Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Summary

Aqui, apresentamos protocolos para rastrear e caracterizar rapidamente enzimas quanto à atividade antimicrobiana. O ensaio de difusão em microlâminas e o ensaio de liberação de corante utilizam substratos bacterianos alvo para avaliação qualitativa e quantitativa da atividade enzimática.

Abstract

As avaliações iniciais de grandes bibliotecas microbianas para potenciais produtores de novas proteínas antimicrobianas requerem métodos qualitativos e quantitativos para rastrear enzimas-alvo antes de investir maior esforço e recursos de pesquisa. O objetivo deste protocolo é demonstrar dois ensaios complementares para a realização dessas avaliações iniciais. O ensaio de difusão em microlâminas fornece uma tela de detecção inicial ou simples para permitir a avaliação qualitativa e rápida da atividade proteolítica contra uma variedade de substratos-alvo bacterianos viáveis e mortos pelo calor. Como contrapartida, o aumento da sensibilidade e reprodutibilidade do ensaio de liberação de corante fornece uma plataforma quantitativa para avaliar e comparar as influências ambientais que afetam a atividade hidrolítica dos antimicrobianos proteicos. A capacidade de rotular substratos específicos de cultura de células mortas pelo calor com o corante R azul brilhante Remazol expande essa capacidade de adaptar o ensaio de liberação de corante para caracterizar a atividade enzimática de interesse.

Introduction

Os agentes antimicrobianos desempenham um papel essencial no direcionamento de uma ampla gama de microrganismos, como vírus, fungos e bactérias. As atividades antimicrobianas produzidas por várias bactérias variam em especificidade alvo de amplo espectro a espécie-específica, incluindo patógenos bacterianos clinicamente relevantes ¹. Na natureza, compostos antimicrobianos proteicos como bacteriocinas e lisinas representam um arsenal microbiano de ferramentas para autodefesa, replicação e aquisição de nutrientes ^2,3. Servindo como mediadores da dinâmica populacional dentro das comunidades microbianas, os antimicrobianos proteicos fornecem uma vantagem competitiva ao organismo produtor sobre as espécies sensíveis e não produtoras ⁴. Como enzimas recombinantes e probióticos, essas proteínas também têm uma importância econômica e social, pois a necessidade de novas fontes de controle de patógenos aumenta a cada nova expansão da resistência antimicrobiana na população bacteriana ⁵.

As primeiras avaliações de antimicrobianos proteicos recém-descobertos incluem a determinação das características físicas básicas inerentes à enzima. Métodos para triagem rápida de potenciais antimicrobianos permitem a seleção de candidatos com atividades hidrolíticas contra os substratos-alvo desejados. O ensaio de difusão em microlâminas e o ensaio quantitativo de liberação de corante permitem o uso de uma variedade de substratos na detecção de hidrólise enzimática. Para enzimas antimicrobianas proteicas com atividade contra a parede celular bacteriana, a versatilidade desses ensaios permite uma triagem rápida e eficaz, qualitativa e quantitativa contra células bacterianas viáveis (somente ensaio de microlâmina), substratos de células bacterianas inteiras mortas pelo calor ou peptidoglicano purificado da bactéria alvo. Esses ensaios têm utilidade na descoberta de enzimas antimicrobianas para uso em campos como terapêuticas alternativas, suplementos alimentares e inibidores da produção de biofilme.

O ensaio de difusão em microlâminas e o ensaio de liberação de corante são métodos demonstrados para detecção e caracterização de novos antimicrobianos proteicos. O ensaio de difusão em microlâminas fornece uma estimativa relativa (qualitativa) da atividade antimicrobiana e permite uma inferência mínima da concentração e atividade da enzima. Usando este método, a atividade é prontamente visualizada como o desenvolvimento de uma zona de lise com a ausência de atividade, resultando na falta de formação de zonas. A taxa de desenvolvimento da zona e o diâmetro da zona são indicativos da quantidade e pureza da enzima presente na amostra; no entanto, essa taxa e a qualidade da limpeza do substrato dentro da zona também podem ser afetadas pela presença de contaminantes, pela integridade da reação de hidrólise e pelo tipo de substrato. Contaminantes interferentes podem afetar a taxa de difusão enzimática do poço, enquanto hidrólise incompleta ou variação do tipo de substrato pode resultar em uma zona turva de lise ⁶.

