Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Resumo

No nível subcelular, os eventos de sinalização são modulados dinamicamente por pistas ambientais e de desenvolvimento. Aqui descrevemos um protocolo que emprega o sistema de expressão transitória do tabaco para monitorar a interação dinâmica proteína-proteína e revelar a organização espacial da transdução de sinal em células vegetais.

Resumo

Visualização de eventos de sinalização dinâmicos em células vivas tem sido um desafio. Nós expandido um sistema de expressão transiente estabelecida, a complementação fluorescente (BiFC) biomolecular ensaio em células epidérmicas de tabaco, a partir de testes de interacção proteína-proteína para controlo da distribuição espacial da transdução de sinal em células de plantas. Neste protocolo, foi utilizado o ensaio BiFC para demonstrar que a interacção e a sinalização entre a Arabidopsis MAPKKK Yoda e MAPK6 ocorrem na membrana plasmática. Quando o basl proteínas scaffold foi co-expressa, a interação YODA-MAPK redistribuído e espacialmente co-polarizado com o CFP-basl. Este sistema de expressão modificado tabaco permite a análise rápida de sinalização de localização e dinâmicas mudanças (menos do que 4 dias) e pode acomodar várias cores de proteína fluorescente (pelo menos três). Também apresentamos métodos detalhados para quantificar a distribuição de proteínas (localização espacial assimétrica, ou "polarização";) Nas células do tabaco. Este sistema de expressão de tabaco avançado tem um potencial a ser amplamente utilizado para o teste rápido de eventos de sinalização dinâmicos em células de plantas vivas.

Introdução

As proteínas interagem dentro de uma intrincada rede e complexos de forma hierárquica, que desempenham um papel fundamental em quase todos os processos biológicos que ocorrem num ambiente celular imprevisível. No entanto, desde o desenvolvimento de respostas de crescimento da planta, tem havido uma falta de ferramentas conveniente que não só pode rapidamente mas também identificam eficientemente e monitorizar esses eventos de sinalização dinâmica ao nível subcelular.

O sistema de expressão de proteína transiente na epiderme da folha de tabaco tem vantagens atraentes para a visualização de proteínas fluorescentes em células vivas. Este sis....

Protocolo

1. O plasmídeo Construção

1. Gerar as construções por tecnologia de clonagem como descrito anteriormente ^1,6.
   1. Em primeiro lugar utilizar uma polimerase DNA de alta fidelidade com iniciadores adequados para amplificar as sequências de codificação de basl, YDA e MPK6 e sub-clonar-los em vectores de entrada. Encontre o protocolo detalhado no ^7.
   2. Para gerar as versões negativos dominantes de MPK6 e YDA (DNmpk6 ⁸ e DNyda ^4, respectivamente), utilizar os plasmídeos de entrada e MPK6 YDA como molde e introduzir as mutações pontuais por um método de mutagénese dirigida ao local ^9.

Resultados

Para evitar a morte celular induzida pela sinalização MAPK hiperactivo, as versões inactivos cinase de YDA (DNyda) e MPK6 (DNmpk6) foram usadas no ensaio de co-expressão em células de tabaco. Nem a interação entre DNyda e DNmpk6 revelado por BiFC nem a própria gerado padrão de distribuição desigual (Figura 3A-B) CFP-basl. No entanto, quando PCP-basl foi introduzido no par interacção DNyda-DNmpk6, tanto PCP e sinais YFP foram redistribuídas para uma forma altamente polari.......

Discussão

Uso geral e possíveis modificações do sistema de expressão transiente de tabaco para transdução do sinal: A sobre-expressão da proteína fluorescente (FP) tagged proteínas na epiderme do tabaco tem sido usado com sucesso para a análise rápida de proteína de localização subcelular em células vegetais. No entanto, o estudo de distribuição de sinalização dinâmica do complexo proteína in planta é um tema difícil, devido aos contextos subcelulares complicado, interacção proteína-proteína transiente e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Phusion DNA polimerase	New England Biolabs	M0530S
pENTR/D/TOPO	Life Technologies	K2400-20
QuickChange II XL Kit de mutagênese dirigida ao local	Tecnologia Agilent 200521
caldo LB	AMRESCO	J106-2KG
Bacto Agar	AMRESCO	J673-1KG
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G3632-1G
Rifampicina	Sigma-Aldrich	R3501-1G
Kanamicina	Sigma-Aldrich	K4000-25G
Espectinomicina	Sigma-Aldrich	S4014-5G
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
25 x 75 mm Slide	VWR	16004-382
Vidro de cobertura de 24 x 50 mm	VWR	48393-241
Microscópio confocal de varredura a laser	Leica	TCS SP5 II	LAS AF Lite software
lente objetiva 40X	Leica	HCX  Plano APO	HCX  Plano APO, NA 1.30
Centrífuga	Thermo Scientific	SORVALL 6+
Perfurador	Grampos
50 ml tubos de falcão	Genesee Scientific	21-108
No. 5 Fórceps	Canemco & Marivac	205EQA-Spec