Retroductal submandibular Glândula instilação e localizada fracionado irradiação em um modelo de rato de salivar Hipofunção

Resumo

A hipofunção das glândulas salivares, um dos principais efeitos adversos da radioterapia de cabeça e pescoço, diminui a qualidade de vida do paciente. A demonstração da eficácia de novas terapias em modelos animais é um pré-requisito antes da transição clínica. Este protocolo descreve a administração retroductal e a irradiação local das glândulas submandibulares de ratos.

Resumo

Os tecidos normais que se encontram dentro dos portais de radiação são inadvertidamente danificados. As glândulas salivares são frequentemente lesadas durante a radioterapia de cabeça e pescoço. O dano celular irreparável resulta em uma perda crônica da função salivar que prejudica as atividades orais básicas e aumenta o risco de infecções orais e cárie dentária. A hipofunção salivar e suas complicações afetam gravemente o conforto do paciente. O manejo sintomático atual da condição é ineficaz e são necessárias terapias mais recentes para amenizar a condição.

As glândulas salivares são glândulas exócrinas, que expelem suas secreções para a boca através de ductos excretores. A canulação desses ductos fornece acesso direto às glândulas. A administração retroductal de um agente de contraste às principais glândulas salivares é um procedimento ambulatorial de rotina para diagnóstico por imagem. Usando um procedimento semelhante, o tratamento localizado das glândulas é viável. No entanto, realizar essa técnica em estudos pré-clínicos com pequenos animais apresenta desafios únicos. Neste estudo, descrevemos a técnica de administração retroductal em glândulas submandibulares de ratos, um procedimento que foi refinado no laboratório do Dr. Bruce Baum (NIH)¹, e estabelecemos um procedimento para irradiação de glândulas locais.

Introdução

destruição colateral dos tecidos saudáveis ​​é responsável por uma série de efeitos colaterais deletérios dos tratamentos de câncer. Uma parte ou a totalidade das glândulas salivares maiores que se encontram com os campos de radiação são inevitavelmente destruídos. Portanto, a maioria dos pacientes submetidos à radioterapia para câncer de cabeça e pescoço, linfoma do colo do útero, ou a radiação de corpo inteiro antes do transplante de medula óssea sofrem um dos efeitos adversos mais comuns e persistentes de radiação, glândula salivar hipofunção ^2-6.

As células acinares produtoras de fluido das glândulas salivares são extremamente sensíveis à radiação. Os danos para as glândulas salivares provoca uma diminuição drástica do fluxo salivar, uma condição referida como hipofunção salivar. A redução crônica do fluxo salivar prejudica principais atividades orais, tais como mastigação, deglutição, fala e gosto, mas as sequelas mórbido de intensa dor, as lágrimas das mucosas, disfagia, infecções oportunistas e cárie dentária piora abem-estar e função de ^2,3 paciente de.

Uma vez que a perda de células salivar associada a radioterapia é irreversível, não há nenhum tratamento correctivo de xerostomia. O tratamento actual que incide sobre assuaging sintomas com substitutos salivares artificiais e drogas prosecretory é ineficaz para alívio de longo prazo ^6. Embora a melhoria das técnicas de aplicação de radiação ter ajudado a diminuir a gravidade da condição, a toxicidade do tecido normal e as suas complicações continuam a ser um factor limitante no tratamento de cancro ^6,7. medidas preventivas para evitar complicações associadas à radioterapia são, portanto, tornando-se a norma. Agentes radioprotetores que limpam espécies de oxigênio de radicais livres, repovoamento celular adotiva, ou melhorar o reparo do DNA estão sendo exploradas para evitar a hipofunção salivar ^8-11.

