Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Resumo

No nível subcelular, os eventos de sinalização são modulados dinamicamente por pistas ambientais e de desenvolvimento. Aqui descrevemos um protocolo que emprega o sistema de expressão transitória do tabaco para monitorar a interação dinâmica proteína-proteína e revelar a organização espacial da transdução de sinal em células vegetais.

Resumo

Visualização de eventos de sinalização dinâmicos em células vivas tem sido um desafio. Nós expandido um sistema de expressão transiente estabelecida, a complementação fluorescente (BiFC) biomolecular ensaio em células epidérmicas de tabaco, a partir de testes de interacção proteína-proteína para controlo da distribuição espacial da transdução de sinal em células de plantas. Neste protocolo, foi utilizado o ensaio BiFC para demonstrar que a interacção e a sinalização entre a Arabidopsis MAPKKK Yoda e MAPK6 ocorrem na membrana plasmática. Quando o basl proteínas scaffold foi co-expressa, a interação YODA-MAPK redistribuído e espacialmente co-polarizado com o CFP-basl. Este sistema de expressão modificado tabaco permite a análise rápida de sinalização de localização e dinâmicas mudanças (menos do que 4 dias) e pode acomodar várias cores de proteína fluorescente (pelo menos três). Também apresentamos métodos detalhados para quantificar a distribuição de proteínas (localização espacial assimétrica, ou "polarização";) Nas células do tabaco. Este sistema de expressão de tabaco avançado tem um potencial a ser amplamente utilizado para o teste rápido de eventos de sinalização dinâmicos em células de plantas vivas.

Introdução

As proteínas interagem dentro de uma intrincada rede e complexos de forma hierárquica, que desempenham um papel fundamental em quase todos os processos biológicos que ocorrem num ambiente celular imprevisível. No entanto, desde o desenvolvimento de respostas de crescimento da planta, tem havido uma falta de ferramentas conveniente que não só pode rapidamente mas também identificam eficientemente e monitorizar esses eventos de sinalização dinâmica ao nível subcelular.

O sistema de expressão de proteína transiente na epiderme da folha de tabaco tem vantagens atraentes para a visualização de proteínas fluorescentes em células vivas. Este sistema proporciona semi condições in vivo que permitem a modificação de proteínas pós-translacional e rápido exame de localização de proteínas. Ao examinar o sinal de YFP complementadas, o ensaio de complementação bimolecular fluorescente (BiFC) informa a possibilidade de interacção proteína-proteína em células de plantas. Em comparação com outros métodos, como por exemplo, a levedura de dois híbridos (y2h) e co-immunoprecipitation (Co-PI), BiFC também fornece um meio poderoso de visualizar compartimentos onde as interações proteína-proteína podem ocorrer ao nível subcelular.

Uma vez que a divisão celular assimétrica (ACD) mantém a população de células estaminais ao gerar novos tipos de células para a formação de tecido / órgão, é um mecanismo indispensável para promover multicelularidade eucariótica. Estomática desenvolvimento de Arabidopsis foi usado como um sistema modelo para o estudo em plantas ACD. A célula precursora, célula mãe meristemoid, divide assimetricamente para produzir duas células-filhas diferentes, um meristemoid (passa-tronco divisões celulares-like antes de terminar em um par de células-guarda) e uma célula estomática linhagem solo (SLGC) (pode dividir e diferenciar em uma célula pavimento), respectivamente (Figura 1). Em ACD estomática, o romance quebra de proteína de assimetria na Lineage estomática (basl) é polarizada premitotically para conduzir assimetrias divisão, que incassimetria física lude e destino celular assimetria ^1. Uma cascata MAPK composto pelo MAPKKK Yoda e as MAPKs, MPK3 e 6, são fundamentais para padronização divisão estomática e adoção destino ^{2,3, 4,5.}

Recentemente, Zhang et al. ligada a basl proteína polaridade para a via de sinalização YDA-MAPK em Arabidopsis stomatal ACD ^6. O canônica via YODA-MAPK, através MPK3 / 6, fosforila basl e ativa a sua polarização. Fosforilados funções basl como um andaime e recruta YODA (YDA) e MPK3 / 6 para formar um complexo de proteína e concentrar a sinalização no córtex de ⁶ células. Polarização dos componentes MAPK e o ciclo de feedback positivo entre basl ea via YDA-MAPK representa um novo mecanismo para a polarização de proteínas em células vegetais. Sinalização MAPK localmente enriquecido é a hipótese de estar intimamente ligado à diferenciação destino celular no stomatal ACD ⁶ (Figura 1). Um dos kEY dados experimentais que este modelo suportado veio a partir dos ensaios de tabaco que demonstraram a redistribuição espacial das MAPKs induzida pela expressão de basl ^6.

