4. Analisar pelo menos 20 células para eliminar a variação na coloração e aquisição de imagem para cada nível de medição. Opcionalmente, use "valor médio" dos restantes sinais centrômero-kinetochore para cada analisados ​​celular para comparar esses valores entre diferentes proteínas centrômero-kinetochore.

6. Ocidental análise de mancha de proteína total

  1. Ressuspender as células em tampão de desnaturação A (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 50 mM; 0,5% de Nonidet P-40; 0,5% de desoxicolato; SDS 0,5%; EDTA 1 mM; e cocktail inibidor da protease livre de EDTA completo), 26 sujeita a suspensão a ultra-sons e um processo de congelação-descongelação, e medidaAs concentrações de proteína como se segue:
    1. Para o processo de sonicação, adicionar 50 ul de tampão A para as células recolhidas a partir de duas cavidades de uma placa de poliestireno de 6 poços em 48-72 horas após transfecção (ver Protocolo 1). Operar um sonicador equipado com chifre disruptor e MICROTIP (veja a lista de materiais / equipamentos) para a duração total de 15 sec-pulso intermitente (ciclo de trabalho de 50%) por uma amostra.
    2. Para o processo de congelação-descongelação, congelar as células com azoto líquido e as células descongelar à temperatura ambiente.
    3. Medir as concentrações de proteína utilizando um ensaio de proteína reagente I comercial ou II (veja a lista de materiais / equipamentos).
      Nota: Os lisados ​​são diluídos com uma relação de 01:10 na medição das concentrações de proteína, quer com o reagente I ou II. Nesta diluição, a SDS presente em tampão A mostra pouca ou nenhuma interferência nesta medição.
  2. Misturar o lisado contendo 20-30 ug de proteína total com tampão de carregamento 2 x 4 ou x SDS-PAGE. 27 Ferver as amostras durante5 min e, em seguida, carregá-los em um 12,0% -15,0% desnaturante em gel de SDS-poliacrilamida para eletroforese.
  3. Transferir as proteínas separadas por SDS-PAGE para uma membrana de PVDF, utilizando um método de transferência de Western descrito anteriormente. 17,24,27-31
    1. Bloquear os sítios de ligação não específicos sobre a membrana com leite magro a 5% em 1 x PBS, e depois incubar a membrana com soluções de anticorpos primários diluídos durante 1 h à TA. Veja a lista de materiais / equipamentos para obter informações detalhadas (por exemplo, taxa de diluição) de cada anticorpo primário.
    2. Depois de se lavar a membrana 3-4 vezes (cada 3 a 5 minutos de incubação com agitação) com tampão PBS-T (1 x PBS e 0,1% de Tween-20), incubar a membrana numa mistura de infravermelho próximo (IV) Os anticorpos secundários conjugados com corantes fluorescentes (razão de diluição de 1: 20000), anticorpos secundários conjugados DyLight (razão de diluição de 1: 20.000), e / ou a peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários (diluído em PBS-T; dilutina proporção de 1: 10000) durante 1 h à TA. Veja a lista de materiais / equipamentos para obter informações detalhadas (por exemplo, taxa de diluição) de cada anticorpo secundário.
  4. Lave a membrana 3 vezes, e, então, verificar a membrana para analisar as proteínas com o sistema de imageamento infravermelho e / ou o gerador de imagens para detecção de quimiluminescência immunoblot (veja a lista de materiais / equipamentos).
    1. Para usar o sistema de imageamento infravermelho, consulte (6.4.1) em Supplemental arquivos de código.
    2. Para utilizar o gerador de imagens quimiluminescência, consulte (6.4.2) em Supplemental arquivos de código. Use um substrato ultra-sensível reforçada quimioluminescente (ECL) (veja a lista de materiais / equipamentos) para este sistema.

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Resultados

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Análise por imunofluorescência da endógena CENP-A suporta a hipótese de que CUL4A-ligase E3 é necessário para a localização de CENP-A a centrómeros
Os nossos estudos recentes mostraram que a actividade de ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 é necessária para a ubiquitinação de lisina 124 (K124) em CENP-A e localização de CENP-A a centrómeros. 17 Inicialmente, o complexo interfase-centrómero (ICEN) foi isolado pela anti-CENP-a: imunoprecipitação de cromatina nativo...

