Transarterial Administração de Oncolíticos Vírus para loco-regional Terapia de Ortotópico HCC em Ratos

Resumo

As viroterapias oncolíticas estão em desenvolvimento como novas terapêuticas para o tratamento do carcinoma hepatocelular (CHC). Aqui descrevemos um método para terapia locorregional do CHC via administração arterial hepática do vírus oncolítico.

Resumo

O carcinoma hepatocelular (CHC) é uma doença com opções de tratamento limitadas e mau prognóstico. Nos últimos anos, as viroterapias oncolíticas provaram ser ferramentas potencialmente poderosas para combater a malignidade. Devido ao suprimento sanguíneo duplo exclusivo no fígado, é possível aplicar terapias localmente aos tumores hepáticos ortotópicos, que são predominantemente alimentados pelo fluxo sanguíneo arterial. Demonstramos anteriormente que a entrega arterial hepática de vírus oncolíticos resulta em eficiência de transdução segura e eficiente de lesões multifocais de CHC, resultando em prolongamento significativo da sobrevida em ratos imunocompetentes. Este procedimento imita de perto a aplicação da embolização transarterial em pacientes, que é o tratamento paliativo padrão fornecido a muitos pacientes com CHC. A capacidade de administrar terapias tumorais através da artéria hepática em ratos permite um modelo pré-clínico altamente sofisticado para avaliar novos vetores virais em desenvolvimento. Aqui descrevemos o protocolo detalhado de microdissecção da artéria hepática para infusão de vetores de vírus oncolíticos para tratar o CHC ortotópico.

Introdução

O carcinoma hepatocelular (HCC) é o quinto câncer mais comum no mundo, ea terceira principal causa de morte relacionada ao câncer, tornando-se um problema de saúde significativo ^1,2. Para os pacientes que não são elegíveis para ressecção do tumor, ou aqueles aguardando transplante hepático, terapia loco-regional envolvendo embolização transarterial (TAE) ou quimioembolização transarterial (TACE) são aplicados como cuidados paliativos padrão ^3,4. Estas terapias explorar a característica única de fornecimento de sangue duplo, no qual os tumores do fígado são alimentados quase exclusivamente pelo fluxo de sangue arterial hepático, enquanto o fígado circundante recebe a maioria do seu fornecimento de sangue a partir da veia portal de ^5,6.

Devido às eficácias muito limitado de terapias estabelecidas de carcinoma hepatocelular, os vírus oncolí ticos têm emergido como agentes terapêuticos alternativos promissores. JX-594, recentemente renomeado Pexa-Vec, é um excluído-quinase vector vaccinia timidina, armado com granulócitos-macrophage-fator estimulador de colônias (GM-CSF), que foi concluída a fase II de ensaios clínicos para HCC ^7. Mais recentemente, um vector recombinante do vírus da estomatite vesicular (VSV) que expressam o interferão-beta humano entrou numa fase I de ensaios clínicos para HCC-sorafenib refractário (NCT01628640). Como os vírus oncolí ticos aproximar-se a obtenção de aprovação para a aplicação clínica de HCC em pacientes, a necessidade de uma via de administração eficaz para alvejar doença multifocal é evidente. Enquanto a libertação sistémica é largamente ineficaz devido a transdução do tumor ineficiente, aplicações intratumorais poderia limitar a eficácia da terapia para o tumor injectado, deixando lesões microscópicas uninjectable sensíveis à progressão da doença.

Nós estabelecemos um método de isolamento da artéria hepática em ratos para administrar oncolytic vírus terapia de forma loco-regional para alvejar HCC ortotópico. Nós demonstramos que esta via de administração resultados em segurança e effective transdução de nódulos HCC multifocais, resultando no prolongamento de sobrevivência significativo em ratos imuno-competentes ^8-10. Aqui, descrevemos o método de acesso, dissecando, e injetar na artéria hepática em ratos. Um esquema do processo é mostrado na Figura 1 (publicado anteriormente ⁹⁾

Protocolo

Nota: Os passos seguintes foram realizados em conformidade com as orientações da nossa instituição e o governo local da Baviera, Alemanha. Todas as tentativas para reproduzir este protocolo deve ser feita na adesão às diretrizes locais para o tratamento humano dos animais, como ditado pelo cuidado animal local e comitê de uso. Por exemplo, muitos institutos exigem que luvas estéreis são usados ​​durante a cirurgia de roedores. Além disso, trabalhar com vírus deve ser realizada de acordo com os regulamentos locais, tendo o cuidado para a segurança pessoal e ambiental. Cuidados devem ser tomados para descartar adequadamente os resíduos contaminados e limpar instrumentos e espaço de trabalho (ou seja, por autoclavagem e limpar com um desinfectante antiviral adequado de acordo com as instruções do fabricante).