O ensaio de liberação de corante avalia quantitativamente a quantidade de produtos de corante R azul brilhante de Remazol ligados covalentemente liberados no sobrenadante de reação do substrato hidrolisado enzimaticamente. O método tem apenas uma ligeira variabilidade associada a uma diferença no substrato, permitindo assim maior sensibilidade para detecção de hidrólise em comparação com o ensaio de difusão em microlâminas. Essas propriedades permitem que o método tenha utilidade na caracterização das propriedades bioquímicas da enzima e na padronização do ensaio para comparação entre diferentes enzimas antimicrobianas.

Neste protocolo, fornecemos métodos para realizar o ensaio básico de difusão de microlâminas e o ensaio de liberação de corante, demonstrando a escala dos limites de detecção e variabilidade para cada um. Os ensaios são usados para realizar avaliações básicas de um antimicrobiano proteico desconhecido purificado do sobrenadante da cultura de um isolado bacteriano de solo não caracterizado. As atividades observadas contra substratos de células bacterianas nos ensaios permitem a comparação das atividades de reação entre um antimicrobiano proteico não caracterizado anteriormente e a α-quimotripsina, uma enzima proteolítica de controle. Esses protocolos fornecem uma base para a aplicação das duas técnicas que podem ser expandidas e modificadas para acomodar aplicações variadas.

Protocol

1. Preparação de origem bacteriana e de peptidoglicano Substratos

Nota: os substratos de bactérias de células inteiras e os peptidoglicanos purificados são utilizados como substratos de enzimas, tanto no ensaio de difusão microlâmina e o ensaio de corante de libertação. Estes substratos requerem preparação antes de se realizar as reacções de enzimas. O protocolo seguinte descreve a sua preparação.

1. Total substrato celular bacteriana
   1. Produção de substrato celular bacteriana por inoculação de 500 mL de caldo nutriente com um 2 ml de cultura de uma noite de Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Incubar a 30 ° C com agitação (125 rpm) até a cultura atingir uma fase exponencial de crescimento, definida como uma fase de crescimento rápido que resulta na duplicação da cultura bacteriana. Para o cultivo de salmonela entérica subsp. Enterica (ATCC 10708), caldo de nutrientes usar como um meio de crescimento a 37 ° C com agitação (125 rpm).
   2. Calor-matar cada cultura em autoclave durante 10 min a 121 ° C sob 3 atm de pressão.
   3. Colher o substrato de bactérias mortas pelo calor por centrifugação durante 20 min a 5000 x g. Lavar o sedimento três vezes com 1 Tipo de água e re-suspensão numa quantidade mínima de água. Neste estudo, suspender os substratos em 1200 ul.
   4. Aliquota de 300 ul de substratos de células bacterianas para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e armazenar a 20 ° C.
2. Substrato Peptidoglicana purificada
   1. Purificar peptidoglicano da bactéria substrato alvo ^7-10 ou adquirir de um fornecedor (ver Materiais e Tabela Equipment). Purifica-se preparações de peptidoglicano em bruto a partir de polímeros da parede celular acessório.

2. Ensaio de Difusão qualitativa MicroSlide [Modificado de Lachica, et ai. ^11]

Nota: O ensaio de difusão MicroSlide éum método qualitativo para detectar a presença de enzima antimicrobiano numa amostra. À medida que a enzima se difunde através de um substrato contendo matriz de agarose, uma zona de compensação se desenvolve como a enzima hidrolisa o substrato. O protocolo seguinte descreve a preparação e o desempenho do ensaio de difusão microlâmina para detectar qualitativamente, a presença de agentes antimicrobianos de proteína.

