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Artigo de método

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

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DOI:

10.3791/53833

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4 de maio de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Genetic and Molecular Toxicology, US FDA/National Center for Toxicological Research, 2Toxicologic Pathology Associates, US FDA/National Center for Toxicological Research

Neste artigo

Resumo

O ensaio de cometa alcalino mede quebras de fita de DNA em células eucarióticas. Ao adicionar uma etapa de digestão de endonuclease III ou 8-oxoguanina-DNA-N-glicosilase humana, o ensaio pode detectar com eficiência danos oxidativos ao DNA. Descrevemos métodos para usar esses ensaios para detectar danos ao DNA no fígado de ratos.

Resumo

Danos ao DNA não reparados podem levar à instabilidade genética, o que, por sua vez, pode aumentar o desenvolvimento do câncer. Portanto, identificar potenciais agentes prejudiciais ao DNA é importante para proteger a saúde pública. O ensaio de cometa alcalino in vivo, que detecta danos ao DNA à medida que quebras de fita, é especialmente relevante para avaliar os riscos genotóxicos dos xenobióticos, pois suas respostas refletem a absorção in vivo, distribuição tecidual, metabolismo e excreção (ADME) de produtos químicos, bem como o processo de reparo do DNA. Comparado a outros ensaios de danos ao DNA in vivo, o ensaio é rápido, sensível, visual e barato e, ao converter o dano oxidativo ao DNA em quebras de fita usando enzimas de reparo específicas, o ensaio pode medir o dano oxidativo ao DNA de maneira eficiente e relativamente livre de artefatos. A medição de danos ao DNA com o ensaio cometa pode ser realizada usando projetos de estudo toxicológico agudo e subcrônico e, ao integrar o ensaio cometa com outras avaliações toxicológicas, o ensaio atende aos requisitos de bem-estar animal, fazendo o máximo uso dos recursos animais. Outra grande vantagem dos ensaios é que eles requerem apenas uma pequena quantidade de células, e as células não precisam ser derivadas de populações de células em proliferação. Os ensaios também podem ser realizados com uma variedade de amostras humanas obtidas de indivíduos expostos clínica ou ocupacionalmente.

Introdução

O ensaio cometa alcalino mede rupturas dos filamentos de DNA no nível de uma única célula. As suspensões de células únicas são incorporados em agarose sobre uma lâmina de microscópio e as células lisadas para formar nucleoids, que contêm circuitos de super-enrolados ADN. Eletroforese em pH> 13 resulta na perda de supercoiling em loops de DNA contendo quebras de fita, com os fios libertados de DNA migram para o ânodo, a criação de estruturas semelhantes a cometas que podem ser observados por microscopia de fluorescência. ADN fragmentado migra a partir da "cabeça" do cometa na "cauda" com base no tamanho do fragmento, e a fluorescência relativa da cauda do cometa em comparação com a intensidade total (cabeça e cauda) pode ser utilizado para quantificar a quebra do ADN 1 , 2. O ensaio é simples, sensível, versátil, rápido, e relativamente barato 1. A detecção de ADN fragmentado causada por agentes que danificam o DNA é usado um ensaio para quantificar os danos no DNA em células ou isolado a partir de núcleos inditecidos duplos de animais tratados com o material potencialmente genotóxico (s). Devido às suas vantagens, o ensaio cometa in vivo é recomendada como um segundo ensaio in vivo genotoxicidade (emparelhado com o ensaio de micronúcleos in vivo) para a realização de avaliações de segurança de produtos no actual Conferência Internacional de Harmonização (ICH) 3 e Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA ) 4 diretrizes regulamentares. Em nosso laboratório, nós empregamos o ensaio para avaliar danos DNA vivo induzida por ingredientes alimentares, produtos farmacêuticos e nanomateriais 5-10. fígado de rato vai ser utilizado como exemplo neste protocolo, mas o ensaio de cometa pode ser realizado com outros tecidos / órgãos de animais experimentais, desde que as células individuais podem ser isoladas intactas a partir do tecido.

Certos tipos de danos no DNA são difíceis de detectar, como rupturas dos filamentos de DNA sem modificar o ensaio cometa alcalino básico. No caso de dano oxidativo ao DNA, costa breaks podem ser criados em lesões oxidativas em ADN por digestão com enzimas de reparação, tais como humano 8-oxoguanina-ADN-N-glicosilase 1 (hOGG1, que cria intervalos de 8-oxoguanina (8-oxoGua) e metil-fapy-guanina 11. além disso, endonuclease III (Endo III) cria intervalos principalmente em pirimidinas oxidados 1. Assim, a adição de um passo de digestão enzimática torna o ensaio de um método específico e sensível para medir lesões oxidativas do ADN in vivo 12. Utilizando estes ensaios, que demonstraram lesões oxidativas do ADN induzida por agente tóxico no fígado de ratos e ratinhos de 6-8 e no coração de ratos 10.