1. Preparações Antes de iniciar a cirurgia

1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos (ie, por autoclavagem).
2. Dilui-se o vírus para o aproprconcentração iate, que irá variar dependendo da toxicidade do vírus específico a ser utilizado e da susceptibilidade da estirpe de rato.
   Nota: Por exemplo, quando se utiliza o vírus da estomatite vesicular em ratos Buffalo sexo masculino, que tipicamente injectar 10 ⁷ pfu num volume de 1 ml, que é a dose máxima tolerada em que modelo.
   1. Prefill o vírus (utilizando uma técnica asséptica) em seringas de 1 ml, e anexar 30 g de agulhas, tendo o cuidado de eliminar o ar da seringa e agulha.
3. Prepare o espaço cirúrgico com todos os materiais e equipamentos necessários, e pulverizar a área com etanol para desinfectar. Encha um pequeno recipiente com solução salina estéril (0,9% NaCl) para umedecer compressas de gaze e aplicadores com ponta de algodão.

2. Preparação do Rato

1. Administrar um analgésico (como especificado pelo Animal Care Committee e uso local), no apropriado dose de 30 min antes de se iniciar o procedimento cirúrgico. Por exemplo,administrar uma dose elevada de metamizol (100-200 mg / kg).
2. Anestesiar ratos usando inalação (isoflurano) ou injectável (isto é, uma mistura de medetomidina (0,15 mg / kg), midazolam (2 mg / kg), e fentanilo (0,005 mg / kg), também conhecido como MMF) anestesia. Administrar isolflurane através de um vaporizador em 1-3% e ajustar conforme necessário para manter a respiração normal e do ritmo cardíaco.
   1. Antes de prosseguir, certifique-se que o rato está totalmente sedado e incapaz de sentir dor por beliscar a almofada do pé e observando para uma reação.
   2. Aplique uma pomada veterinária para prevenir o ressecamento durante a anestesia.
3. Raspar a área abdominal do esterno para baixo a apenas acima dos genitais usando uma pequena máquina de cortar cabelo veterinária. Tome cuidado para conseguir um barbear mais rente sem ferir a pele.
4. Corrigir o rato para o leito cirúrgico utilizando fita na previsão e membros posteriores e, se estiver usando anestesia inalação, coloque o focinho em um cone de nariz de dimensões adequadas. Coloque uma almofada de aquecimentosob o rato para manter a temperatura corporal. Desinfecção da área abdominal com um desinfectante de grau cirúrgico, seguido de uma lavagem com álcool e aplicação de uma tinta anti-séptico.

3. A laparotomia

1. Usando um pequeno bisturi curvo, tal como # 15, fazer uma pequena incisão vertical na camada de pele directamente ao longo da linha média. Estender a incisão até o processo xifóide. Em seguida, inciso a camada muscular, gentilmente levantando com um par de fórceps Adson para fazer uma incisão de bisturi, e em seguida, estender a incisão até o processo xifóide com uma tesoura cirúrgica. Tomar cuidado para não puncionar os órgãos da cavidade abdominal ou a danificar os pequenos vasos em ambos os lados do processo xifóide.
2. Coloque um afastador através do abdômen para espalhar o músculo ea pele e expor toda a área abdominal.
3. Umedeça dois 7,5 x 7,5 cm ² compressas de gaze com soro fisiológico estéril e espalhar uma na parte superior do cirúrgicae uma abertura através da parte inferior, como se mostra na Figura 2A.