1. Determinar a concentração da enzima antimicrobiano a ser avaliada utilizando um kit de ácido bicinconínico (BCA) de ensaio de proteína de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Utilizar solução salina tamponada com fosfato (PBS) como um tampão de enzima; No entanto, determinar empiricamente o tampão apropriado para a enzima dado.
3. Efectuar uma diluição em série da enzima antimicrobiana usando solução salina tamponada com fosfato (PBS) como um tampão de reacção. A diluição em série utilizado nestes ensaios de difusão MicroSlide produziu massas de proteína final de ensaio de 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 pg e 10 ug por volume de reacção.
4. Dispensar massas proteína em tubos de microcentrífuga individuais e ajustar os volumes de proteína de 20 ul utilizando PBS, em preparação para adição a MicroSlide poços de reacção.
5. Adicione uma solução de agarose a 0,5% por dissolução de 0,25 g de agarose em 50 ml de PBS. Aquece-se a solução à fervura até a agarose estar completamente dissolvida. Determinar a água perdida durante o processo de fusão, em peso, e adicionar de volta para a solução.
6. Adicionar 50 ul de 10% de azida de sódio em água à solução de agarose e ajustar a temperatura da solução para 50 ° C num banho de água. A azida de sódio é adicionado para inibir o crescimento bacteriano contaminante durante a incubação do ensaio de difusão microlâmina. Se as células viáveis ​​são utilizados como substrato, omitir a azida de sódio a partir da solução de agarose.
7. Descongelar o substrato bacteriana morta pelo calor em gelo.
8. Re-suspender o substrato bacteriana em 12 ml de solução de agarose a cerca correspondem a turbidez de uma 2,0 MCFArland equivalência padrão (ver Tabela de Materiais). Comparar as turvações das soluções de visualização de uma linha de preto sobre um fundo branco através das soluções, a adição de substrato bacteriana para a agarose até a turbidez aproximado é alcançado.
9. Imediatamente pipetar 3 ml de solução de agarose-substrato para cada microlâmina (25 x 75 x 1 ^mm3).
10. Depois de lâminas solidificar, perfurar três poços na camada de agarose-substrato de cada MicroSlide com uma sonda (diâmetro 4,8 mm). Adicionar 20 mL de cada diluição em série da proteína ajustados aos respectivos poços.
11. Use PBS (20 uL) ou albumina de soro de bovino (5 ug em 20 ul de PBS) num poço de controlo negativo. Use enzimas bacteriolíticas conhecidos apropriados para o substrato, tal como a lisozima, como um controlo positivo.
12. Incubar as lâminas numa câmara de humidade a 37 ° C ou a temperatura óptima de actividade da enzima. A duração da incubação depende da concentração ea actividade específica da enzima antimicrobiana. Um tempo de reacção típico é durante a noite (aproximadamente 16 horas).
13. Após a incubação, observar as lâminas sob luz e capturar imagens indiretos do ensaio de desenvolvimento usando uma câmera digital reflex de lente única com uma lente de 60 mm a uma distância focal de cerca de 30 cm.
    Nota: A actividade enzimática da proteína antimicrobiana para o substrato dado está correlacionado com o desenvolvimento de uma zona clara de hidrólise, que forma em torno do bem como o enzima difunde-se para a agarose.
14. Para se qualificar a atividade enzimática, observar os tamanhos das zonas que formam em torno de cada bem. alta actividade enzimática qualitativa refere a uma zona maior, enquanto que a baixa actividade enzimática refere-se qualitativamente a uma zona menor.

3. Substrato Labeling - Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling [Modificado de Zhou ^12]

Nota: No ensaio de corante de libertação, o substrato é covalentemente Linked para Remazol Brilliant corante R azul. O protocolo seguinte descreve a preparação de substratos de enzimas tingidos.

1. Adicione uma solução de hidróxido de sódio 250 mM (NaOH) por dissolução de 1 g de NaOH em 99 mL de água Tipo I a ser usada para fazer uma solução 200 mM de Remazol Brilliant Blue R corante (RBB).
2. Adicione uma solução RBB 200 mM por dissolução de 1,25 g de RBB em 98,75 ml ± 1 ml de uma solução de NaOH a 250 mM fresco (passo 3.1).
3. Re-suspender as células bacterianas mortas por calor a uma concentração de 0,5 g de peso fresco em 30 ml de solução de RBB. Para peptidoglicano purificado, re-suspender o peptidoglicano, a uma concentração de 0,3 g de peso fresco em 30 ml de solução de RBB.
4. Incubar a mistura de reacção num balão de Erlenmeyer, numa plataforma rotativa durante 6 h a 37 ° C com mistura suave.
5. Transferir a mistura reaccional a 4 ° C incubadora e incubar durante uma 12 horas adicionais, com mistura suave.
6. Após a incubação, o substrato tingido colheita por centrifugação a 3000 xgdurante 30 min. Decantar a solução corante a partir do sedimento substrato.
7. Remover o corante solúvel não-covalentemente ligada a partir dos substratos por lavagem das células marcadas com corante ou peptidoglicano repetidamente (aproximadamente 3-5 lavagens com água) Tipo I seguido de centrifugação. Com cada adição de água, re-suspender o pellet cuidadosamente.
   Nota: Quando não ligado tintura, solúvel não é mais visível na lavagem com água após a centrifugação. O substrato deve ser dada uma lavagem adicional. Note-se que o substrato vai permanecer azul, enquanto que o sobrenadante da última lavagem será claro.
8. Armazenar os substratos tingidos em suspensão numa quantidade mínima de água a -20 ° C para uso posterior.

