Artigo de método

Transcriptoma Profiling de In-Vivo embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

DOI:

10.3791/53754

⸱

30 de janeiro de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry, 3Laboratory of Functional Genomics of Early Embryonic Development, Université Laval

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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A tecnologia de microarray permite a medição quantitativa e o perfil de expressão gênica de transcritos em todo o genoma. Portanto, este protocolo fornece um procedimento técnico otimizado em uma matriz bovina personalizada de duas cores usando embriões bovinos do Dia 7 para demonstrar a viabilidade do uso de baixa quantidade de RNA total.

Resumo

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A perda embrionária precoce é um grande contribuinte para a infertilidade em bovinos. Além disso, bovinos se tornam um modelo interessante para estudar o desenvolvimento embrionário pré-implantação humana devido ao seu processo de desenvolvimento semelhante. Embora se saiba que fatores genéticos afetam o desenvolvimento embrionário inicial, a descoberta de tais fatores tem sido um sério desafio. A tecnologia de microarray permite a medição quantitativa e o perfil de expressão gênica dos níveis de transcrição em todo o genoma. Uma das principais decisões que devem ser tomadas ao planejar um experimento de microarray é usar uma abordagem de uma ou duas cores. O design de duas cores aumenta a replicação técnica, minimiza a variabilidade, melhora a sensibilidade e a precisão, além de permitir designs de loop, definindo as amostras de referência comuns. Embora o microarray seja uma ferramenta biológica poderosa, existem armadilhas potenciais que podem atenuar seu poder. Portanto, neste artigo técnico, demonstramos um protocolo otimizado para extração de RNA, amplificação, marcação, hibridização do RNA amplificado marcado para a matriz, varredura de matriz e análise de dados usando a estratégia de análise de duas cores.

Introdução

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Perda embrionária precoce em vacas leiteiras de alta produção é um dos principais desafios para a indústria de laticínios 1, 2. Bovine tornou-se um modelo interessante para estudar o desenvolvimento pré-implantação do embrião humano devido ao seu processo de desenvolvimento semelhante 3, 4. No entanto, é necessária mais investigação para ter uma melhor compreensão sobre genes envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial de bovinos.

Depois de vinte anos desde a primeira tecnologia de microarray desenvolvido em 1995 5, o desenvolvimento da tecnologia de fabricação sonda erros de impressão reduzidos mais sofisticados e variabilidade de chips de matriz dentro e entre diferentes plataformas de microarray 6. Tecnologia de microarray melhorou amplamente resultou numa aplicação desta tecnologia em investigação clínica 7 e, mais recentemente, no embrião inicial Qavaliação ualidade 8.

A grande quantidade de material necessário para a tecnologia de microarray é a principal razão pela qual a tecnologia de microarrays inicialmente não conseguiu introduzir um número de campos de pesquisa, como o desenvolvimento embrionário inicial. Mais recentemente, métodos de amplificação de ARN foram melhorados para amplificar ARN linearmente até ao nível de sub-microgramas nanograma material de partida ARN 9. Existem vários kits de amplificação de ARN comerciais disponíveis no mercado; no entanto, os mais populares kits bem desenvolvidos estão relacionados com Ribo-Single Primer isotérmico amplificação 10 e promotor T7 conduzida 11 métodos. O mais popular de amplificação anti-sentido de ARN utiliza na transcrição in vitro com um iniciador oligo dT de ligação a um promotor de T7 na extremidade 5 '12. Esta tecnologia permite a manutenção da maior parte dos transcritos anti-sentido representativas após amplificação linear fou matrizes de hibridação 13. Este método foi adaptado para amplificar nível picograma de RNA total extraído de embriões de bovino 8.

Universal Linkage System (ULS) é o método de marcação que incorpora diretamente o DNA ou RNA amplificado com corante fluorescente ligada à platina quer Cyanine 547 ou Cyanine 647, formando uma ligação de coordenação sobre a posição N7 de guanina 14. Este método foi adaptado em investigação embriões para gerar mais estável, sem modificação ARNA amplificado em comparação com o aminoallyl ARNA modificada gerado pelo método enzimático 15. tanto métodos de corante único e rotulagem dois corantes foram adaptados usando Universal sistema de ligação em microarray. Um grande estudo comparações microarray foi que há uma boa correlação da qualidade dos dados entre as plataformas de matriz de um e dois de cor 6.

Recentemente, tanto unidade promotor T7métodos de amplificação N ARN anti-sentido e de rotulagem ULS têm sido desenvolvidos para proporcionar um protocolo mais fiável para gerar uma quantidade suficiente de materiais de alta qualidade marcado arna para hibridação microarray 8, 16. Portanto, este estudo fornece um protocolo para demonstrar algumas das etapas importantes de extração de RNA para análise de dados envolvidos em microarray de duas cores utilizando Dia 7 embriões bovinos como um exemplo.