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Discussão

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Nos últimos anos, muitos estudos têm desenvolvido diferentes ensaios de microscopia quantitativa em células fixas. 42 Progress em biologia centrômero-kinetochore muitas vezes requer uma compreensão da função específica do centrômero ou específicos de kinetochore de proteínas das quais regulação espacial-temporal subcelular reflete a evolução das funções do estas proteínas durante o ciclo celular. Portanto, aqui desenvolvemos métodos de coloração IIF e um ensaio quantitativo para o IFI analisar especificamente...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder GM68418.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Lipofectamin 2000Life Technologies/Invitrogen11668reagente de transfecção I
Lipofectamin RNAiMAXLife Technologies/Invitrogen13778reagente de transfecção II
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Meio de soro reduzido, quente em 37 & C banho-maria antes da utilização
de DMEM com elevado teor de glicose (Dulbecco») s Águia modificada' s meio)Life Technologies/BioWhittaker12-604DMEM com alto teor de glicose, quente em 37 &graus; C banho maria antes do uso
Soro Fetal Bovino, certificado, inativado por calor, origem americanaLife Technologies/Gibco10082FBS (soro fetal bovino)
Poli-L-Lisina SOLUÇÃOSIGMA-SLDRICHP 8920Poli-L-Lisina, 0,1% p/v, em água
Água Destilada UltraPuraLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Água estéril de grau de cultura de tecidos 
Micro Tampa de vidro (22 mm x 22 mm) Borracha de cobertura Surgipath105(22 mm x 22 mm) 
Cluster de Cultura de Células de 6 PoçosFisher/Corning Incorporated07-200-83Placa de poliestireno de 6 poços 
Penicilina Estreptomicina; Caneta Fisher/Gibco15-140Penicilina-estreptomicina
PAP PEN Local de ligaçãoAD100.1Caneta de barreira hidrofóbica (para uma barreira repelente de água na coloração imunofluorescente)
Paclitaxel (Taxol)SIGMA-SLDRICHT7402Taxol para análise de células mitóticas
TN-16, inibidor de microtúbulos (TN16)Enzo Life SciencesBML-T120TN16 para análise de células mitóticas
BSA (albumina de soro bovino)SIGMA-SLDRICHA7906Reagente de bloqueio
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787Detergente para permeabilização
ParaformaldeídoSIGMA-SLDRICHP6148Fixação reagant
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Para coloração nuclear
p-fenilenodiaminaSIGMA-SLDRICHP6001Para montagem de meio
VWR Micro Slides, FoscoVWR Internacional48312-013Micro slides 
Anticorpo anti-CENP-AStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Anticorpo monoclonal de camundongo; razão de diluição de 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Anticorpo anti-CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01PAnticorpo monoclonal de camundongo; razão de diluição de 1:200 (IIF, fixação de metanol/acetona)-1:400 (IIF, fixação de paraformaldeído)
Anticorpo anti-CENP-B abcamab25734Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:200 (IIF, fixação de metanol/acetona)-1:400 (IIF, fixação de paraformaldeído)
Anticorpo anticentrômero (ACA)Fitzgerald Industries International, Inc.90C-CS1058Anti-soro de centrômero humano; razão de diluição de 1:2000 (IIF)
Anticorpo anti-CENP-HBethyl LaboratoriesBL1112 (A400-007A)Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:200 (IIF)
Anticorpo anti-CENP-HBD612142Anticorpo monoclonal de camundongo; taxa de diluição de 1:200 (IIF)
Anticorpo anti-CENP-IN/A, Dr. Katusmi KitagawaN/A, Dr. Katusmi KitagawaAnticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Anticorpo anti-KNL1Novus BiologicalsNBP1-89223Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:100 (IIF)
Anticorpo anti-Hec1Novus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268Anticorpo monoclonal de camundongo; razão de diluição de 1:100 (IIF)
Anticorpo anti-Hec1GeneTexGTX110735Anticorpo policlonal de coelho; taxa de diluição de 1:100 (IIF)
Anticorpo anti-Ska1abcamab46826Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:100 (IIF)
Anticorpo anti-FlagSIGMA-ALDRICHF3165Anticorpo monoclonal de camundongo; razão de diluição de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anticorpo anti-FlagSIGMA-ALDRICHF7425Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CUL4A anticorpoN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriAnticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anticorpo anti-RBX1Cell Signaling4397Anticorpo policlonal de coelho; taxa de diluição de 1:2000 (WB)
