Análise de LINE-1 retrotransposição no Núcleo de nível único

Resumo

Aqui nós utilizamos a metodologia FISH para rastrear LINE-1 retrotransposição no nível núcleos único dos spreads de cromossomos de linhas celulares HepG2 expressam de forma estável LINE-1 sintético.

Resumo

O elemento nuclear intercalado longo-1 (Linha-1 ou L1) é responsável por aproximadamente 17% do DNA presente no genoma humano. Embora a maioria dos L1s esteja inativa devido a truncamentos de 5 ', ~ 80-100 desses elementos permanecem competentes para retrotransposição e se propagam para diferentes locais ao longo do genoma por meio de intermediários de RNA. Embora se acredite que os L1s mais antigos tenham como alvo regiões ricas em AT do genoma, os alvos cromossômicos de L1s mais novos e ativos permanecem mal definidos. Aqui descrevemos a metodologia de hibridização in situ de fluorescência (FISH) que pode ser usada para rastrear padrões de inserção de L1 e taxas de incorporação ectópica de L1 no nível de núcleo único. Nesses experimentos, sondas de neomicina marcadas com isotiocianato de fluoresceína / cianina-3 (FITC / CY3) foram empregadas para rastrear a retrotransposição de L1 in vitro em células HepG2 expressando de forma estável L1 ectópica. Essa metodologia evita erros na estimativa das taxas de retrotransposição impostas pela toxicidade e leva em conta a ocorrência de múltiplas inserções em um único núcleo.

Introdução

Humano longo Intercaladas Nuclear Elemento-1 (Linha-1 ou L1) é um elemento móvel autônomo que se propaga dentro do genoma através de um "copiar e colar" mecanismo de retrotransposição. Um L1 humano típico é ~ 6 kb de comprimento e é composto por uma 5'UTR (região não traduzida) que serve como um promotor, duas grelhas de leitura abertas (ORFs): L1 e L1 -ORF1 -ORF2, e um 3'UTR com um poliA . -ORF1 cauda proteína L1 tem três domínios distintos: um domínio de bobina da bobina, ARN reconhecimento do motivo e domínio C-terminal, enquanto que a proteína L1 -ORF2 tem endonuclease, transcriptase ....

Protocolo

NOTA: Todos os passos devem ser realizados à temperatura ambiente a menos que especificado de outra forma. Consulte a seção Reagentes para obter detalhes sobre como preparar reagentes individuais.

1. Rotulagem L1 Sondas

NOTA: As sondas podem ser marcadas através de marcação química ou PCR.

1. marcação química
   1. Adicione 0,7-1% de gel de agarose em Tris-acetato-EDTA (TAE) tampão, calor num forno de microondas até derreter, permitir que o gel arrefecer, e, em seguida adicionar brometo de etídio (0,5 ug / ml). Verter em tabuleiro de gel, adicionar pentes e para permitir qu....

Resultados

Um diagrama esquemático do vector de retrotransposição L1 é apresentado na Figura 1. O vector consiste em um gene da neomicina em orientação anti-sentido para L1 ORFs que é interrompida por um intrão de globina em orientação com sentido e colada por DP Sites e SA. Quando integrado de forma estável no cromossoma, L1 ARNm é transcrito a partir do promotor de CMV e combinado L1-5'UTR (Figura 1). Durante o processamento de ARN,.......