Em geral, não é fácil de monitorizar a sinalização MAPK, onde ocorre porque as moléculas de MAPK foram frequentemente encontrados em toda a parte no interior de uma célula. Neste estudo, utilizou-se o sistema split-YFP para visualizar a interacção entre a cinase a montante e a jusante os sugerir onde ocorre o relé de sinalização. Nós estendido ainda mais a utilização do sistema BiFC por co-expressão de uma terceira proteína (PCP-tag), com a divisão par YFP (sugestivo de interacção proteína-proteína) para visualizar se e como a YFP complementada podiam ser espacialmente modulado pela co- expressa a proteína PCP. Ao fazer isso, nós demonstramos que a co-expressão de CFP-basl induzida reorganização espacial das interações entre YDA e MPK6, a partir de uma distribuição uniforme para padronização polarizada no córtex célula da epiderme tabacocélulas al. Por conseguinte, este sistema tem o potencial de ser desenvolvido para monitorar eventos de sinalização dinâmica em células vegetais sob condições em que as células são desafiadas pelos estímulos internos ou externos (por exemplo, a co-expressão de outras proteínas, a aplicação química, ataque de agentes patogénicos ou alterações ambientais, etc. ).

Protocolo

1. O plasmídeo Construção

1. Gerar as construções por tecnologia de clonagem como descrito anteriormente ^1,6.
   1. Em primeiro lugar utilizar uma polimerase DNA de alta fidelidade com iniciadores adequados para amplificar as sequências de codificação de basl, YDA e MPK6 e sub-clonar-los em vectores de entrada. Encontre o protocolo detalhado no ^7.
   2. Para gerar as versões negativos dominantes de MPK6 e YDA (DNmpk6 ⁸ e DNyda ^4, respectivamente), utilizar os plasmídeos de entrada e MPK6 YDA como molde e introduzir as mutações pontuais por um método de mutagénese dirigida ao local ^9.
2. Para construir as construções para ensaios transientes de tabaco, realizar reações LR standard (attL x attR recombinação) (procedimento detalhado no ⁷⁾ para integrar basl em pH35CG ^10, DNyda e DNmpk6 em pXNGW e pXCGW vetores ^11, respectivamente.
   1. Confirmar os plasmídeos resultantes de digestão enzimática e sequenciamento. Uma vez que éuccessful, transformar as construções binários na estirpe de Agrobacterium tumefaciens GV3101 ¹² e fazê-los crescer em placas de selecção a 28 ° C durante 2 - 3 dias.

2. Preparação da solução de Agrobacterium Infiltração

1. Inocular algumas colónias Agrobacterium recém-transformadas em 10 ml de meio com antibióticos apropriados de Luria-Bertani (LB) (Gentamicina 25 ug / ml, A rifamicina 25 ug / ml, espectinomicina 100 ug / ml para pH35CG, pXNGW e pXCGW constrói; as mesmas concentrações a rifamicina de gentamicina e canamicina com 50 ug / ml para P19 (que expressa proteínas contra o silenciamento transgénico) ^13.
2. Crescer culturas de Agrobacterium em um agitador de 28 ° C à velocidade de 200 rpm durante cerca de 16 horas e, em seguida, medir a OD ₆₀₀ (estimado para alcançar 1,5-1,8) (Figura 2A-B). Girar as culturas a 2500 xg durante 10 min. Re-suspender e wash as peletes de células com 10 mM de MgCl ₂ (a solução de infiltração).
3. Girar as culturas novamente e re-suspender as pelotas com a quantidade apropriada de solução de infiltração para alcançar o DO final ₆₀₀ = 0,5 (Figura 2C-D). Antes de se infiltrar plantas, deixar as misturas de células à temperatura ambiente durante 1-3 h. Este passo ajuda a manter a homeostase celular.