4. Isolamento da artéria hepática

1. Usando duas compressas com aplicador de algodão umedecido umedecidas com soro fisiológico estéril, levante suavemente os intestinos e ceco para fora da cavidade abdominal, e colocá-los no cotonete gaze inferior. Dobre a gaze sobre a manter os órgãos úmido e para mantê-los fora do caminho.
2. Usando duas compressas com aplicador de algodão umedecidos, gentilmente levante o lobo hepático lateral esquerdo, que será o lobo mais predominante, tendo em conta nesta fase. Virar o lóbulo para cima, e, usando uma tesoura pequena mola, cortar através da membrana fibrosa na parte inferior do lóbulo, permitindo que o lóbulo para ser completamente virado para cima e para descansar em cima da compressa de gaze previamente colocado. Dobre o cotonete de gaze sobre o lobo para segurá-la no lugar.
3. Continue com o próximo lobo (caudado anterior), que agora é o lobo mais anterior em vista. com the auxílio de um microscópio de dissecção e uma pinça fina, dissecção da membrana fina em torno do lóbulo de modo a libertar e permitir que seja livremente virado para cima. Colocar o lóbulo debaixo da haste de gaze em conjunto com o lobo lateral esquerdo.
4. Observe o lobo caudado posterior, que será agora visível. Repita o passo 4.3 para dissecar completamente a caudado lobo posterior e lançá-lo para cima e para dentro da gaze em conjunto com os lobos do fígado colocados anteriormente.
5. Logo abaixo da posição original do lobo caudado, encontrar a artéria hepática comum, que será agora visível e facilmente reconhecida por sua forte pulsação. Após a artéria para o direito anatômico, observar o material membranoso espessura obscurecendo as artérias hepáticas gastroduodenais e apropriadas de vista. Usando uma pinça fina, levante-se este material e gentilmente rasgá-lo, tomando cuidado para evitar quaisquer pequenas embarcações na área. Use cotonetes aplicador de algodão para evitar qualquer sangramento que pode ocorrer.
   1. Localize a umrterial ramos, que será claramente visível, com o auxílio de um microscópio de dissecação, quando as membranas são adequadamente dissecadas.
6. Utilizando duas pinças atraumáticas, finas, dissecar cuidadosamente a artéria hepática comum, artéria gastroduodenal, e a artéria hepática adequada de tal modo que eles são libertados a partir das membranas que rodeiam (Figura 2B).

5. Preparação da Artéria para Injecção

1. Passar um 7-0 Prolene sutura debaixo da artéria gastroduodenal, e usar um micro-porta-agulhas para amarrar uma ligadura permanente na extremidade distal, logo acima da bifurcação (ver Figura 1 para a colocação adequada). Permitir que cerca de 2 polegadas de material de sutura restantes sobre as extremidades, e prenda-os com um suporte de agulha para puxar a artéria ensinado, como na Figura 2C.
2. Colocar uma pequena braçadeira na artéria hepática comum para bloquear temporariamente o fluxo de sangue (Figura 2C).
   Nota: Este é important para prevenir hemorragia massiva uma vez que a agulha é removida da artéria. Além disso, o bloqueio do fluxo de sangue arterial vai permitir a administração de vírus mais lento e uma melhor eficácia de transdução.
   1. Importante: Trabalho rapidamente para limitar a quantidade de tempo que o fluxo de sangue é interrompido - executar a injecção e subsequente ligação da artéria dentro de 5 min de aperto da artéria hepática comum.
3. Se possível, aumentar a ampliação no microscópio de dissecação, de modo a que a artéria gastroduodenal está em foco e aparece grande o suficiente para inserir de forma precisa a agulha G 30. Coloque a agulha da seringa de injecção para dentro do lúmen da artéria gastroduodenal e lentamente empurrar o êmbolo.
   Nota: A colocação apropriada da agulha vai resultar na solução injectada que flui directamente através da artéria hepática e adequada para o fígado.
   1. Realizar a injecção muito lentamente para maximizar a eficiência de transdução.
4. Uma vez que todo o volume de injecção ter sido administrada, lentamente retrair a agulha a partir da artéria.
   Nota: Não deve haver sangramento no local da injecção. No caso em que a hemorragia ocorre, isso indica que a braçadeira não está correctamente colocada e deve ser ajustada rapidamente.