4. Quantitative Dye-lançamento de Ensaio

Nota: Durante o ensaio de corante de libertação, a hidrólise de substrato de RBB-tingido nas versões reacção enzimática produtos tingidos para o sobrenadante da reacção. medição colorimétrica da quantidade de corante libertado indica o amount da actividade enzimática presente na amostra para uma dada enzima. O método quantitativo permite a comparação de diferentes enzimas em todo substratos e permite variações de condições ambientais que influenciam a reacção enzimática (por exemplo, temperatura, salinidade e de pH). O protocolo seguinte descreve a preparação e o desempenho do ensaio de libertação de corante para a detecção quantitativa da actividade enzimática da proteína antimicrobianos.

1. Preparação para o ensaio Dye-release
   1. Permitir que o substrato tingido congelado para voltar à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com tampão de ensaio (PBS), que é empiricamente determinada para a enzima dado.
   2. Calcular o volume de suspensão de substrato que é necessário, multiplicando o volume de reacção de 200 ul por o número de ensaios de libertação de corante a ser executada.
   3. Prepara-se o substrato de suspensão por adição do substrato tingido com o volume de tampão de ensaio, determinado em 4.1.2, até uma densidade óptica (OD) de 2,0 é atingida a 595 nm utilizando um espectrofotómetro. Para permanecer dentro das limitações funcionais do espectrofotômetro, medir a 2,0 OD ₅₉₅ de 1,0 para uma diluição de 1: 1 da solução concentrada. Utilize tampão de ensaio como um branco.
      Nota: A turbidez substrato para a reacção pode ser aumentado para além de 2,0 para coincidir com os níveis de enzimas de actividade altamente eficientes.
   4. Suspender a proteína antimicrobiana ser avaliada em tampão de ensaio a uma concentração estimada de 1 mg / ml.
   5. Utilizando o ensaio de microplacas de um kit de ensaio de BCA proteína de acordo com o protocolo do fabricante, determinar a concentração real da amostra de proteína a ser ensaiada. Ajustar a concentração da suspensão de pasta a 1 mg / mL utilizando tampão de ensaio.
2. Utilizando o ensaio Dye-release para determinar as condições óptimas de incubação para uma proteína antimicrobiana
   1. Diluir a suspensão antimicrobiana proteína de ações para 100 ng / mL. Esta concentração dá afmassa de reacção inal de 1 ug de proteína por unidade de volume (10 mL) adicionada à reacção do ensaio.
   2. Determine o intervalo térmico para ser avaliada para a proteína bacteriolytic. A gama térmica nestes ensaios incluídos 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C, e 65 ° C.
   3. Realizar os ensaios de reação em 0,5 ml tubos de microcentrífuga. Para cada condição térmica, adicionar 10 ul de estoque a proteína a 200 ul de suspensão de substrato preparado.
   4. Incubar em um termociclador durante 8 horas, com mistura por inversão, uma vez por hora.
   5. Após a incubação, prender as reacções pela adição de 25 ul de etanol.
   6. Retirar, o substrato não digerido insolúvel por centrifugação a 3000 xg durante 2 min, e transferir 150 ul do sobrenadante de cada mistura de reacção para a reacção a uma microplaca de 96 poços de fundo plano, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento de substrato não digerido.
   7. Medir a actividade enzimática da proteína Antimicrobial para o substrato determinado através da determinação da quantidade de corante solúvel em RBB dissociado do substrato após a hidrólise enzimática. Para quantificar a actividade enzimática, medir a absorvância do sobrenadante a 595 nm usando um espectrofotómetro de microplacas. O aumento da absorvância pelo corante solúvel libertada para o sobrenadante do substrato marcado é uma medida quantitativa da actividade enzimática.
      Nota: A alteração na absorvância é representada por unidades de actividade (AU), em que 1 UA resultados em um aumento de 0,01 para a densidade óptica do sobrenadante da reacção de libertação do corante a 595 nm. Uma reacção em branco, incubou-se com todos os componentes da reacção, com excepção da enzima, é utilizada para subtrair qualquer corante que liberta do substrato RBB-rotulado, devido à incubação. A temperatura enzimática óptima fornece a medição unidade de atividade de pico.
   8. Repita os passos através 4.2.1 4.2.7 utilizando vários tampões de incubação, para determinar as condições de tampão óptimas para a enzima antimicrobiana. em tstes ensaios, utilizar PBS.
3. Utilizando o ensaio de corante de libertação para determinar a concentração mínima activa na temperatura óptima de incubação para uma proteína antimicrobiana
   1. Efectuar uma diluição em série da suspensão da proteína antimicrobiana usando o tampão de ensaio. A gama de diluição série irá variar com a actividade da enzima antimicrobiana. A diluição em série usado nestes ensaios produziram quantidades de proteína final de ensaio de 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 jag e 10 ug.
   2. Execute cada ensaio de reação em uma microplaca de fundo de 48 poços plana. Para cada condição de ensaio, adicionar 10 ul de suspensão a respectiva proteína de 200 ul de suspensão de substrato preparado. Ajustar qualquer variação de volume da solução de proteína adicionada à reacção de 10 ul usando tampão de reacção.
   3. Selar a microplaca com filme placa de vedação para evitar a variação de volume devido à evaporação. Incubar numa incubadora agitadora a o óptimo determinado notemperatura cubation para a proteína antimicrobiana dada durante 16 horas com agitação.
   4. Após a incubação, prender a reacção por adição de 25 ul de etanol a cada poço e remover o substrato não digerido por centrifugação a 3000 xg durante 2 min.
   5. Transferir 150 ul do sobrenadante de cada mistura de reacção para a reacção a uma microplaca de 96 poços de fundo plano, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento do substrato não digerido.
   6. Para quantificar a actividade enzimática, medir a absorvância do sobrenadante a 595 nm usando um espectrofotómetro de microplacas. Uma reacção em branco, incubou-se com todos os componentes da reacção, com excepção da enzima, é utilizada para subtrair qualquer corante que liberta do substrato RBB-rotulado, devido à incubação. O aumento da absorvância pelo corante solúvel libertada para o sobrenadante do substrato marcado proporciona uma medida quantitativa de actividade enzimática.
      Nota: A variação de absorvância é representado por unidades de actividade (UA), onde 1 Resultados da UA emum aumento de 0,01 para a densidade óptica do sobrenadante da reacção de libertação do corante a 595 nm.

