Transcriptoma Profiling de In-Vivo embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

Resumo

A tecnologia de microarray permite a medição quantitativa e o perfil de expressão gênica de transcritos em todo o genoma. Portanto, este protocolo fornece um procedimento técnico otimizado em uma matriz bovina personalizada de duas cores usando embriões bovinos do Dia 7 para demonstrar a viabilidade do uso de baixa quantidade de RNA total.

Resumo

A perda embrionária precoce é um grande contribuinte para a infertilidade em bovinos. Além disso, bovinos se tornam um modelo interessante para estudar o desenvolvimento embrionário pré-implantação humana devido ao seu processo de desenvolvimento semelhante. Embora se saiba que fatores genéticos afetam o desenvolvimento embrionário inicial, a descoberta de tais fatores tem sido um sério desafio. A tecnologia de microarray permite a medição quantitativa e o perfil de expressão gênica dos níveis de transcrição em todo o genoma. Uma das principais decisões que devem ser tomadas ao planejar um experimento de microarray é usar uma abordagem de uma ou duas cores. O design de duas cores aumenta a replicação técnica, minimiza a variabilidade, melhora a sensibilidade e a precisão, além de permitir designs de loop, definindo as amostras de referência comuns. Embora o microarray seja uma ferramenta biológica poderosa, existem armadilhas potenciais que podem atenuar seu poder. Portanto, neste artigo técnico, demonstramos um protocolo otimizado para extração de RNA, amplificação, marcação, hibridização do RNA amplificado marcado para a matriz, varredura de matriz e análise de dados usando a estratégia de análise de duas cores.

Introdução

Perda embrionária precoce em vacas leiteiras de alta produção é um dos principais desafios para a indústria de laticínios ^{1, 2.} Bovine tornou-se um modelo interessante para estudar o desenvolvimento pré-implantação do embrião humano devido ao seu processo de desenvolvimento semelhante ^{3, 4.} No entanto, é necessária mais investigação para ter uma melhor compreensão sobre genes envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial de bovinos.

Depois de vinte anos desde a primeira tecnologia de microarray desenvolvido em 1995

Protocolo

A parte animal desse estudo foi realizado na Unidade de Investigação Metabólica da Universidade de Alberta, Edmonton, Canadá, com todos os procedimentos experimentais em animais aprovado (Protocolo # AUP00000131) pela Universidade de Alberta Animal Care e do Comitê Use, e os animais tratados de acordo ao Conselho canadense de diretrizes animal Care (1993).

1. Produção de Embriões, Isolamento de RNA total e Tratamento DNase

1. Para protocolos experimentais de animais e de colheita de embriões se referir em nossas publicações anteriores ^{17, 18.}
2. Piscina e encaixe congelar embriões estág....

Resultados

Um resultado representativo de ARN total e amplificado ARNA desde o dia 7 embriões é mostrada na Figura 3 e resumidos no Quadro 1.

integridade do RNA e do perfil pode ser avaliada após a extração do RNA. Avaliação da qualidade do ARN podia ser realizado por instrumento Bioanalyzer (Figura 3A) e apenas as amostras com um valor superior a 7,0 RIN estão qualificados para ser usad.......

Discussão

O primeiro problema a realizar análise de microarray utilizando Dia 7 embriões não é obter quantidades suficientes de ARN de alta qualidade para estudar a expressão do gene. extração de RNA fenol tradicional / clorofórmio e método de precipitação de etanol não é recomendado para o dia 7 embriões, resultando em baixo rendimento e possíveis fenol restante inibir reação de amplificação de ARN. Em vez disso, um método baseado em coluna padrão é melhor para isolar o ARN total e, em seguida, eluir o ARN com tampão de eluição .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Isolamento de RNA PicoPure	de		Applied Biosystems
(50)	Qiagen	79254
Agilent RNA 6000 Kit Pico	Agilent Technologies	5067-1513
Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit	Bioanalyzer KIT0505
2100 da Applied Biosystems	Agilent Technologies	G2940CA
Fita de Tela de RNA	Agilent Technologies	5067-5576
ULS Kit de Rotulagem Fluorescente	Kreatech Diagnostics	EA-021
Microarrays de Expressão Gênica Personalizada	Agilent Technologies	G2514F
Agilent Gene Expression tampão de lavagem 1	Agilent Technologies	Parte #5188-5325
Agilent Gene Expression tampão de lavagem 2	Peças da Agilent Technologies	Parte #5188-5326
2x Hi-RPM Buffer de Hibridização	Agilent Technologies	Parte #5190-0403
25x Buffer de fragmentos	Parte	#5185-5974
10x Agente de Bloqueio GE	Agilent Technologies	Parte #5188-5281
Solução de estabilização e secagem	Agilent Technologies	Parte #5185-5979
Lâminas de junta habilitadas pela tecnologia Agilent SureHyb	Agilent Technologies	G2524-60012	Pacote de 20 lâminas de junta, 4 microarrays/lâmina
Kit de Pico de RNA de Duas Cores	Agilent Technologies	Cat# 5188-5279
GenePix 4000B scanner de matriz	Molecular Devices	GENEPIX 4000B-U
Livre de Ozônio	BioTray	OFB_100x200
arquivo GAL	Agilent Technologies	-

Conjunto DNase Livre de RNase KIT0204 da Instrumentos Caixa