Anticorpo anti-GAPDHChemiconMAB374Anticorpo monoclonal de camundongo; taxa de diluição de 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11001anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (anticorpo secundário purificado por afinidade)
Anticorpo secundário conjugado com fluoróforoAlexa Fluor 594 Goat Anti-MouseLife Technologies/InvitrogenA11005
Anticorpo secundário conjugado com fluoróforoAlexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit LifeTechnologies/InvitrogenA11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11012anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (anticorpo secundário purificado por afinidade)
Leite em pó desnatado (substituição aprovada para leite em pó cravo)Fisher ScientificNC9255871 (Reorder No. 190915; Lote# 90629)
Microscópio de fluorescência motorizado Leica DM IRE2 de leite desnatado Microscópio de fluorescência motorizado Leica
Lente de imersão em óleo HCX PL APO 63xLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X
imersão em óleo HCX PL APO 100x lente de imersão em óleoLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X lente de imersão em óleo
Leica EL6000 Fonte de luz compactaLeicaFonte de luz compacta externa para excitação fluorescente
ORCA-R2 Câmera CCD digital Câmera digital CCD HamamatsuC10600-10B 
Openlab versão 5.5.2 Software de Imagem Científica Perkin Elmer/ImprovisionPara observação, aquisição, quantificação e análise de imagens
Velocity versão 6.1.1 Software de análise de imagem 3D Perkin Elmer/ImprovisionPara observação, aquisição, quantificação e análise
de imagens Coquetel completo de inibidores de protease sem EDTAComprimidos de coquetel de inibidores de proteaseRoche11873580001/11836170001
PlusOne 2-D Quant KitAmersham Biosciences80-6483-56Reagente de ensaio de proteína comercial I para medição da concentração de proteína (compatível com SDS a 2%)
Ensaio de Proteína Bio-RadBio-Rad500-0006Reagente de ensaio de proteína comercial II para medição da concentração de proteína (compatível com 0,1% SDS)
Immobilon-FLEMD MilliporeIPFL00010membrana PVDF para transferência
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgGLI-COR Biosciences926-32210IR anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente (anticorpo secundário purificado por afinidade); razão de diluição de 1:20000 (IIF)
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgGLI-COR Biosciences926-32221IR anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente (anticorpo secundário purificado por afinidade); razão de diluição de 1:20000 (IIF)
IgG anti-camundongo de cabra DyLight 549Fisher ScientificPI35507anticorpo secundário conjugado com DyLightAnticorpo secundário conjugado com corante fluorescente IR (anticorpo secundário purificado por afinidade); proporção de diluição de 1:20000 (IIF)
Cabra anti-coelho DyLight 649Fisher ScientificPI35565anticorpo secundário conjugado com DyLightanticorpo secundário conjugado com corante fluorescente IR (anticorpo secundário purificado por afinidade); razão de diluição de 1:20000 (IIF)
IgG-HRP SantaCruzSC-2005anticorpo secundário conjugado com HRP de cabra anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente IR (secundário purificado por afinidade anticorpo); razão de diluição de 1:10000 (IIF)
IgG-HRPCruzSC-2004anticorpo secundário conjugado com HRP anticorpo secundário conjugado com DyLightAnticorpo secundário conjugado com corante fluorescente IR (anticorpo secundário purificado por afinidade); razão de diluição de 1:10000 (IIF)
Openlab versão 5.5.2. Software de imagem científica Improvision/PerkinElmerSoftware A
Volocity versão 6.3 Software de Análise de Imagem 3D (Volocity Acquisition)PerkinElmerSoftware B1
Volocity versão 6.3 Software de Análise de Imagem 3D (Quantificação de Volocidade)PerkinElmerSoftware B2
Branson SONIFIER 450
Sonicator Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, Sólido, Rosca de 9,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33995-325Buzina disruptora para sonicação
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33996-185Microtip para sonicação
Sistema de imagem infravermelha Odyssey CLx LI-COR BiosciencesSistema de imagem infravermelha para detecção de immunoblot
Software de Análise de Estúdio de Imagem Ver 4.0 LI-COR BiosciencesSoftware C
Molecular Imager Versadoc MP4000 System Imager de quimioluminescênciaBio-Rad
Quantidade Um software de análise 1-D Software Bio-RadD
SuperSignal West Femto Substrato de Sensibilidade MáximaThermo34095Substrato quimioluminescente aprimorado ultra-sensível (ECL)
(Anticorpo secundário purificado por afinidade) (anticorpo secundário purificado por afinidade)  lente de Santa para detecção de immunoblot

Referências

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