Results

O ensaio de difusão MicroSlide e no ensaio de corante-release quantitativa são métodos eficazes para o rastreio e medição investigações iniciais de novos antimicrobianos proteínas. Cada ensaio tem vantagens e limitações; No entanto, quando realizado em conjunto, eles permitem o rastreio inicial rápida e caracterização de base de um agente antimicrobiano.

O ensaio de difusão MicroSlide permite de forma eficiente para a pesquisa rápida de bibliotecas microbianas, produzindo proteína antimicrobianos. Quando os níveis de concentração da enzima é de preocupação, a sensibilidade de detecção de constrangimentos podem limitar o ensaio, o que requer uma maior quantidade de enzima a ser adicionada à reacção bem que o ensaio de corante de libertação. Tal como ilustrado na Figura 1, as propriedades qualitativas do ensaio permitir que o observador para comparar quantidades relativas de enzimas presentes dentro de cada poço.

Figura 1A (25? g de enzima), o bordo de ataque da zona exibe lise turva ou incompleta do substrato, enquanto que a zona mais próxima do poço exibe um substrato de lise mais completa. Este fenómeno, um produto de diminuição da concentração do enzima de difusão na vanguarda, dificulta a medição exacta do diâmetro da zona. Como os poços B (15 ug), C (10 ug), D (5 ug), E (1,0 g), e F (0,1 ug) são observadas na Figura 1, o diâmetro da zona de lise completa dissipa à extinção correlacionando-se com a diminuição da quantidade de enzima. Para condição F (0,1 ug), a concentração de enzima dentro da agarose é inferior ao limite que permita a difusão da enzima para ser visualizado como ele se move através da agarose, a hidrólise do substrato. O ensaio de difusão MicroSlide também foi executado usando purificados Bacillus subtilis Peptidoglycan como substrato (Figura 2). Enquanto a zona é menos definida do que aqueles observados com células inteiras de Salmonella enterica devido à relutância dos peptidoglicanos para suspender uniformemente no agarose, a hidrólise do peptidoglicano pela enzima antimicrobianos desconhecido é aparente.

O ensaio de libertação de corante é um ensaio mais sensível e versátil do que o ensaio de difusão microlâmina, permitindo que um limite de detecção inferior e variação dos factores ambientais que afectam a reacção enzimática. Em ensaios representativos, a temperatura foi alterada para determinar a temperatura óptima para a enzima antimicrobiana, determinada para ser de 35 ° C em PBS (Figura 3). Este óptimo é visto claramente nos sobrenadantes de reacção como o aumento das quantidades de cor azul (Figura 3B), bem como representada em unidades de actividade derivadas de medições de absorvância a 595 nm (Figura 3A). oversatilidade do ensaio de corante de libertação permite ao investigador que variam não só as temperaturas, mas também o tampão de reacção e os componentes do tampão de determinar rapidamente as condições de incubação óptimo para uma dada enzima.