O ensaio cometa alcalino tem muitas aplicações em toxicologia genética e biomonitorização humana: 1) como um follow-up ensaio in vivo para genotoxinas identificadas pela sensível in vitro testa 3,13, 2) para avaliar mecanismos de dano ao DNA induzido xenobióticos em vários tecidos 14, 3) para investigar se acancerígena funciona utilizando um modo não-genotóxica de ação (MOA) 7 genotóxicos ou, 4) para avaliar DNA reparação de danos 15, 5) para investigar doenças humanas e exposições ocupacionais 16, e 6) como um potencial ensaio de rastreio de alto rendimento para -órgão específico genotoxicidade 17.

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Protocolo

Ética declaração: Procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da FDA Centro de US / Nacional para toxicológica Research.

NOTA: O desenho do estudo aqui descrito é baseado no protocolo desenvolvido pelo Centro Japonês de Validação de Métodos Alternativos (JACVAM) para a sua validação do ensaio in vivo de roedores cometa alcalino 18, e ainda mais modificada com base em recomendações da OECD TG489 19 .

1. Preparação

  1. preparação da lâmina
    1. Dissolve-se agarose de fusão normal a 1% (w / v) em tampão de fosfato (Ca 2+, Mg 2+ livre e sem vermelho de fenol), por aquecimento num forno de microondas.
    2. Coloque a solução de agarose a 1% fundida padrão em um banho de água a 55 ° C e equilibrar a temperatura com o banho. microscópio Dip lâminas de vidro para a solução de agarose, drenar qualquer excess agarose e limpe a parte de trás das lâminas limpas. Colocar as lâminas em posição vertical sobre uma superfície plana e permitem que as lâminas secar à RT; armazenar as lâminas em local seco.
  2. Preparação de soluções de teste do cometa
    1. Preparar a solução de agarose de baixo ponto de fusão de 0,5%. Dissolver baixo ponto de fusão de agarose em tampão de fosfato (Ca 2+, Mg 2+, e sem vermelho de fenol), por aquecimento num forno de microondas. Mantenha a solução a 37-45 ° C durante a preparação da lâmina cometa; descartar qualquer solução de agarose restante depois.
    2. Preparar tampão de lise. Adicione uma solução 100 mM de dissódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA dissódico, Sr. 372,24 g / mol), cloreto de sódio 2,5 M (NaCl, Sr. 58,44 g / mol), e 10 mM de tris-hidroximetil-aminometano (Tris Base, Sr. 121,14 g / mol) em água purificada, e ajustar a pH 10 com 10 uma solução de hidróxido de sódio (NaOH, Mr 40 g / mol). No dia da utilização, adicionar Triton X-100 e sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sr. 78,13 g / mol) à solução para alcançar Concentrat definitivaiões de 1% e 10%, respectivamente, e agita-se a 4-10 ° C durante pelo menos 30 min antes da utilização.
    3. Faça tampão enzimática fresca no dia de uso. Prepara-se uma solução contendo 40 mM de ácido 2- [4- (2-hidroxietil) piperazin-1-il] etanossulfónico (HEPES, Sr. 238,3 g / mol), cloreto de potássio 100 mM (KCl, Sr. 74,55 g / mol), 0,5 mM EDTA dissódico, e 0,2% de albumina de soro bovino (BSA, Mr 66463 g / mol) em água purificada. Ajustar o pH a 8,0 com solução 10 N de hidróxido de potássio (KOH, 56,1 g / mol). Agita-se à temperatura ambiente e verificar dissolução completa antes da utilização.
    4. Prepara-se uma solução tampão alcalina contendo NaOH 300 mM e 1 mM de EDTA dissódico em água purificada. Agita-se a 4-10 ° C durante pelo menos 30 min antes da utilização. Medir o pH da solução antes da utilização e certificar-se de que o pH é> 13.
    5. Prepara-se uma solução de 0,4 M de Tris base em água purificada, e ajustar para pH 7,5 com ácido clorídrico (HCl, Sr. 36,46). Guardar a solução a 4-10 ° C. Isto é neutralizantes tampão.
    6. Faça fresh tampão picados no dia de uso. Prepara-se uma solução contendo 20 mM de EDTA dissódico e DMSO a 10% em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS, Ca 2+, Mg 2+, e sem vermelho de fenol). Armazenar em gelo até à sua utilização.
    7. Para preparar a solução de coloração, uma solução diluída de estoque mancha fluorescente ácido nucleico com Tris-borato-EDTA (tampão TBE) a 1: 10000 (v / v). Proteger a solução da luz usando papel alumínio. Armazenar de 2-8 ° C e usar com 24 hr.

