Artigo de método

Proteínas Análise de imunofluorescência de endógenos e exógenos Centromere-cinetócoro

DOI:

10.3791/53732

⸱

3 de março de 2016

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

Neste artigo

Resumo

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Aqui relatamos protocolos para detectar proteínas endógenas e exógenas de centrômero-cinetócoro em células humanas e quantificar esses níveis de proteína em centrômeros-cinetocoros por coloração imunofluorescente indireta através do uso de fixação (fixação de paraformaldeído, acetona ou metanol).

Resumo

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"Centrômeros" e "cinetocoros" referem-se ao local onde os cromossomos se associam ao fuso durante a divisão celular. A visualização direta das proteínas do centrômero-cinetócoro durante o ciclo celular continua sendo uma ferramenta fundamental na investigação do(s) mecanismo(s) dessas proteínas. Métodos avançados de imagem em microscopia de fluorescência fornecem resolução notável dos componentes do centrômero-cinetócoro e permitem a observação direta de componentes moleculares específicos dos centrômeros e cinetocoros. Além disso, métodos de coloração por imunofluorescência indireta (IFI) usando anticorpos específicos são cruciais para essas observações. No entanto, apesar de numerosos relatos sobre protocolos de IFI, poucos discutiram em detalhes problemas de proteínas específicas do centrômero-cinetócoro. 1-4 Aqui, relatamos protocolos otimizados para corar proteínas endógenas de centrômero-cinetócoro em células humanas usando fixação de paraformaldeído e coloração de IFI. Além disso, relatamos protocolos para detectar proteínas CENP-A exógenas marcadas com Flag em células humanas submetidas à fixação de acetona ou metanol. Esses métodos são úteis na detecção e quantificação de proteínas endógenas de centrômero-cinetócoro e proteínas CENP-A marcadas com Flag, incluindo aquelas em células humanas.

Introdução

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"centrômeros" foram classicamente definidos como regiões de recombinação meiótica suprimida em genética e, mais tarde reconhecida como a constrição primária de cromossomos mitóticos, que desempenha um papel essencial na segregação cromossômica precisas durante a mitose. "cinetócoros" foram descritos como as estruturas em camadas múltiplas que se ligam aos microtúbulos na superfície de centrómeros, conforme revelado por microscopia electrónica; "cinetócoros" foram definidos mais tarde, como o complexo macromolecular que localiza no centrômero dos cromossomos mitóticos. Apesar da divergência dramática de sequências de ADN centromérico entre os vertebrados, cinetócoro e....

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Protocolo

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1. Cultura de Células e Transfecção

  1. Colocar uma tampa de vidro (22 mm x 22 mm) numa placa de poliestireno de 6 poços. coat opcionalmente uma tampa de vidro com poli-L-Lisina, 0,1% w / v, em água (veja a lista de materiais / equipamentos) para manter as células mitóticas na tampa de vidro seguindo os passos abaixo:
    Nota: As condições óptimas deve ser determinada para cada linha celular e a aplicação.
    1. superfície da cultura, de forma asséptica revestimento com poli-L-lisina, 0,1% w / v, em água (0,4 ml / poço de uma placa de 6 poços de poliestireno). Balançar suavemente para assegurar mesmo o revestimento da superfície da cultura.
    2. Após....

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Resultados

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Análise por imunofluorescência da endógena CENP-A suporta a hipótese de que CUL4A-ligase E3 é necessário para a localização de CENP-A a centrómeros
Os nossos estudos recentes mostraram que a actividade de ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 é necessária para a ubiquitinação de lisina 124 (K124) em CENP-A e localização de CENP-A a centrómeros. 17 Inicialmente, o complexo interfase-centrómero (ICEN) foi isolado pela anti-CENP-a: imunoprecipitação de cromatina nativo.......

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Discussão

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Nos últimos anos, muitos estudos têm desenvolvido diferentes ensaios de microscopia quantitativa em células fixas. 42 Progress em biologia centrômero-kinetochore muitas vezes requer uma compreensão da função específica do centrômero ou específicos de kinetochore de proteínas das quais regulação espacial-temporal subcelular reflete a evolução das funções do estas proteínas durante o ciclo celular. Portanto, aqui desenvolvemos métodos de coloração IIF e um ensaio quantitativo para o IFI analisar especificamente.......

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder GM68418.