O nível de enzima desconhecido antimicrobiana (Figura 4) e a enzima de controlo α-quimotripsina (Figura 5) actividade foram medidos à temperatura de incubação ideal determinada de 35 ° C em PBS contra substrato morta pelo calor Bacillus subtilis RBB-rotulados. A comparação dos resultados da Figura 4 e Figura 5 indica que a enzima antimicrobianos desconhecido tem quase duas vezes a afinidade para o B. substrato subtilis. Além disso, o controlo α-quimotripsina não digerir completamente o B. morta pelo calor subtilis substrato dentro do poço (dados não mostrados). A actividade do controlo α-quimotripsina começa a chapearau cerca de 0,3 ug, em comparação com o aumento contínuo em unidades de actividade em todas as quantidades de enzimas para a enzima antimicrobianos desconhecido (Figura 4 e Figura 5). Isto pode indicar que a enzima desconhecido tem uma maior actividade sustentada ou que há um maior número de locais de clivagem disponível para a enzima dentro do B. substrato subtilis.

Figura 1:. Actividade da Enzima contra Salmonella enterica Total substrato celular O ensaio de difusão microlâmina foi utilizado para avaliar qualitativamente a actividade antimicrobiana de uma proteína desconhecida contra Salmonella enterica subsp morta pelo calor entérica (ATCC 10708).. As massas de proteína antimicrobiana do desconhecido suspenso em solução salina tamponada com fosfato (PBS) que foram adicionadas aos respectivos poçosas lâminas incluídos 25 ug (poço A), 15 ug (bem B), 10 ug (bem C), 5 ug (D bem), 1 ug (bem E), e 0,1 ug (bem F). PBS foi usado para os controlos negativos dos ensaios. Zonas de lise foram fotografadas após uma incubação de 6 horas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2:. Actividade da Enzima contra o Bacillus subtilis celular peptidoglicano da parede O ensaio de difusão microlâmina foi utilizado para avaliar qualitativamente a actividade antimicrobiana de uma proteína desconhecida com peptidoglicano de Bacillus subtilis 168. Suspendido em 20 ul de PBS, 10? G do antimicrobiano desconhecido foi adicionado a bem Um dos microslides. PBS foi usado como um negativode controlo para o ensaio (bem B). A zona de lise foi fotografada após um período de incubação de 6 horas a 37 ° C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3:. Temperatura de reacção óptima para uma proteína antimicrobiana A versatilidade do ensaio de libertação de corante permite a variação de parâmetros físicos e químicos, tais como temperaturas e tampões de incubação, para determinar as suas influências sobre a actividade da enzima de interesse ^6. Conforme ilustrado nesta figura, a actividade antimicrobiana da proteína desconhecida (1 ug) foi avaliada em PBS contra Bacillus subtilis mortas pelo calor RBB-rotulados sob uma gama de temperaturas de incubação. Exibidas como unidades de actividade (UA) em (A), a absorção da RBB-bound produtos libertada para o sobrenadante após a hidrólise foi medida a 595 nm utilizando um espectrofotómetro de microplacas. Em cada condição de temperatura, reacções sem enzima adicionada foram usadas para subtrair os efeitos de qualquer corante libertado que resultou da incubação às várias temperaturas. Os sobrenadantes de reacção correspondentes a cada temperatura de incubação foram fotografadas antes da medição de absorbância (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4:. Gama de actividade para uma proteína antimicrobiana A gama de actividade para o antimicrobiano proteína desconhecida foi medida como unidades de actividade após incubações durante a noite para 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, e 1000 ng , tal como medido pelo BCA Protensaio ein (A). Para estas reacções, o RBB-rotulados B. subtilis nível do substrato foi aumentada para se obter uma densidade óptica de 5,0 a 595 nm para assegurar que a reacção com a maior quantidade de enzima (1,000 ng) não hidrolisam completamente todo o substrato disponível dentro do período de incubação da reacção. As reacções de controlo sem enzima adicionada foram usadas para subtrair os efeitos de qualquer corante libertado causada por si só a incubação. Os sobrenadantes de reacção correspondentes a cada quantidade de enzima foram fotografadas antes de medições de absorvância (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5:. Gama de actividades para α-Quimotripsina A gama de actividade para α-quimotripsina foi medida como activunidades ity após incubações durante a noite para 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 e 1000 ng de enzima (A). Para estas reacções, o RBB-rotulados B. subtilis nível do substrato foi aumentada para se obter uma densidade óptica de 5,0 a 595 nm para assegurar que a reacção com a maior quantidade de enzima (1,000 ng) não hidrolisam completamente todo o substrato disponível dentro do período de incubação da reacção. As reacções de controlo sem enzima adicionada foram usadas para subtrair os efeitos de qualquer corante libertado causada por si só a incubação. Os sobrenadantes de reacção correspondentes a cada quantidade de enzima foram fotografadas antes de medições de absorvância (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O ensaio de difusão MicroSlide e no ensaio de corante-release fornecem vantagens para detectar e caracterizar antimicrobianos proteínas não identificadas anteriormente. Estes métodos rápidos e sensíveis permitir o rastreio de alto rendimento de bibliotecas de código do organismo para a identificação de enzimas de interesse antes de investir maiores recursos de pesquisa. Como enzimas alvo de alto nível são identificados, variações dos ensaios de detecção pode ser usado para detectar rapidamente a enzima ou para determinar as características bioquímicas da enzima. Por exemplo, durante um regime de vários passos de purificação de proteína, o ensaio de difusão microlâmina pode detectar rapidamente fracções que continham a enzima de interesse. Além disso, optima de reacção para a enzima pode ser determinada alterando os tampões de reacção e temperaturas de incubação no ensaio de libertação de corante.

