Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Summary

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Abstract

As células dendríticas (CDs) são células apresentadoras de antigénios profissionais primariamente responsável pela aquisição, processamento e apresentação de antigénios no antigénio que apresenta moléculas para iniciar a imunidade mediada por células-T. As células dendríticas podem ser separados em vários subconjuntos fenotipicamente e funcionalmente heterogéneas. Três subconjuntos importantes de células dendríticas esplênicas são plasmocit�des, as células CD8a ^POS e CD8a ^Neg. As DCs plasmocitoides são produtores naturais de interferão de tipo I e são importantes para a imunidade de células T anti-viral. O subconjunto de CD8a ^Neg DC é especializado para apresentação de antígenos MHC classe II e está envolvido no centro de priming células T CD4. O CD8a ^Pos DCs são os principais responsáveis ​​para a apresentação cruzada de antígenos exógenos e priming células T CD8. As DCs CD8a ^Pos ter sido demonstrado ser mais eficaz na apresentação de antigénios de glicolípidos por moléculas CD1d a um cel t especializadol população conhecidas como células invariante natural killer T (iNKT). A administração de ligando Flt-3 aumenta a frequência de migração de células progenitoras de células dendríticas a partir da medula óssea, resultando em última análise, a expansão de células dendriticas em órgãos linfóides periféricos em modelos murinos. Temos este modelo adaptado para purificar grandes números de células dendríticas funcionais para utilização em experiências de transferência de células para comparar proficiência in vivo de diferentes subconjuntos de DC.

Introduction

As células dendríticas (DC) foram descobertos há quase quarenta anos como o "grande estreladas celular (dendron grego)" encontrado nos órgãos linfóides ^1. Muitos estudos têm demonstrado que DC são as únicas células que apresentam o antigénio que pode estimular eficazmente células T ingénuas ^2. Uma das principais funções destas células é a absorção de antigénios e apresentação e o seu processamento eficiente e carregamento destes para moléculas que apresentam antigénios. No baço de ratinho, as DCs pode ser separado em subconjuntos e plasmocit�des convencionais. As DCs plasmocitoides são caracterizados por uma baixa expressão de CD11c e....

Protocol

Experiências em animais são feitos de acordo com as directrizes aprovadas do comitê institucional cuidados com os animais e uso (IACUC). Todos os procedimentos que requerem a esterilidade são realizadas em uma cabine de segurança biológica.

1. Implantação de Melanoma B16.Flt3L em Ratos

1. Cultura da linha expressando Flt-3 de células de melanoma B16 em frascos de cultura de tecidos T25, a uma densidade de 0,5 X 10 ⁶ células / ml em meio DMEM completo com 10% de CO ₂ a 37 ° C. Crescer até as células atingirem confluência ~ 90% (~ 20 h).
2. Colher as células por digestão com tripsina. Aspirar os meios de....

Results

O resultado deste procedimento baseia-se na ampliação de subconjuntos de DC de murino por Flt-3L expressos pelas células de melanoma implantado. O tumor B16.Flt3L foi derivado a partir de um ratinho C57BL 6 /, e deve ser implantado num animal com essa estirpe de fundo, a fim de evitar o fracasso do tumor para se estabelecer devido à rejeição. Em alguns casos, pode ser desejável a utilização de ratinhos geneticamente modificados para derivar as DCs com defeitos conhecidos nas vias de sina.......

Discussion

As células dendríticas são aceites como sendo a principal antigénio profissional células envolvidas na iniciação de respostas de células T apresentando. Sua função principal é fazer um levantamento do microambiente do tecido, tomando-se e processar antigénios para apresentação às células T. A fim de estudar a função dos subconjuntos de DC específicos, estes devem ser isolado em quantidade suficiente usando uma abordagem que mantém o seu fenótipo e funções normais. A maioria dos protocolos contar com o isolamento de DC s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% de tripsina-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurano	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Colagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (pó seco)	QIAGEN	79254
Etanol à prova de 200	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Usado para preparar
tampão de lise de RBC	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 médio com L-glutamina	Life Technologies, Gibco	11875-119
Meio DMEM com L-glutamina	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamina	Life Technologies	25030081
aminoácidos não essenciais MEM	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM aminoácidos essenciais	Tecnologias de Vida	11130-051
β-mercaptoetanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Piruvato de sódio	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Solução salina tamponada com fosfato (PBS Ca2+ e Mg2+ pH livre 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco' s PBS (DPBS com Ca2+ e Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Solução de etilenodiaminotetraacetato (EDTA)	Life Technologies	15575-020
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Soro fetal para bezerros	Atlanta Biologicals	S11050
Penicilina/estreptomicina	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (pó seco)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0,08% com PBS
Kit de Isolamento de Células Dendríticas Plasmocitoides II, camundongo	Miltenyi Biotech	130-092-786
Contas magnéticas conjugadas com CD11c anti-camundongo;	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8α Kit de isolamento DC de mouse Pos	Miltenyi Biotech	130-091-169
Anticorpo bloqueador do receptor Fc-gama (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8&alfa;-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
Seringas de 1 ml	BD	26048
23 G1 agulha	BD	305145
placas de Petri de 100 mm	875712		Cirúrgicos Thermo Fisher
	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Filtro de células (70 µ m)	BD	352350
Grandes placas de Petri	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
(500 ml (0.22 µ m))	Corning	431097
colunas LS	Miltenyi	130-042-401
Separador MACS com suporte magnético	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μ l pontas de pipeta		PerkinElmer
Corning	Corning	CLS3474-24EA
camundongos C57BL/6 fêmeas de 6-8 semanas de idade	Jackson Research Laboratories, linhagem
Murine B16.Flt3L	descrita por Mach et al., 2000
10  mM) Tampão HEPES de 5 ml (1 M) 5 ml de L-glutamina (200  mM) 0,5 ml de 2-mercaptoetanol (5,5 x 10-2 M)			dependendo da sua necessidade. Filtre esterilize a mídia passando por um 0,22 µ Sistema de filtragem a vácuo M.
Meios RPMI e DMEM completos			Adicione 50 ml de soro fetal de bezerro inativado pelo calor ao meio RPMI ou DMEM livre de soro para obter um meio completo.
MACS			Adicione 2 ml de EDTA 0,5 M e 10 ml de soro fetal de bezerro inativado pelo calor a 500 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, Ca2+ e Mg2+ Free, pH 7,2) e 2  µ g/ml 2,4G2 (anticorpo Fc-Block).
Tampão de coloração FACS			Dissolva a azida sódica a 0,05% (0,25 g por 500 ml) em tampão MACS para obter tampão de coloração
FACS10x solução estoque de colagenase D e DNase 1 Dissolva 1 g de colagenase D e 0,2 ml de estoque de DNase 1 (1 mg / ml, 100x) em 20 ml de PBS contendo Ca2+ e Mg2+ para obter uma solução de aproximadamente 1.000-2.000 unidades de atividade da colagenase por ml.			Esta solução estoque de 10x pode ser preparada com antecedência e armazenada a -20 &graus; C por várias semanas. Diluir 1 ml com 9 ml de RPMI livre de soro imediatamente antes da utilização.