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Protocolo

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A parte animal desse estudo foi realizado na Unidade de Investigação Metabólica da Universidade de Alberta, Edmonton, Canadá, com todos os procedimentos experimentais em animais aprovado (Protocolo # AUP00000131) pela Universidade de Alberta Animal Care e do Comitê Use, e os animais tratados de acordo ao Conselho canadense de diretrizes animal Care (1993).

1. Produção de Embriões, Isolamento de RNA total e Tratamento DNase

  1. Para protocolos experimentais de animais e de colheita de embriões se referir em nossas publicações anteriores 17, 18.
  2. Piscina e encaixe congelar embriões estágio similar de cada vaca em nitrogênio líquido e, em seguida, manter a -80 ° C até a extração de RNA.
  3. Extrair o ARN total por meio de um estojo de extracção de ARN baseada em coluna, que permite extrair o ARN a partir de amostras escala Pico (kit de informação está disponível na lista de materiais).
    NOTA: Recomendado kit contém: Condicionado Tampão, Extração Buffer, 70% de etanol, tampão de lavagem 1, tampão de lavagem 2, tampão de eluição, colunas de purificação de RNA com tubos de coleta e microtubos.
  4. Adicionar 10 ul de tampão de extracção contendo embriões de tubo e incubar durante 30 min a 42 ° C. tubo de centrifugação a 800 xg durante 2 min para recolher o extracto de células no tubo de microcentrífuga.
  5. Pipetar 250 mL de buffer Condicionado para a membrana do filtro de purificação de coluna. Incubar a coluna de purificação de ARN com tampão condicionado durante 5 min à temperatura ambiente. Centrifugar a coluna de purificação no tubo de recolha a 16.000 xg durante 1 min.
  6. Pipetar 10 ul de 70% de etanol com a mistura de ARN Tampão de Extracção e embriões. Misture bem, pipetando cima e para baixo. mistura pipeta na coluna de purificação pré-condicionados.
  7. Para ligar ARN, centrifugar a coluna de purificação de 2 min a 100 xg e segue-se imediatamente através de uma centrifugação a 16000 xg durante 30 segundos para remover o fluxo através.
  8. pipeta 10081; L de tampão de lavagem 1 para a coluna de purificação e centrifugar durante 1 min a 8000 x g.
    NOTA: DNase tratamento é recomendado se realizar a transcrição reversa ou amplificação após o isolamento do RNA.
  9. Digerir o ADN genómico direita após o passo 1.8.
    NOTA: Recomendado kit DNase está disponível na lista de materiais. kit recomendado contém: solução de DNase I e solução tampão.
  10. Prepare a mistura de incubação com DNase por mistura de 5 mL de ADNase I solução de reserva com 35 mL de buffer. Misture invertendo suavemente.
  11. Pipetar a pL de DNase mistura de incubação de 40 directamente para a membrana da coluna de purificação. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
  12. Pipetar 40 ul de tampão de lavagem 1 para a membrana da coluna de purificação e então centrifugar a 8000 xg durante 15 s.
  13. Tampão Pipetar 100 mL de lavagem 2 para a coluna de purificação e centrifugar durante 1 min a 8000 x g.
  14. Pipetar outro 100 uL de tampão de lavagem 2 para a coluna de purificação e centrifugardurante 2 minutos a 16.000 x g.
  15. Transferir a coluna de purificação para um novo tubo de microcentrifugação de 0,5 mL. Pipetar 11 ul de tampão de eluição directamente para a membrana da coluna de purificação. Para garantir a absorção máxima de tampão de eluição na membrana, tocar suavemente a ponta da pipeta para a superfície da membrana, enquanto a distribuição do tampão de eluição.
  16. Incubar a coluna durante 1 min à temperatura ambiente. Centrifugar a coluna durante 1 min a 1000 xg para distribuir tampão de eluição na coluna, e em seguida girar durante 1 min a 16.000 xg, para eluir o ARN.
  17. Use Bioanalyzer instrumento de acordo com as instruções do fabricante para avaliar a qualidade e quantidade de ARN de 19.
  18. Armazenar a amostra de ARN a -80 ° C até à sua utilização.

2. RNA amplificação e Rotulagem de Análise de Microarray

NOTA: Para o primeiro usuário tempo de trabalho com procedimentos de amplificação de RNA e de rotulagem, use cinco ng de pico-in RNA along com as amostras reais arna para controlar a medição da amplificação de ARN e hibridação de controlo de qualidade. O pico-in mix RNA contém dez in vitro sintetizados, transcrições poliadenilados em proporções predeterminadas. Quando o procedimento realizado adequadamente, as transcrições rotulados especificamente hibridizam apenas para sondas de controlo complementares em matrizes e os dados podem ser digitalizados para rastrear garantia de controle de qualidade com a auto-mínimo ou hibridação cruzada. Mais detalhes descrição sobre o procedimento cravado-in intensidades de controle e normalização após a digitalização da análise da matriz e de dados é referir-se a publicações anteriores 20, 21. O procedimento que se segue é dada para os utilizadores de microarranjos de rotina.