O intervalo de massa enzima necessária para a detecção no ensaio de difusão microlâmina é uma função da enzima caracteristics. limitações de detecção do ensaio geralmente requerem a utilização de maiores quantidades de enzima do que o ensaio de corante de libertação. Neste estudo, a comparação dos limites de detecção do ensaio de difusão microlâmina (Figura 1) para o ensaio de corante de libertação (Figura 4) ilustrou que o ensaio de difusão microlâmina é uma técnica menos sensível do que o ensaio de corante de libertação. Quando a concentração de enzima não é uma preocupação, o ensaio MicroSlide permite a triagem inicial rápida de bibliotecas para a produção de proteínas antimicrobianos contra substratos alvo com baixas exigências de trabalho e de equipamento. Embora exigindo mais esforço e equipamento, o ensaio de corante de libertação é mais sensível e reprodutível, obtendo-se resultados quantitativos que permitem a comparação entre ensaios de corante de libertação do mesmo ou de diferentes enzimas para um determinado substrato. Os dois métodos são facilmente realizados na maioria dos laboratórios microbiológicos sem necessidade de instrumentação altamente especializado. Na representaçãoensaios tivas, a enzima de controlo, α-quimotripsina, foi detectada em quantidades tão baixas quanto 100 ng (Figura 5) utilizando o ensaio de corante de libertação, enquanto o valor mínimo detectado no ensaio de difusão microlâmina foi de 1 mg (dados não mostrados).

Fornecendo utilidade como um ensaio para a detecção qualitativa enzimas antimicrobianos, um número de variações do ensaio de difusão foram relatados ^11,13. Ao rever estes ensaios, o ensaio de difusão MicroSlide foi desenvolvido para sua relativamente alta sensibilidade como uma tela inicial e por sua facilidade de observância reação. Modificado a partir do trabalho de Lachica et al. ^11, na qual camadas de agarose foram usadas para detectar a produção de nucleases por estirpes de Staphylococcus aureus, o ensaio de difusão MicroSlide opera de forma semelhante ao método de imunodifusão radial ¹⁴ como a proteína difunde-se a partir do bem para a de agarose contendo o substrato. O immunodiffu radialmétodo sion interrompe a expansão da zona de imunoprecipitação quando o sistema atinge um equilíbrio de formação de complexo entre o antigénio e o anticorpo de difusão dentro da agarose. Em contraste, o substrato no ensaio de difusão microlâmina é inicialmente digerido pela proteína antimicrobiana de difusão numa zona em contínua expansão de lise em torno do poço. O diâmetro crescente da zona continua até que a enzima perde actividade ou o substrato é esgotado. A taxa de produção da zona de lise é acelerado como a pureza, e, assim, a actividade específica, da enzima ou a concentração da enzima adicionada ao poço aumenta.

Para avaliar quantitativamente a actividade enzimática da proteína antimicrobianos contra morta pelo calor B. subtilis, foi escolhido o ensaio de corante-release. ensaios colorimétricos utilizando Remazol brilhante corante azul R (RBB) marcado com substratos permitir a avaliação versátil e sensível de proteínas activi antimicrobianaty. A hidrólise enzimática de substrato resultados RBB-rotulados na libertação de produtos solúveis azuis que podem ser facilmente medida por um espectrofotómetro a 595 nm. Diversas variações do ensaio de libertação de corante RBB, desenvolvidas para caracterizar outras proteínas, enzimas antimicrobianos mostrar a flexibilidade deste ensaio para aplicação com outros substratos. Por exemplo, para determinar os efeitos da actividade de lisostafina bacteriolíticos, Zhou, et al., Relataram um ensaio de corante de libertação utilizando células de estafilococos RBB-tingido e estafilococos peptidoglicano como substratos ^12. Numa modificação da aplicação do presente ensaio de corante de libertação RBB, RBB-rotulados substrato Micrococcus luteus foi proposto para utilização como um meio rápido e sensível para o diagnóstico e a tela para as doenças tais como a infecção bacteriana e a presença de um carcinoma maligno, que pode ser correlacionada com os níveis de expressão de lisozima em soro de sangue humano ^15. Além disso, os substratos de células bacterianas RBB-marcados ter umalso sido utilizada num método para a detecção zimograma de lisozima ^16.