Discussão

Metodologias como toda a sequenciação do genoma, PCR inversa e transferência de Southern foram utilizados para estudar L1 retrotransposição. Embora estas metodologias são extremamente valiosas na localização onde ocorrem inserções de L1 dentro de genomas, um desafio de confusão para todos eles, é a necessidade de programação in silico para montar sequências. A metodologia aqui descrita FISH foi concebido para complementar estes métodos, especialmente no caso dos estudos que requerem a.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sondas de Rotulagem
Go Tag DNA polimerase	Promega	M3178
GO Tag 10x tampão incolor	Promega	M3178
Individual dNTP	Sigma	DNTP10	Ajuste a concentração de dATP, dGTP, dCTP para 2  mM e dTTP para 1,5  mM em água livre de nuclease.
dUTP-16-Biotina (0,5  mM)	Roche	11093070910
dUTP-FITC (0.5  mM)	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3 (0.5  mM)	Sigma	GEPA53022
Kit de Rotulagem de PEIXES MIRUS		MIR3625
Kit de Rotulagem de PEIXES MIRUS	de PCR NucleoSpin MIR3225		MIRUS
	Qiagen	1410/0030	Qualquer reagente limpo de PCR pode ser usado no lugar do kit de limpeza de PCR NucleoSpin
de PCR			Qualquer máquina termocicladora pode ser usada para amplificar o produto de etiqueta.
Agarose	Sigma	A9539
Preparando Spreads Cromossômicos
Colcemid	Life Technologies	15212-012	Adicionar Colcemid diretamente ao meio de crescimento até uma concentração final de 0,4  µ g/ml
1  M KCl	Sigma	P9541	Diluir 1  M KCl solução para 75  Solução mM para fazer Solução Hipotônica
Solução Fixadora			Misture 3 volumes de metanol e 1 volume de ácido acético para fazer Solução Fixadora Carnoy. Faça fresco todas as vezes.
Metanol	Sigma	322415
Ácido acético	Sigma	320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolver Hoechst-33342 em PBS até a concentração final de 1  mg/ml.
Marcador de Ponto de Diamante	Thermo Scientific	750
Lâminas Foscas	Thermo Scientific	2951-001
Tripsina-EDTA (0,25%)	Life Technologies	R001100	Para detechar células, incube a célula em tripsina por 5 min e inativa com igual volume de meio completo.
Corrediças de cobertura	VWR	48366067
Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Heat Block			Qualquer bloco de calor pode ser utilizado para este fim, embora sejam recomendados blocos para aquecimento de corrediças.
Copo (600  ml)	Sigma	CLS1003600	Encha o copo com água, aqueça para ferver, use o vapor quente para estourar os cromossomos.
Microscópio Nikon	Nikon	125690	Qualquer microscópio pode ser usado para observar a qualidade da propagação.
Reagentes e Materiais para FISH
Citrato trissódico	Sigma	S1804
Criride de sódio	Sigma	S3014
Formamida	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
Detran Sulfato	Sigma	D8906
SDS	Sigma	L3771
Salmon Sperm DNA	Life Technologies	15632-011
Albumina de Soro Bovino (BSA)	Sigma	A8531
HCl (N)	Sigma	38283
Álcool Etílico	Sigma	459844
Metanol	Sigma	322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
Rnase A	Sigma	R4642
Pepsina	Sigma	P6887
Paraformaldeído (PFA)	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolver Hoechst-33342 em PBS até a concentração final de 1  mg/ml.
Cimento de Borracha/Selante Cytobond		2020-00-1
Sete Frascos Coplin	Thermo Scientific	107
Câmara Umidificada Escura	Sigma	CLS2551
Lâminas de Cobertura	VWR	48366067
Bloco de Calor Digital Seco	VWR	13259
Microscópio
20x Citrato de Sódio-Salino (20x SSC)			Combine 175 g de NaCl e 88,2  g de citrato trissódico com 800 ml de H2O. Agitar enquanto regula para pH 7. Assim que todos os sais se dissolverem, ajuste o volume para 1 L e filtre através de 0,22 µ m Papel de filtro. Armazene a 4 ° C.
1  mg/ml de Rnase A			Diluir 20x tampão SSC para 2x tampão SSC. Dissolva a RNase A em 2x tampão SSC até uma concentração final de 1  mg/ml. Faça uma nova solução todas as vezes.
Pepsina			Dissolva a pepsina (W/V) em HCl 10 mM até uma concentração final de solução a 1%. Faça sempre fresco.
4% de Paraformaldeído (4% PFA)			Pese 4,0 g de PFA na capela de exaustão, adicione 50 ml de 1xPBS, aqueça a 60  ° C enquanto mexe e ajuste o pH com gotas de NaOH até que todo o PFA se dissolva e a solução fique límpida. Ajuste o volume para 100  ml, filtre através de 0,22 µ m Papel de filtro e armazene alíquotas de 5 ml a -20  °C. Alíquota de descongelamento de PFA em 37 ° C por 10-15 min para usos subsequentes. Ajuste o tamanho do filtro dependendo da quantidade de paraformaldeído.
Tampão			de lavagem Combine 100 ml de formamida (20%) com 2,5 ml de 20x SSC, ajuste para pH 7 com 1,0 M HCl e leve o volume para 500 ml com grau molecular H2O.
Tampão			Combine 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, 0,1% de SDS e 300 ng/ml de DNA de esperma de salmão em 2x tampão SSC. A quantidade de formamida determina o quão focadas são as cromátides; titular a quantidade.
Buffer			Dilua o buffer SSC de 20x para 4x e adicione 0,2% de Tween-20 para fazer o buffer de detecção.
Tampão de bloqueio			Combine albumina de soro bovino (BSA) a 5% com Tween-20 a 0,2% em tampão SSC 4x.
		desidratante	Faça soluções de etanol de 70%, 80% e 95%.

Kit de Limpeza Máquina Carnoy de Fluorescência a 1% de hibridização de detecção Solução