3. Tobacco Plant and Injection Folha

1. Use plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana), cultivadas 4-5 semanas de idade em uma câmara de crescimento da planta normal (23 ° C com ciclos de 16 horas-luz / 8 h escuro) ¹⁴ para injeção de folha.
   Nota: Nesta fase, as plantas de tabaco normalmente têm 6 folhas (2 grandes, 2 médias e 2 pequenos). As duas folhas de tamanho médio são os mais ideal para injecção folha (os dois maiores são muito antigas, enquanto os dois pequenos são muitas vezes demasiado jovens).
2. Antes que o dia de infiltração, regar o TobacAs instalações de co para saturar o solo.
3. No dia infiltração, pré-incubar as plantas no escuro, durante 1-3 h. Este passo permite estomas na epiderme para abrir amplamente, o que facilita muito o Agrobacterium ao penetrar nas células da epiderme da folha.
4. Usando fitas de cores marcadas com datas, bandeira das folhas para ser infiltrada. Marque as áreas a serem infiltradas com um sharpie grosso preto (opcional; as áreas infiltradas são visíveis depois de ser infectado.).
5. Tome volumes iguais da Agrobacterium re-suspensão e misturá-los em um 100 x 15 mm placa de Petri por agitação suave (Figura 2E). Nota: No nosso caso, misturou-se 1 ml de p19 com 1 ml de PFR-basl, 1 ml de DNyda-NYFP e 1 ml de DNmpk-cYFP.
6. No processo de infiltração, encher uma seringa sem agulha de 3 ml com a mistura de infiltração (1 - 2 mL) e empurrar para o lado inferior (abaxial) da folha de tabaco (Figura 2F). Enquanto infiltrante, é útilde usar uma mão para empurrar e o outro lado para suportar suavemente o lado superior (adaxial, contra a força de impulsão).
   Nota: Uma vez que a mistura de infiltração é injetado com sucesso, as áreas infectadas se tornará facilmente reconhecível na epiderme. No entanto, a infiltração pode falhar devido à injeção dura (danos nos tecidos) ou de pressão insuficiente (sem penetração de líquidos). Para cada teste, sugerimos pelo menos duas injeções em duas folhas independentes (a partir de plantas diferentes).
7. Coloque as plantas infectadas de volta para a câmara de crescimento. Geralmente, as expressões proteína são detectáveis ​​depois de 48 horas a seguir a infiltração.

4. Imagem Confocal

1. Em 48 horas após a infiltração, use um furador para excisar um disco de folha da área injetada (normalmente 3 - 4 discos / área pode ser produzido) (Figura 2G). Use uma pinça para transferir suavemente os discos de folhas para um slide (o lado abaxial para cima) e montá-los com gotas de água. Evite pressionar muito hard na lamela porque espremido células / danificados não mostrará bem sob o microscópio confocal (Figura 2H).
2. Antes de imagem confocal, a varredura das amostras montado em um microscópio composto epi-fluorescente para verificar os níveis de expressão. Nota: Com base em nossa experiência, as células que apresentam níveis de expressão intermédias são melhor representadas sob o microscópio confocal.
3. Comece com o (1,3 NA) na lente de 40X de um microscópio confocal. Ajustar a corrediça para a posição desejada de modo a que as células que expressam níveis médios de proteína fluorescente permanecer no centro. Os espectros de excitação / emissão para PCP e YFP estão 458 nm / 480-500 nm e 514 nm / 520-540 nm, respectivamente.
4. Ativar o botão "Live" para pré-visualizar as imagens, em seguida, ajustar a intensidade do laser e ganho inteligente para o rácio de intensidade de fluorescência / ruído mais equilibrada. Para melhorar a qualidade de imagem, aumentar pixels de digitalização e / ou média frame / linha. Finalmente, ajuste o botão de focagem para reach o plano focal mediana e clique em "Capture" para tomar a imagem.
   Nota: O PCP e imagens YFP pode ser capturada sequencialmente ou simultaneamente, verificando ou desligar a opção de modo de digitalização "sequencial", respectivamente.
5. Quando Z-projeção é desejado para a visão em profundidade das células, selecione o modo de imagem "xyz", define a profundidade da gama de varredura (10 - 15 mm) e recolher as imagens a partir do topo para o fundo da célula alvo . Compilar as imagens obtidas com o software Leica com o botão direito no arquivo de imagem para selecionar "Renomear" e exportar imagens como arquivos .tiff.
6. Imagem 30 - 40 células para análise de quantificação.

