O ensaio de cometa alcalino mede quebras de fita de DNA em células eucarióticas. Ao adicionar uma etapa de digestão de endonuclease III ou 8-oxoguanina-DNA-N-glicosilase humana, o ensaio pode detectar com eficiência danos oxidativos ao DNA. Descrevemos métodos para usar esses ensaios para detectar danos ao DNA no fígado de ratos.
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Artigo de método
In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver
Neste artigo
Resumo
Resumo
Danos ao DNA não reparados podem levar à instabilidade genética, o que, por sua vez, pode aumentar o desenvolvimento do câncer. Portanto, identificar potenciais agentes prejudiciais ao DNA é importante para proteger a saúde pública. O ensaio de cometa alcalino in vivo, que detecta danos ao DNA à medida que quebras de fita, é especialmente relevante para avaliar os riscos genotóxicos dos xenobióticos, pois suas respostas refletem a absorção in vivo, distribuição tecidual, metabolismo e excreção (ADME) de produtos químicos, bem como o processo de reparo do DNA. Comparado a outros ensaios de danos ao DNA in vivo, o ensaio é rápido, sensível, visual e barato e, ao converter o dano oxidativo ao DNA em quebras de fita usando enzimas de reparo específicas, o ensaio pode medir o dano oxidativo ao DNA de maneira eficiente e relativamente livre de artefatos. A medição de danos ao DNA com o ensaio cometa pode ser realizada usando projetos de estudo toxicológico agudo e subcrônico e, ao integrar o ensaio cometa com outras avaliações toxicológicas, o ensaio atende aos requisitos de bem-estar animal, fazendo o máximo uso dos recursos animais. Outra grande vantagem dos ensaios é que eles requerem apenas uma pequena quantidade de células, e as células não precisam ser derivadas de populações de células em proliferação. Os ensaios também podem ser realizados com uma variedade de amostras humanas obtidas de indivíduos expostos clínica ou ocupacionalmente.
Introdução
O ensaio cometa alcalino mede rupturas dos filamentos de DNA no nível de uma única célula. As suspensões de células únicas são incorporados em agarose sobre uma lâmina de microscópio e as células lisadas para formar nucleoids, que contêm circuitos de super-enrolados ADN. Eletroforese em pH> 13 resulta na perda de supercoiling em loops de DNA contendo quebras de fita, com os fios libertados de DNA migram para o ânodo, a criação de estruturas semelhantes a cometas que podem ser observados por microscopia de fluorescência. ADN fragmentado migra a partir da "cabeça" do cometa na "cauda" com base no tamanho do fragmento, e a fluorescência relativa da cauda do cometa em co....
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Protocolo
Ética declaração: Procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da FDA Centro de US / Nacional para toxicológica Research.
NOTA: O desenho do estudo aqui descrito é baseado no protocolo desenvolvido pelo Centro Japonês de Validação de Métodos Alternativos (JACVAM) para a sua validação do ensaio in vivo de roedores cometa alcalino 18, e ainda mais modificada com base em recomendações da OECD TG489 19 .
1. Preparação
- preparação da lâmina
- Dissolve-se agarose de fusão normal a 1% (w / v) em tampão de fo....
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Resultados
O ensaio cometa alcalina in vivo foi realizada em conjunto com o ensaio cometa modificado por enzima para medir tanto o dano oxidativo directa de ADN e no fígado dos ratos tratados com o acetato de ciproterona (CPA) 5. CPA é um fármaco hormonal sintética que induz tumores de fígado de rato de uma forma dependente do sexo, com cinco vezes doses mais elevadas necessárias para induzir tumores do fígado em ratos machos em comparação com as fêmeas 24. Nós descob.......
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Discussão
Este protocolo descreve a medição simultânea tanto dos danos de ADN directa e oxidativo no fígado de rato ao nível da célula individual. O protocolo geral é aplicável a qualquer tecido a partir do qual as células individuais ou núcleos podem ser isolados com o mínimo de danos de DNA induzidos por transformação (isto é, danos no ADN induzida não pelo agente de teste, mas pelo manuseamento e processamento dos tecidos animais). Em nossa pesquisa, realizamos ensaios cometa alcalino em células da medula óssea 7.......
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Divulgações
Nenhum dos autores tem interesses conflitantes ou conflitantes. As informações contidas nesses materiais não são uma disseminação formal de informações pela FDA e não representam a posição ou política da agência.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Food and Drug Administration dos EUA. Reconhecemos a publicação original do estudo CPA da Elsevier BV: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Análise dose-resposta específica por sexo da genotoxicidade em ratos F344 tratados com acetato de ciproterona. Pesquisa de Mutação 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lamínulas (Nº 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Fisher | 12-550-123 | ||
| Fisher | 67-68-5 | ||
| EDTA, Dissódico | Fisher | BP120-1 | |
| Solução salina tamponada com fosfato | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Solução salina balanceada (HBSS) (Ca2+, Mg2+ livre) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Baixo ponto de fusão Agarose ( LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Tiras | BP1356-100 | |
| (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Cloreto de Potássio | Fisher | 7447-40-7 | |
| Hidróxido de Potássio | Fisher | 1310-58-3 | |
| etiquetas deslizantes (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Cloreto de Sódio (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Hidróxido de Sódio (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Ouro | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Trizma | 9002-93-1 | |
| da Fisher | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml | Fisher | 05-402-6 | |
| (40 µ m) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Diluição 1:1.000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Diluição 1:1.000 |
Referências
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiati....
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Reimpressões e permissões
