Um método melhorado para rápida de intubação da traqueia em Ratos

Apesar de algumas diferenças anatômicas e fisiológicas, ^{1 modelos} murino continuam a ser de valor inestimável para a modelagem de biologia humana e patogênese da doença. ² Do ponto de vista pecuária, os ratos são fáceis de manusear, tem um tempo de reprodução baixa, um tempo de vida acelerado, e são relativamente baratos para abrigar. Com o desenvolvimento de diversas estirpes genéticas e estratégias (por ex., Condicionais knock-outs, ratinhos repórter, abordagens de rastreio de linhagem, etc.), bem como a grande variedade de reagentes disponíveis (por exemplo., Anticorpos, proteínas recombinantes, inibidores, etc.), os ratos se tornaram um organismo essencial modelo de vertebrados para descobrir processos de homeostase e de doenças humanas ^3.

Os ratos têm sido especialmente valiosa para estudar as condições pulmonares, incluindo lesão pulmonar aguda (LPA) e fibrose pulmonar. ⁴ LPA em seres humanos pode ser causado por trauma, lesão, ou septicemia e é caracterizada por células epiteliais evazamento endotelial (isto é., edema), inflamação e fibrose nascente. Em muitos pacientes, ALI progride para sua forma grave, síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), que muitas vezes resulta em fibrose e morte por insuficiência respiratória. ^5,6 fibrose pulmonar é uma patologia progressiva, fatal caracterizada pela deposição excessiva de matriz extracelular , digite mais notavelmente I colágeno, levando a função pulmonar prejudicada. ^7,8 a administração de bleomicina (BLM) é o modelo mais amplamente utilizado e melhor caracterizado para induzir ALI e fibrose em animais experimentais. ⁹ Apesar de fibrose pulmonar BLM-induzida em roedores faz não recapitular plenamente os fenótipos fibróticas humanos, ¹⁰ estudos com ratos com este modelo levaram à descoberta de muitos fatores importantes que influenciam o aparecimento e progressão da doença ^11.

Enquanto o mecanismo exacto (s) por detrás fibrogénese induzida por BLM são desconhecidas, a lesão iniciarPensa-se que surgir a partir de rupturas dos filamentos de DNA dependente de contacto nas células epiteliais que revestem as vias aéreas condutoras e alvéolos e, em particular, tipo 1 pneumócitos. ¹² A necessidade de contacto directo entre BLM eo epitélio pulmonar destaca a importância de uma rota de entrega robusta , e estas preocupações são também pertinentes para uma vasta gama de tratamentos direccionado para as vias respiratórias distais, incluindo proteínas recombinantes, anticorpos, siRNA, vírus, bactérias, partículas, e mais. Aspiração orofaríngea (OPA) tem sido amplamente utilizado para este fim ^13, mas um grande inconveniente de uma OPA é que alguma porção do agente fornecido pode ser engolida para o tracto gastrointestinal, conduzindo assim a imprecisão na dose administrada. Outra abordagem amplamente utilizada é a instilação transtraqueal, que envolve traqueostomia sob anestesia forte para expor a traqueia e a instilação de um agente directamente no tracto respiratório. ¹⁴ No entanto, tal não só podeum procedimento ser indesejável devido ao seu invasividade, mas também consome tempo, exige um pouco de formação, e provoca uma lesão potente ao tracto respiratório têm sido desenvolvidos. ^15,16 Vários protocolos que envolvem a administração directa de agentes para o traqueia, sem a necessidade de intervenção cirúrgica, ^{16,17,18,19,20} tempos de recuperação, mas estes métodos envolvem estendidos causada pelos anestésicos potentes, o uso de equipamento caro (isto é., otoscope / laringoscopio, disponíveis comercialmente placas de procedimento, de fibra óptica fios, etc.), um excesso de manipulação na cavidade oral, e a incerteza sobre a dosagem.

Este artigo descreve um método relativamente fácil de administração por entubação que permite que um investigador de forma rápida, barata, e infundir de forma fiável um reagente para o pulmão de murino com o risco reduzido de danos residuais para os tecidos circundantes.