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Lipofectamin 2000Life Technologies/Invitrogen11668reagente de transfecção I
Lipofectamin RNAiMAXLife Technologies/Invitrogen13778reagente de transfecção II
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Meio de soro reduzido, quente em 37 & C banho-maria antes da utilização
de DMEM com elevado teor de glicose (Dulbecco») s Águia modificada' s meio)Life Technologies/BioWhittaker12-604DMEM com alto teor de glicose, quente em 37 &graus; C banho maria antes do uso
Soro Fetal Bovino, certificado, inativado por calor, origem americanaLife Technologies/Gibco10082FBS (soro fetal bovino)
Poli-L-Lisina SOLUÇÃOSIGMA-SLDRICHP 8920Poli-L-Lisina, 0,1% p/v, em água
Água Destilada UltraPuraLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Água estéril de grau de cultura de tecidos 
Micro Tampa de vidro (22 mm x 22 mm) Borracha de cobertura Surgipath105(22 mm x 22 mm) 
Cluster de Cultura de Células de 6 PoçosFisher/Corning Incorporated07-200-83Placa de poliestireno de 6 poços 
Penicilina Estreptomicina; Caneta Fisher/Gibco15-140Penicilina-estreptomicina
PAP PEN Local de ligaçãoAD100.1Caneta de barreira hidrofóbica (para uma barreira repelente de água na coloração imunofluorescente)
Paclitaxel (Taxol)SIGMA-SLDRICHT7402Taxol para análise de células mitóticas
TN-16, inibidor de microtúbulos (TN16)Enzo Life SciencesBML-T120TN16 para análise de células mitóticas
BSA (albumina de soro bovino)SIGMA-SLDRICHA7906Reagente de bloqueio
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787Detergente para permeabilização
ParaformaldeídoSIGMA-SLDRICHP6148Fixação reagant
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Para coloração nuclear
p-fenilenodiaminaSIGMA-SLDRICHP6001Para montagem de meio
VWR Micro Slides, FoscoVWR Internacional48312-013Micro slides 
Anticorpo anti-CENP-AStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Anticorpo monoclonal de camundongo; razão de diluição de 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Anticorpo anti-CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01PAnticorpo monoclonal de camundongo; razão de diluição de 1:200 (IIF, fixação de metanol/acetona)-1:400 (IIF, fixação de paraformaldeído)
Anticorpo anti-CENP-B abcamab25734Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:200 (IIF, fixação de metanol/acetona)-1:400 (IIF, fixação de paraformaldeído)
Anticorpo anticentrômero (ACA)Fitzgerald Industries International, Inc.90C-CS1058Anti-soro de centrômero humano; razão de diluição de 1:2000 (IIF)
Anticorpo anti-CENP-HBethyl LaboratoriesBL1112 (A400-007A)Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:200 (IIF)
Anticorpo anti-CENP-HBD612142Anticorpo monoclonal de camundongo; taxa de diluição de 1:200 (IIF)
Anticorpo anti-CENP-IN/A, Dr. Katusmi KitagawaN/A, Dr. Katusmi KitagawaAnticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Anticorpo anti-KNL1Novus BiologicalsNBP1-89223Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:100 (IIF)
Anticorpo anti-Hec1Novus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268Anticorpo monoclonal de camundongo; razão de diluição de 1:100 (IIF)
Anticorpo anti-Hec1GeneTexGTX110735Anticorpo policlonal de coelho; taxa de diluição de 1:100 (IIF)
Anticorpo anti-Ska1abcamab46826Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:100 (IIF)
Anticorpo anti-FlagSIGMA-ALDRICHF3165Anticorpo monoclonal de camundongo; razão de diluição de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anticorpo anti-FlagSIGMA-ALDRICHF7425Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CUL4A anticorpoN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriAnticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anticorpo anti-RBX1Cell Signaling4397Anticorpo policlonal de coelho; taxa de diluição de 1:2000 (WB)
Anticorpo anti-GAPDHChemiconMAB374Anticorpo monoclonal de camundongo; taxa de diluição de 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11001anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (anticorpo secundário purificado por afinidade)
Anticorpo secundário conjugado com fluoróforoAlexa Fluor 594 Goat Anti-MouseLife Technologies/InvitrogenA11005
Anticorpo secundário conjugado com fluoróforoAlexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit LifeTechnologies/InvitrogenA11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11012anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (anticorpo secundário purificado por afinidade)