Processamento 5. Imagem e Análise de Quantificação

1. Use um software de Fiji (http://fiji.sc/Fiji) para processar imagens e realizar a quantificação.
   1. Plotar os gráficos de intensidade de fluorescência.
      1. Para visualizar melhor se a expressão CFP / YFP éuniformemente distribuída, use Fiji para demonstrar a força do sinal da PCP e YFP ao longo da periferia da célula. Para conseguir isso, primeiro lançamento de Fiji, em seguida, selecione "Arquivo" e "Abrir" para iniciar a imagem. Clique em "linha" no menu de ferramentas e selecione "linha segmentada" clicando com o botão direito. Decidir a região de interesse e desenhar uma linha ao longo da periferia celular para rastrear o PCP ou o sinal YFP (Figura 3A-C).
         Nota: Fiji mede o valor da intensidade de fluorescência absoluta ao longo das linhas segmentadas.
      2. Selecione o menu drop-down "Analisar" e "Perfil Plot" para gerar um gráfico com valores de posição e intensidade que representam os níveis de CFP / YFP ao longo da linha segmentada. Se desejar, duplicar os valores de intensidade (selecionando o menu "Copiar") para o Excel ou outro software gráfico para gerar gráficos de intensidade comparáveis.
   2. Quantificar grau de polaridade.
      1. Recolha aproximadamente 20 represencélulas tivos a partir de 3 experiências duplicadas para avaliar o grau de polaridade do PCP e YFP em células de tabaco. Calcular o grau de polaridade com base na proporção da intensidade de fluorescência elevada (definido como H) através da intensidade de fluorescência baixa (definido como L). Nota: O método de quantificação é explicado na Figura 3.
         1. Para medir os valores de H e L, desenhe uma linha segmentada ao longo da região interessados ​​na periferia da célula (descrito acima), clique em "Analisar" no menu drop-down e selecione "Measure". Quando um "Resultados" janela aparece, use "Mean" valores para executar quantificação.
         2. A partir das células que exibem expressão relativamente uniforme de PCP e YFP, por exemplo, CFP-basl (Figura 3A) ou da YFP complementadas com co-expressão de DNyda-NYFP e DNmpk6-cYFP (Figura 3B), obter os valores de H e L medindo dois selecionados aleatoriamente segmentos periféricos com igual duração.
         3. a partir de células que exibem acumulação polar óbvia de proteínas fluorescentes, neste caso, a co-expressão de PCP-basl, DNyda-NYFP e DNmpk6-cYFP (Figura 3C), recolher os valores de H a partir das regiões periféricas com sinais de fluorescência enriquecidos e os Ls das regiões com baixo nenhuma acumulação / fluorescência.
         4. Reúnem-se os índices resultantes de H / L de 20 células juntos e teste para a distribuição normal. Calcule os valores de p pelo teste t de Student (para distribuição normal) ou o teste de Kolmogorov-Smirnov (KS) (para distribuição não normal).

Resultados

Para evitar a morte celular induzida pela sinalização MAPK hiperactivo, as versões inactivos cinase de YDA (DNyda) e MPK6 (DNmpk6) foram usadas no ensaio de co-expressão em células de tabaco. Nem a interação entre DNyda e DNmpk6 revelado por BiFC nem a própria gerado padrão de distribuição desigual (Figura 3A-B) CFP-basl. No entanto, quando PCP-basl foi introduzido no par interacção DNyda-DNmpk6, tanto PCP e sinais YFP foram redistribuídas para uma forma altamente polari...

Discussão

Uso geral e possíveis modificações do sistema de expressão transiente de tabaco para transdução do sinal: A sobre-expressão da proteína fluorescente (FP) tagged proteínas na epiderme do tabaco tem sido usado com sucesso para a análise rápida de proteína de localização subcelular em células vegetais. No entanto, o estudo de distribuição de sinalização dinâmica do complexo proteína in planta é um tema difícil, devido aos contextos subcelulares complicado, interacção proteína-proteína transiente e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Phusion DNA polimerase	New England Biolabs	M0530S
pENTR/D/TOPO	Life Technologies	K2400-20
QuickChange II XL Kit de mutagênese dirigida ao local	Tecnologia Agilent 200521
caldo LB	AMRESCO	J106-2KG
Bacto Agar	AMRESCO	J673-1KG
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G3632-1G
Rifampicina	Sigma-Aldrich	R3501-1G
Kanamicina	Sigma-Aldrich	K4000-25G
Espectinomicina	Sigma-Aldrich	S4014-5G
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
25 x 75 mm Slide	VWR	16004-382
Vidro de cobertura de 24 x 50 mm	VWR	48393-241
Microscópio confocal de varredura a laser	Leica	TCS SP5 II	LAS AF Lite software
lente objetiva 40X	Leica	HCX  Plano APO	HCX  Plano APO, NA 1.30
Centrífuga	Thermo Scientific	SORVALL 6+
Perfurador	Grampos
50 ml tubos de falcão	Genesee Scientific	21-108
No. 5 Fórceps	Canemco & Marivac	205EQA-Spec