Os Comitês Institucionais de Animais Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade de Washington e Cedars-Sinai Medical Center aprovaram o animal de trabalho necessário para estes estudos.

1. Preparação

1. Esterilizar ambas as pinças de extremidade embotada e o autoclave através de depressor.
2. Usando uma câmara de segurança biológica, prepare um estoque de trabalho de BLM em PBS a partir do pó liofilizado. Sonicar a solução durante 10 min a 35 kHz a assegurar uma mistura uniforme.
   Nota: Um volume total de entre 30 e 45 uL é recomendado para evitar a variação de pipetagem na extremidade baixa, e asfixia com volumes maiores.
3. Prepare um espaço de trabalho limpo, que inclui cerca de 1 m ^{2 para} o procedimento em si, bem como locais designados para gaiolas antes e após o procedimento.
4. Fixar a placa de base do procedimento para o banco imediatamente em frente do investigador por a disposição de 2 ou 3 tiras de fita laboratório através da base e Sublinharying banco. Veja a Figura 1 para mais especificações sobre a criação de um conselho.
5. Amarre um único comprimento de tamanho 4.0 fio de sutura entre os dois parafusos de posicionamento da placa de procedimento.
6. Gerar um espirómetro improvisada, removendo e rejeitando o êmbolo a partir de três seringas de 1 ml, e depositar 60 ul de PBS para o topo de cada barril, para formar uma vedação hermética. Fixar o cubo do cateter livremente para uma das seringas e colocá-lo para um lado do tabuleiro.
7. Aspirar 300 ul de ar para uma seringa de 1 mL e colocá-lo para um lado do tabuleiro.
8. Cortar uma peça adicional de fita de aproximadamente 6 polegadas de comprimento e lugar para um lado. Isso será usado para prender o animal para o conselho na etapa 2.4.
9. Configurar uma câmara de isoflurano. Fixe _O 2, isoflurano, e de vácuo para as portas apropriadas, tanto a câmara de exposição e o vácuo de apuramento. Em alternativa, administrar um anestésico de isoflurano-compatível biológicagabinete de segurança.

2. intubação

1. Anestesiar o rato com isoflurano na câmara até que ela perde a consciência e respiração retarda a uma taxa adequada. Uma exposição típico inclui 4% de isoflurano e 2% de O ₂ durante 3 a 4 minutos, e o resultado ideal é de 2 a 2,5 min da sedação. Isto corresponde a uma taxa de respiração de uma respiração cada 2 segundos.
2. Enquanto espera para a sedação para, em conjunto, aspirado entre 30 e 45 l de BLM em uma pipeta e lugar para um lado.
3. Quando estiver pronto, suspender o mouse sedado por seus incisivos superiores do fio ligado aos parafusos de posicionamento da plataforma procedimento. Certifique-se de que o dorso do animal fica plana contra a superfície da plataforma.
4. Tendo o cuidado de não restringir a ventilação, colocar um pedaço de fita livremente entre a parte inferior (caudal) da porção interior da cavidade torácica, logo acima do diafragma. A colocação deve ser apertado o suficiente para manter o alinhamento adequado durante o procedure, mas não tão apertado que restringe a respiração.
5. Ligue o iluminador para entre 80% e 100% de intensidade e orientar o pescoço de ganso de modo que é de 1 a 2 cm da superfície da pele, próximo do plexo solar. Verificar periodicamente a ponta do pescoço de ganso de calor para garantir que ele não ferir o rato.
6. De pé por trás da plataforma, use as estéreis, pinças fim brusco para localizar a língua. Ser cuidadoso para evitar os incisivos inferiores, suavemente aderência e desenhar a lingueta para fora da cavidade oral.
7. Usando a mão restante, insira o depressor e usá-lo para achatar a língua contra o assoalho da cavidade oral. Solte a pinça, mas deixe o depressor no lugar para as próximas duas etapas.
8. Orientar a luz de modo que a traqueia é visível, orientando o pescoço de ganso proximalmente a partir do nível do plexo solar até atingir o nível dos brônquios mainstem.
   Nota: A traqueia pode ser facilmente distinguidos pela acção da respiração, WHICH faz com que a luz emitida a flutuar em intensidade. Quando correctamente posicionada, esta estrutura será visível no plano axial de um pino localizado centralmente de luz com luz ambiente mínima na própria cavidade oral.
9. Ângulo da seringa para que ele segue o caminho natural da traqueia, e abaixe a ponta do cateter 22-G, com a seringa anexo contendo a gota, em linha reta para o lúmen. A bolha PBS começará a subir e descer com cada respiração em cima colocação bem sucedida.
   Nota: Esta acção pode ser retardado por vários segundos, como resultado da sedação profunda.
10. Alimentar o cateter em um adicional de 5 mm. Retire a espátula.
11. Deslocar a seringa ao lado oposto, e agarrando o hub, remova cuidadosamente a seringa.
12. Depósito entre 30 e 45 ul de BLM no centro do interior do cubo de cateter, anexar a segunda seringa e dispensar 300 ul de ar para dentro do cubo.
13. Substitua o segundoSeringa com o primeiro contendo a bolha de PBS. A bolha vai continuar a subir e descer se o procedimento foi realizado com sucesso.