Secreções das glândulas salivares exócrinas escorrer para dentro da boca através dos principais ductos excretores. punção intra-oral de the ductos excretores para injeção de agentes de contraste é feito rotineiramente como um procedimento ambulatorial. Utilizando uma abordagem similar, glândulas salivares podem ser directamente alvo de tratamento localizado ^12. Além de reduzir o risco de efeitos colaterais sistêmicos, retroductal instilação glândula adicionou benefícios. O arranjo de monocamada de células salivares em torno da árvore ductal permite a segmentação de todas as células epiteliais salivares, e a encapsulação fibrosa dos actos de glândula como uma barreira para reduzir a propagação indesejada terapêutico. Em essência, as glândulas salivares são perfeitamente adaptados para o tratamento alvo de aflições da glândula, como a hipofunção salivar induzida por radiação.

radiação convencional para o tratamento do câncer é entregue em pequenas doses (1,8-2,5 Gy / fração / dia, cinco dias por semana) por um período de semanas. Portanto, uma terapêutica de rádio-protetora que mostra eficácia contra um esquema de radiação prolongada em modelos experimentais tem maior rolamento clínica. Comprofunção salivar mised após a radiação fracionada foi gravada em pequenos animais, mas fonte de radiação, a fração de dose e protocolos utilizados são variados ^9,10,13.

Este relatório estabelece métodos para a entrega retroductal para e radiação localizada do rato glândula submandibular usando fonte de radiação no paciente relevante e fração dose.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pela Saúde LSU, Shreveport, Animal Care e do Comitê Use e estavam em conformidade com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. A canulação do Rat Submandibular glândulas salivares

1. Preparação da Seringa-Tubing Assembléia
   1. Cortar um comprimento de 10 cm de tubagem de polietileno PE10 com um bisturi. Segurar as duas extremidades da tubagem entre o dedo indicador e o polegar. Aqueça a parte do meio da tubulação acima de uma chama suave e delicadamente esticar o tubo amolecida para dobrar seu comprimento puxando ambos os lados.
   2. Cortar o tubo no meio com um bisturi, num ângulo de 45 ^° para obter duas cânulas - cada um com uma extremidade afilada. Expandir a extremidade não-cónica da cânula de encaixe ao longo de uma agulha 29 G de 0,5 cc seringa de insulina.
   3. Remover a cânula, e chamar a 220 ul de solução salina para dentro da seringa. Toque para desalojar bolhas de ar. Montar o cannulum sobre a agulha e empurre o êmbolo da seringa para expelir ar e assegurar um fluxo livre de solução através da cânula. Ajustar o volume para 200 ul.
2. Canulação Intra-Oral de Submandibular Gland Duct
   NOTA: instrumentos Autoclave antes do procedimento, e esterilizar in-between procedimentos em um esterilizador quente talão.
   1. Pesa-se o rato Sprague Dawley, e dispensar o volume calculado de cetamina (42 mg / kg) / xilazina (8 mg / kg) / acepromazina (1,4 mg / kg) mistura de uma seringa hipodérmica.
   2. Conter o animal segurando-o pela base da cauda entre o dedo indicador eo polegar de uma mão e deslizando a outra mão sobre o corpo para segurá-lo. Coloque o dedo indicador e médio ao longo dos lados da cabeça, enquanto segurar o torso com o polegar e os dedos restantes.
   3. Injetar o anestésico na musculatura dos membros posteriores. Confirmar profundidade da anestesia por pitada dedo do pé e do reflexo palpebral. Aplique lubrificante olho para evitar a secura enquantoanimal está sob anestesia.
   4. Colocar o animal sobre uma plataforma especialmente concebido (Figura 1), e acoplar os dentes incisivos superiores na barra transversal. Puxar o maxilar inferior para baixo passando uma faixa de borracha em torno dos incisivos inferiores e ancorando-lo para a plataforma.
   5. Passe uma sutura estéril através da língua e levante-o para levantar o assoalho da boca. Prenda as suturas com uma pinça hemostática, e passá-lo por cima da barra transversal.
   6. Expandir as bochechas com um mordente espalhador feito sob medida (Figura 1), e sob um microscópio de dissecação localizar as papilas sublingual no chão da boca.
   7. Agarrar a extremidade cónica do tubo PE10 pré-formada usando uma delicada fórceps. Suavemente manipular a ponta da cânula dentro do orifício ductal nas papilas sublingual. Confirmar a colocação da cânula enfiando-o 3-5 mm dentro da conduta; garantir que ele passa sem qualquer obstrução.
3. Submandibular Glândula Instillation
   1. Injectar atropina (0,5 mg / kg) por via subcutânea na nuca do pescoço, e esperar 10 minutos para a redução das secreções salivares.
   2. Segurar a cânula ao orifício de conduta com uma gota de cianoacrilato (cola), e deixa-se secar. Instilar a solução na glândula (200 ul / glândula) pressionando-se lentamente o êmbolo da seringa a uma taxa de ~ 50 mL / min.
   3. Esmagar o tubo com uma pinça hemostática, e remova cuidadosamente a seringa. Manter o tubo no duto de 30 - 60 min até que o animal recupere a consciência. Remover o fio de sutura que mantém a lingueta.
   4. Transferir o animal para uma gaiola separada, e usar uma lâmpada de calor para mantê-lo aquecido durante a recuperação. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência para manter decúbito esternal.
   5. Depois que o animal é totalmente ambulatorial, abrigá-lo no biotério, com livre acesso a comida e água.