Demonstramos o limite de detecção reduzido, conveniência, e a reprodutibilidade do ensaio de corante de libertação, permitindo a rápida rastreio da biblioteca para a produção da enzima. As modificações do ensaio permitir para ensaios de caracterização jusante quantitativos bioquímicos, incluindo efeitos da temperatura, pH, salinidade e, bem como os efeitos de outras enzimas proteolíticas sobre a actividade de proteínas antimicrobianas ^6. Além disso, o ensaio de corante de libertação quantitativa pode ser utilizado para comparar as actividades de várias enzimas para um determinado substrato. O ensaio de libertação de corante RBB relatou utilidade para enzimas com actividade contra polissacáridos em adição à caracterização e a detecção de agentes antimicrobianos de proteína. Pettersson e Eriksson relatado um ensaio para detectar a actividade endoglicanase usando amorfos, grânulos de polissacarídeos RBB-tingidos de celulose, xilana, manana, e bilheteem ^17. Em uma expansão destes resultados, um método sensível para detecção de enzimas quitinase produzidos por Bacillus thuringiensis Bt-107 foi desenvolvido utilizando quitina coloidal marcado com RBB ^18. A partir destes e outros estudos, as fontes disponíveis comercialmente de substratos tingidos RBB-surgiram para utilização na detecção da actividade glicolítica, incluindo aquelas contra a queratina, amilopectina, amilose, glicogénio, laminarina, d-xilano, Azo-glucano de cevada, e amido.

Neste estudo, que demonstram a utilidade do ensaio de corante de libertação em um formato de microplacas, reduzindo o volume de substrato de RBB-marcados e enzima requerida para produzir o resultado colorimétrico. Tal como ilustrado na Figura 4 e na Figura 5, o ensaio de corante de libertação de microplacas proporciona um limite de detecção inferior do que o ensaio de difusão microlâmina para a detecção de actividade enzimática. No que diz respeito ao uso rápido, conservação do trabalho, e facilidade de interpretação, o micensaio de difusão roslide fornece utilidade em telas de alto rendimento iniciais para a presença de actividade antimicrobiana, bem como a indicação da presença de proteína antimicrobiana nos passos de isolamento e purificação de proteínas a jusante. A combinação destes dois ensaios complementam um ao outro na triagem inicial e final caracterização de novos agentes antimicrobianos proteínas

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplaca de fundo plano de 48 poços com tampa de baixa evaporação	Becton Dickinson	3078
Microplaca de fundo plano de 96 poços (Costar 3595)	Corning, Inc.	3595
agarose	Fisher Scientific	BP162-100
&alfa;-quimotripsina	MP Biomedicals	215227205
Bacillus subtilis 168	American Type Culture Collection	23857
C1000 Touch Thermal Cycler	Broca de cortiça Bio-Rad
	Humboldt	H-9661
lisozima	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Padrão de equivalência McFarland (2.0)	Microlâminas Fisher Scientific	R20412
Caldo nutriente		Fisher
solução salina tamponada com fosfato (1x)	Teknova	P0200
Pierce BCA	Life Technologies	23227
Synergy HT espectrofotômetro de microplacas	BioTek Instruments, Inc.
Corante R azul brilhante Remazol (RBB)	Sigma-Aldrich	R8001
Salmonella enterica subsp. enterica	American Type Culture Collection	10708
azida de sódio	Fisher Scientific	S227-100
hidróxido de sódio (NaOH)	Fisher Scientific	S318-500
Titer Tops filme de polietileno adesivo pré-cortado	Diversified Biotechnology	T-TOPS-50
Água destilada UltraPure	Invitrogen	10977-015
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solution
solução de agarose 50 ml PBS 0,25 g de agarose			Adicione 10% de azida de sódio à solução de PBS/agarose fundida
meio de caldo nutritivo 4 g de caldo de nutrientes 500 ml de água
250 mM solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1 g de NaOH 99 ml de água
tipo I200 mM de corante R azul brilhante de remazol (RBB) 1,25 g RBB 98,75 ml de solução