  1. Prepare (valor de número de ARN Integridade (NIR), pelo menos> 7,0) de 100 pg de alta qualidade amostra de ARN num volume total de 10 - 11 mL.
  2. Amplificar a amostras de ARN com um estojo de amplificação de ser capaz detrabalhar com amostras escala pico (tão pouco quanto 100 pg).
    NOTA: Recomendado informações kit de amplificação está disponível em Lista de materiais e segue as instruções do fabricante, sem qualquer modificação.
  3. Usar uma quantificação à base de fluorescência para avaliar o perfil da gama de tamanhos do ARNA amplificado.
  4. Utilizar o instrumento de espectrofotômetro (com base na absorvância a 260 e 280 nm) para medir a concentração da ARNA amplificado.
  5. Armazenar o ARNA amplificado a -80 ° C até estar pronto para rotulagem.
  6. Use 2 mg de RNA amplificado para marcação fluorescente de acordo com o guia do usuário ULS ARNA kit rotulagem.
    NOTA: Uma vez que Cyanine 547 e 647 Cyanine corante são sensíveis a foto-degradação e Cyanine 647 corante é facilmente degradada pelo ozono, o procedimento de marcação tem lugar em uma quantidade mínima de luz e sob um ambiente livre de ozono.
  7. Ligue a caixa de ozono (Figura 1A) até que o nível de ozono é de 0,001 ppm.
  8. fazer a configuração de reacção dentro da caixa de ozono (Figura 1B) por adição de 2 ul de Cianina 547 ou Cianina 647, 2 uL de tampão de marcação, e, em seguida, ajustar para um volume final de 20 mL com água sem RNase sob a luz de segurança. Adicionar filtro de câmara escura para a fonte de luz.
  9. Misturar suavemente e incuba-se os tubos em um termociclador a 85 ° C durante 15 min. Colocar as amostras em gelo durante pelo menos 1 min. Girar para baixo para recolher o conteúdo de tubos, antes de prosseguir com o estojo de extracção de ARN, excepto passos relacionados com tratamento de DNase (1,9-1,11), para limpar o ARN amplificado Cy-corante-rotulados.
  10. Utilizar o instrumento espectrofotómetro para medir e determinar a concentração de ARN amplificado marcado e manter o ARNA marcado à temperatura de -80 ° C no máximo durante 3 dias antes da utilização.

3. Microarray hibridação e de lavagem

NOTA: Os seguintes passos importantes são adaptados de acordo com duas cores à base de Microarray Gene Expression Análise de Protocolo (versão6.5, maio de 2010).

  1. Adicionar uma quantidade igual de 825 ng de cada Cyanine 547- e Cyanine 647 marcado ARNA e misture com 25x e 10x fragmentação buffers de bloqueio.
  2. Aquecer a mistura a 60 ° C durante 15 minutos e arrefece-se em gelo durante 1 min.
  3. Adicionar uma quantidade igual de 2x tampão de hibridização e misturar bem.
  4. Centrifuga-se a 13000 rpm, em seguida, a mistura está pronta para hibridação.
  5. Carga de 100 mL da mistura sobre a lâmina de matriz e vedar a corrediça no interior da câmara de hibridação.
  6. Carregar a câmara montada no forno de hibridação durante 17 h a 65 ° C em rotação a 10 rpm em forno.
  7. Lave as matrizes de acordo com o protocolo com tratamento de protecção de ozono por imersão em solução de estabilização e secagem durante 30 s.
  8. Retirar as matrizes a partir da solução e certificar-se da superfície da matriz é seca com as partículas de poeira não há

4. Digitalização Microarray Deslize

  1. Mantenha as matrizes no lugar escuro e ligue scannER até que esteja pronta a utilizar (15 min de tempo de espera).
  2. Coloque o código de barras matriz na esquerda, no scanner e iniciar a digitalização. Fazer a análise local de acordo com o guia do usuário do software e salvar os dados como (GPR) formato de arquivo.