2. Localizada fracionado Irradiaçãoda glândula submandibular

1. Conter o animal, tal como descrito antes, e anestesiar com a administração intramuscular de cetamina (33 mg / kg) / xilazina (6 mg / kg) / acepromazina (1 mg / kg) mistura no membro posterior. Confirmar profundidade da anestesia, e aplicar lubrificante para os olhos.
2. Coloque o supino animal na mesa acelerador linear, e estender o pescoço inclinando a cabeça. Colimar o campo de radiação (3 cm de largura de fenda) para abranger a área do bordo inferior da mandíbula para a parte superior do esterno.
3. Coloque um bolus de tecido equivalente 1 cm sobre a região, e ajustar a distância entre a origem eo topo do bolo para 100 cm de radiação.
4. Irradiar o animal (2,5 Gy), utilizando um feixe de 6 MV fotões de um acelerador linear. Taxa de dose, tamanho do campo e distância da fonte de radiação para bolus superfície vai ditar o tempo de exposição. No actual definido acima, os animais foram irradiados a uma taxa de dose de ~ 1 Gy / min.
5. Repita a exposição; 2,5 Gy / dia durante um total de oitodias; 4 dias / semana, com um intervalo de 2 dias no meio. Manter o animal aquecido durante a recuperação. Transferir o animal para biotério após ele é totalmente ambulatorial.
6. Recolha estimulada submandibular da glândula salivar 8 semanas após a radiação para medir a função da glândula ^14. Euthanize animais sob anestesia por perfusão cardíaca de frio paraformaldeído a 4% / tampão fosfato pH 7,2. Extirpar a glândula submandibular para histológica e imuno-histoquímica ^14.

Resultados

Adaptar uma técnica sialografia minimamente invasivo, o tratamento local das glândulas salivares maiores é viável. Retroductal administração em ratos glândulas salivares submandibulares foi tentada por punção intra-oral de condutas de Wharton (Figura 2). Os canais salivares de Wharton abertos nas papilas sub-lingual, localizado no chão da boca, mas os orifícios não são facilmente visíveis. A inserção da cânula foi, por conseguinte, feito por sondagem suave. Para evitar s...

Discussão

glândulas salivares muitas vezes recebem doses de radiação além do limiar da recuperação do tecido em pacientes submetidos à radioterapia para cancro do pescoço, ablação eletiva de linfonodos cervicais, ou malignidades hematológicas regionais. Embora as células acinares secretoras de fluido da glândula são terminalmente diferenciado, elas são paradoxalmente sensível à radiação. A função secretora cai dentro das primeiras semanas de radiação, e irreversíveis glândula dano resultou em uma produção crônica de baixo saliva....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de Polietileno Intramédico (PE10)	Becton Dickson	427401
Seringa de Insulina de 1/2 cc U-100	Becton Dickson	309306
Lágrimas Artificiais	Miller Vet Supply	5098-9840-64
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Perma-Hand sutura de seda	Ethicon	K833H
Graefe forcep	Fine Science Tools	11051-10
Olympus SZX16 Microscópio Estéreo	Hunt Óptica e Imagem 6
MV Acelerador Linear	Elekta
Bolus - Sem pele	Lâmpada de Calor Civco	MTCB410
	Braintree Scientific	HL-1  110V