6. Encerramento

1. Passe uma segunda 7-0 Prolene sutura abaixo da artéria gastroduodenal, e amarrar uma segunda ligadura permanente acima do local da injeção.
2. Remover o grampo da artéria hepática comum. Confirmar que o fluxo de sangue através da artéria hepática própria para o fígado foi restaurado.
   1. Corte as pontas soltas das ligaduras.
3. Confirmar que não há sangramento antes de devolver os intestinos e fígado para a cavidade abdominal. Tome cuidado para que o apêndice é devolvido em sua orientação original.
4. Suturar o músculo e pele em camadas separadas utilizando material de sutura 4-0 vicryl com uma agulha curva. lugar continuous suturas cerca de 1 mm de distância e puxe com força.
   1. Durante a fase de sutura, administrar um analgésico tal como buprenorfina (0,05 mg / kg).
5. Remover rato da anestesia. Se isoflurano foi usado, o rato deve recuperar a consciência dentro de alguns minutos. Se o MMF tem sido usado como uma anestesia injectável, antagonizam com uma injecção subcutânea de atipamezol (0,75 mg / kg), flumazenil (0,2 mg / kg), e naloxona (9,12 mg / kg), o que irá reverter os efeitos da anestesia e permitir que os animais a recuperar a consciência dentro de 20 min. Mantenha ratos quentes com uma lâmpada de aquecimento infravermelha durante a fase inicial despertar.
   1. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
   2. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
6. Monitorar ratos pós-operatório para os sinais patológicos de aflição, e acompanhamento-se com analgésicos, conforme exigido pela comissão de cuidados com os animais e uso local. Por exemplo, a buprenorfina pode ser administrada em 0,05 mg / kg a cada 12 horas.

Resultados

Com a experiência, uma taxa de sucesso de quase 100% (o que significa que a artéria foi dissecada com sucesso e injectada, e o animal sobreviveu cirurgia) pode ser alcançado. No entanto, o estado de saúde do rato antes da cirurgia (grau de carga do tumor, a função hepática de base, etc) irá, obviamente, ter um papel no resultado da intervenção cirúrgica. Após a cirurgia, os ratos podem ser esperados para detectar a perda de peso transiente e uma ligeira elevação, transitória das...

Discussão

Embora a injeção intratumoral direta seja, sem dúvida, o método mais simples para resultar na transdução tumoral eficiente de um único nódulo tumoral, a infusão arterial hepática representa uma via de administração ideal para atingir o CHC ortotópico multifocal. Este método provou ser seguro e eficaz para o tratamento do CHC em ratos imunocompetentes com vírus oncolíticos. Além disso, como os pacientes com CHC são tratados rotineiramente por aplicação transarterial de quimioembolização, o método descrito aqui é facilme...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aparadores veterinários	Aesculap	GT415	Aparador pequeno e sem fio ideal para remover pêlos da área cirúrgica
Estereomicroscópio	Zeiss	Stemi SV6
30 G Agulhas	Braun	4656300	30 G x ½ "
Seringas de 1 ml	Braun	9161406V	Seringa de tuberculina
Bisturi descartável	Pena	2975#15	#15 lâmina
Tesoura cirúrgica padrão	Fine Science Tools	14001-13	Afiado/rombudo, para abrir a pele e os músculos
Pinça Adson	Fine Science Tools	1101-12	Com dentes, para agarrar a pele e os músculos
Afastador de Alm	Fine Science Tools	17008-07	Com dentes rombos, para abrir a cavidade abdominal durante a cirurgia
Cotonetes de gaze	Lohmann & Rauscher	18504	7,5 cm x 7,5 cm, deve ser autoclavado antes do uso
Cotonetes aplicadores com ponta de algodão	Lohmann & Rauscher	11970	Estéril
Fine-tip foreceps	Fine Science Tools	11063-07	0,4 mm, ponta angular, para dissecar a artéria hepática
Tesoura de mola Vannas Fine	Science Tools	91500-09	Para corte delicado
Micro-agulha titular	Fine Science Tools	12076-12	Para ligar a artéria gastroduodenal
Agulha titular	Fine Science Tools	12005-15	Mandíbulas de carboneto de tungstênio
7-0 Suturas de Prolene	Ethicon	8648H	Sutura de polipropileno com agulha curva, para ligar a artéria gastroduodenal
4-0 Suturas Vicryl	Ethicon	V3040H	Com agulha curva acoplada
Lâmpada de aquecimento infravermelho	Beurer	IL11	Para manter a temperatura corporal no pós-operatório