5. Análise Estatística

  1. Faça o download do software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Clique em "dados brutos de importação" e carregar os arquivos de GPR em FlexArray.
  2. Realizar a normalização e a análise estatística, se necessário, seguindo as instruções. Nota: o cálculo do limiar para a seleção local positiva neste estudo como foi descrito anteriormente 22.
  3. Selecione no menu suspenso o manual do visualizador gráfico da FlexArray para ver todos os pontos cruzados e sinais de fundo. Nota: Um quadro semelhante das cravado nos controlos, após hibridação com o micro-arranjo pode ser visto no estudo anterior 8.
  4. Selecione umanormalização Loess dentro matriz seguinte por um quantil entre o processo de matrizes normalização do FlexArray suspensa manual de conformidade.
  5. Exportar todos os dados normalizados de FlexArray em um arquivo do Excel para posterior utilização.

6. Análise Bioinformatics

A anotação original das sequências de sondas de transcrições específicas de embriões bovinos (BESTv1) microarray foi descrita anteriormente 8. No presente estudo, foram obtidos 20,403 símbolos único gene (GS) ( Suplemento File1 ) através do Sistema de Gestão EmbryoGENE Laboratório de Informação (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Uma lista de 6.765 genes únicos ( Suplemento File2 ) foi seleccionado e correspondiam aos sinais positivos após todo processo de normalização de microarray (Passo 50,5) a partir do dia 7 gene embriões perfil de expressão bovina. Limite sinal positivo foi calculado com base na publicação permeável 16 da intensidade do sinal de um valor A.

  1. Para realizar a análise funcional com PANTHER (análise de proteínas através de relações evolucionárias) Classification System 23, 24, abra o seguinte link (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
  2. Carregar uma lista de 6.765 GS específicas do embrião para identificar processo biológico específico durante o desenvolvimento embrionário por meio do teste sobre-representação estatística e usar a configuração padrão do Bos taurus (todos os genes no banco de dados), como lista de referência 25.
    NOTA: Este permite a identificação de processos de desenvolvimento relacionadas com a de os termos GO que são estatisticamente super ou sub-expresso utilizando um teste binomial.
  3. Definir limite P-valor em <0,05 como padrão de software. Os dados podem ser baixados e exported em arquivo de Excel para posterior selecção 16.

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Resultados

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Um resultado representativo de ARN total e amplificado ARNA desde o dia 7 embriões é mostrada na Figura 3 e resumidos no Quadro 1.

integridade do RNA e do perfil pode ser avaliada após a extração do RNA. Avaliação da qualidade do ARN podia ser realizado por instrumento Bioanalyzer (Figura 3A) e apenas as amostras com um valor superior a 7,0 RIN estão qualificados para ser usad...

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Discussão

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O primeiro problema a realizar análise de microarray utilizando Dia 7 embriões não é obter quantidades suficientes de ARN de alta qualidade para estudar a expressão do gene. extração de RNA fenol tradicional / clorofórmio e método de precipitação de etanol não é recomendado para o dia 7 embriões, resultando em baixo rendimento e possíveis fenol restante inibir reação de amplificação de ARN. Em vez disso, um método baseado em coluna padrão é melhor para isolar o ARN total e, em seguida, eluir o ARN com tampão de eluição ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Pesquisa apoiada pela Agência de Pecuária e Carne de Alberta, Alberta Inova - BioSolutions, Ramo de Pesquisa de Leite e Pecuária de Alberta, Agricultura e Silvicultura de Alberta.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de Isolamento de RNA PicoPuredeApplied Biosystems
(50)Qiagen79254
Agilent RNA 6000 Kit PicoAgilent Technologies5067-1513
Arcturus RiboAmp HS PLUS KitBioanalyzer KIT0505
2100 da Applied BiosystemsAgilent TechnologiesG2940CA
Fita de Tela de RNAAgilent Technologies5067-5576
ULS Kit de Rotulagem FluorescenteKreatech DiagnosticsEA-021
Microarrays de Expressão Gênica PersonalizadaAgilent TechnologiesG2514F
Agilent Gene Expression tampão de lavagem 1Agilent TechnologiesParte #5188-5325
Agilent Gene Expression tampão de lavagem 2Peças da Agilent TechnologiesParte #5188-5326
2x Hi-RPM Buffer de HibridizaçãoAgilent Technologies  Parte #5190-0403
25x Buffer de fragmentosParte#5185-5974
10x Agente de Bloqueio GEAgilent TechnologiesParte #5188-5281
Solução de estabilização e secagemAgilent Technologies  Parte #5185-5979
Lâminas de junta habilitadas pela tecnologia Agilent SureHybAgilent TechnologiesG2524-60012Pacote de 20 lâminas de junta, 4 microarrays/lâmina
Kit de Pico de RNA de Duas CoresAgilent Technologies  Cat# 5188-5279
GenePix 4000B scanner de matrizMolecular DevicesGENEPIX 4000B-U
Livre de OzônioBioTrayOFB_100x200
arquivo GALAgilent Technologies-
Conjunto DNase Livre de RNase KIT0204 da Instrumentos Caixa

Referências

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