Leite em pó desnatado (substituição aprovada para leite em pó cravo)Fisher ScientificNC9255871 (Reorder No. 190915; Lote# 90629)
Microscópio de fluorescência motorizado Leica DM IRE2 de leite desnatado Microscópio de fluorescência motorizado Leica
Lente de imersão em óleo HCX PL APO 63xLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X
imersão em óleo HCX PL APO 100x lente de imersão em óleoLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X lente de imersão em óleo
Leica EL6000 Fonte de luz compactaLeicaFonte de luz compacta externa para excitação fluorescente
ORCA-R2 Câmera CCD digital Câmera digital CCD HamamatsuC10600-10B 
Openlab versão 5.5.2 Software de Imagem Científica Perkin Elmer/ImprovisionPara observação, aquisição, quantificação e análise de imagens
Velocity versão 6.1.1 Software de análise de imagem 3D Perkin Elmer/ImprovisionPara observação, aquisição, quantificação e análise
de imagens Coquetel completo de inibidores de protease sem EDTAComprimidos de coquetel de inibidores de proteaseRoche11873580001/11836170001
PlusOne 2-D Quant KitAmersham Biosciences80-6483-56Reagente de ensaio de proteína comercial I para medição da concentração de proteína (compatível com SDS a 2%)
Ensaio de Proteína Bio-RadBio-Rad500-0006Reagente de ensaio de proteína comercial II para medição da concentração de proteína (compatível com 0,1% SDS)
Immobilon-FLEMD MilliporeIPFL00010membrana PVDF para transferência
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgGLI-COR Biosciences926-32210IR anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente (anticorpo secundário purificado por afinidade); razão de diluição de 1:20000 (IIF)
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgGLI-COR Biosciences926-32221IR anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente (anticorpo secundário purificado por afinidade); razão de diluição de 1:20000 (IIF)
IgG anti-camundongo de cabra DyLight 549Fisher ScientificPI35507anticorpo secundário conjugado com DyLightAnticorpo secundário conjugado com corante fluorescente IR (anticorpo secundário purificado por afinidade); proporção de diluição de 1:20000 (IIF)
Cabra anti-coelho DyLight 649Fisher ScientificPI35565anticorpo secundário conjugado com DyLightanticorpo secundário conjugado com corante fluorescente IR (anticorpo secundário purificado por afinidade); razão de diluição de 1:20000 (IIF)
IgG-HRP SantaCruzSC-2005anticorpo secundário conjugado com HRP de cabra anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente IR (secundário purificado por afinidade anticorpo); razão de diluição de 1:10000 (IIF)
IgG-HRPCruzSC-2004anticorpo secundário conjugado com HRP anticorpo secundário conjugado com DyLightAnticorpo secundário conjugado com corante fluorescente IR (anticorpo secundário purificado por afinidade); razão de diluição de 1:10000 (IIF)
Openlab versão 5.5.2. Software de imagem científica Improvision/PerkinElmerSoftware A
Volocity versão 6.3 Software de Análise de Imagem 3D (Volocity Acquisition)PerkinElmerSoftware B1
Volocity versão 6.3 Software de Análise de Imagem 3D (Quantificação de Volocidade)PerkinElmerSoftware B2
Branson SONIFIER 450
Sonicator Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, Sólido, Rosca de 9,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33995-325Buzina disruptora para sonicação
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33996-185Microtip para sonicação
Sistema de imagem infravermelha Odyssey CLx LI-COR BiosciencesSistema de imagem infravermelha para detecção de immunoblot
Software de Análise de Estúdio de Imagem Ver 4.0 LI-COR BiosciencesSoftware C
Molecular Imager Versadoc MP4000 System Imager de quimioluminescênciaBio-Rad
Quantidade Um software de análise 1-D Software Bio-RadD
SuperSignal West Femto Substrato de Sensibilidade MáximaThermo34095Substrato quimioluminescente aprimorado ultra-sensível (ECL)
(Anticorpo secundário purificado por afinidade) (anticorpo secundário purificado por afinidade)  lente de Santa para detecção de immunoblot

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
  2. Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N.

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Etiquetas

Immunofluorescence AnalysisCentromere Kinetochore ProteinsEndogenous Exogenous ProteinsParaformaldehyde FixationFlag tagged CENP AHuman Cell CultureIndirect Immunofluorescence StainingFluorescence MicroscopyProtein Localization QuantificationCell Fixation Protocol

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