Cuidado 3. pós-procedimento

1. Retirar o cateter e fita, e colocar o animal em um lugar quente e seco até que ele recupera a consciência - geralmente dentro de um par de minutos.

Ratos entubados foram monitorados diariamente para perda de peso e angústia, e sacrificados 4, 10 ou 17 dias depois através de injecção intraperitoneal de 2,5% 2,2,2 tribromoethanol. Lavado broncoalveolar (LBA) foi coletado em três lavagens de PBS como descrito em outra parte 21 , e o pulmão direito foi fixado em 10% de formalina, embebidos em parafina, e coradas com tricrómio de Masson pela Universidade de Washington Histologia e imagem de núcleo 22.

De acordo com dados estabelecidos, os ratos tratados com BLM experimentaram perda de peso de pico entre os dias 7 e 10 pós exposição 23 (Figura 2A). Além disso, níveis elevados de IgM em BAL de murganhos tratados com BLM sacrificaram demonstraram um aumento significativo, dependente do tempo na permeabilidade do pulmão, indicativo de células epiteliais e / ou disfunção da barreira endotelial (Figura 2B).

= "jove_content" fo: manter-together.within-page = "1"> A resposta fibrogênica foi medido utilizando o tricrômico de Masson - um marcador bem estabelecido de conteúdo total de colágeno 24. Pulmões direito foram coradas, e a média da área total de secção tricromo por pulmão direito foi quantificada (Figura 3A). As secções representativas mostrar o espessamento dependente do tratamento resultante do interstício pulmonar e aumento de lesões fibróticas (Figura 3B).

Figura 1. Os parâmetros gerais para a produção de uma placa de processo de trabalho. Os comprimentos apresentados indicam as dimensões aproximadas necessárias para a criação de um aparelho de procedimento de trabalho. Nestas experiências, o metal em chapa de alumínio padrão foi cortado com as dimensões adequadas, em seguida, reforçado com um suporte de "T".ftp_upload / 53771 / 53771fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. perda de peso e disfunção da barreira após a administração de bleomicina. Os ratinhos foram administrados 2,0 U / kg de BLM ou um volume igual de PBS. Perda (A) Peso expresso em percentagem de peso dia 0 (BLM: n = 21; PBS: 5). (B) Os ratinhos foram sacrificados aos 4 ou 10 dias pós-exposição, e proteína IgM no BAL de pulmão colhidas foi medida através de ELISA. (PBS: n = 5; 4 dias: n = 3; 10 dias: n = 5). Os dados são apresentados como média ± SEM. * P <0,05 em relação ao controle PBS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. A fibrose pulmonar após a administração de bleomicina. (A) colágeno total, quantificado como coloração tricromo mudança total dobra de Masson dos controles WT. (B) Imagens representativas de tricrômicos secções de pulmão coradas tiradas com 5x de ampliação. controlo PBS consiste de animais capturados entre 5 e 14 dias de tratamento pós-PBS (PBS: n = 5; 10 dias: n = 5; 17 dias: n = 3). Os dados são apresentados como média ± SEM. * P <0,05 em relação ao controle PBS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a divulgar.