2. Preparação de suspensões de células isoladas de fígado de rato

  1. Euthanize ratos com CO métodos seguintes 2 gás recomendadas nas Diretrizes American Medical veterinários para a eutanásia de animais: 2013 Edição 20.
    1. Definir a taxa de fluxo de CO 2 em 2.75. Coloque o rato na câmara de eutanásia (por exemplo, frasco secador, gaiola de ratos com tampa ventilada) e ligue o CO 2, abrindo a válvula do tanque. Espere por 1,5 a 2,5 min até orato torna-se inconsciente. Aumentar o fluxo de CO 2 para a sua configuração máxima. Após cessação de respiração, deixar o rato na câmara durante cerca de 1 min para assegurar a eutanásia. Verifique eutanásia por palpação para confirmar que o rato não tem batimentos cardíacos, e beliscando os dedos do pé para determinar que o rato não retirar a membro.
  2. Desinfectar o cabelo-pele com etanol 70%. Abrir a cavidade abdominal e remover o fígado intacto com tesouras cirúrgicas. Após a remoção do fígado, remover o lobo lateral esquerdo do fígado restante com tesouras cirúrgicas. Coloque o lobo lateral esquerdo em uma placa de corte, e cortar dois 3-4 mm cortes transversais de espessura adjacentes usando uma lâmina descartável só fio de navalha.
  3. Coloque uma secção transversal em papel de filtro (para evitar o enrolamento da secção), e colocar a secção em formalina a 10% tamponada neutra (NBF). Assegure-se que a proporção de NBF a 10% para o tecido é de 10: 1 ou superior. Depois de um tempo de fixação de pelo menos 72 h, Process o fígado para exame histopatológico (consulte a secção 7, abaixo).
  4. Coloque a segunda secção transversal do fígado em 5 ml de tampão gelado picagem (secção 1.2.6) numa placa de 6 centímetros de Petri e lavar 3 vezes para remover o sangue residual.
  5. Transferir a secção de fígado para um tubo de centrífuga de 2 ml novo contendo 1 ml de tampão de picagem gelada. Picar a secção de fígado bem enxaguada com um par de tesouras finas para libertar as células. Coe a suspensão de células através de um filtro de células 40 mm para remover todas as protuberâncias do tecido.
  6. Colocar a suspensão de células individuais em gelo e usar-se para fazer lâminas dentro de 1 hora. Verificar a concentração de células por contagem (por exemplo, com um hemocitómetro ou contador de células electrónico) para garantir que a sua concentração é de aproximadamente 2 x 10 6 células / ml.

3. Preparação de Comet Slides

  1. Misturar um volume da suspensão de célula única com 10 volumes de fusão, 37 ° C, solução de agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% (secção 1.2.1).pipeta imediatamente 100 ul numa lâmina revestida com agarose ponto de fusão normal (seção 1.1). Imediatamente coloque uma lamela sobre a mistura de células-agarose. Fazer pelo menos 8 desliza para cada amostra.
    NOTA: Todas as lâminas devem ser identificados por um número ou código semelhante e sua identidade registrada, de modo que as lâminas podem ser marcados de forma cega (veja 6.2.2, abaixo).
  2. Coloque os slides plana e fria a 4 ° C durante 30 min.
  3. Depois que o gel tem solidificado, remover suavemente as lamelas e mergulhe as lâminas em tampão de lise pré-refrigerados (ponto 1.2.2). Proteger as lâminas de luz e manter as lâminas em tampão de lise a 4 ° C a partir de 1 h (mínimo) de O / N (máximo).

4. Enzyme Tratamento de Comet Slides

  1. Remover 6 dos 8 diapositivos preparados a partir de cada amostra de tecido a partir do tampão de lise e lavá-los 3x durante 5 min cada, com tampão de enzima (secção 1.2.3) à TA. Use os restantes dois slides para o ensaio cometa alcalino without enzima-tratamento (ver 5.1, abaixo). Após a lavagem, retire o excesso de líquido por drenagem e secar as lâminas com os tecidos.
  2. Dilui-se stocks de enzima Endo hOGG1 e III com tampão de enzima a 1: 1000 (v / v). Colocar em gelo até à sua utilização.
  3. Aplicar 200 ul das soluções a seguir para os slides preparados a partir de cada grupo de tratamento: 200 ul de tampão de enzima sozinhos (2 slides utilizados como lâminas de referência), 200 solução ul hOGG1 (2 slides) ou 200 ul de Endo solução III (2 slides).
  4. Coloque os slides em placas de Petri forradas com papel toalha umedecido, cobrir as lâminas com Parafilm e incubar a 37 ° C durante 45 minutos para Endo III-tratada e lâminas de referência e 30 min para slides tratados hOGG1.
  5. Após a incubação, as lâminas enxaguar com água destilada e continuar o processamento como descrito em 5.2, abaixo.

5. desenrola e Eletroforese

  1. Para slides não tratado com enzimas, remova os slides do tampão de lise, Drenar as lâminas e lavar uma vez com tampão de neutralização frio (secção 1.2.5) durante 5 minutos para remover o detergente e os sais residuais.
  2. Colocar as lâminas de Passos 4.5 e 5.1 aleatoriamente em um tanque de eletroforese em gel horizontal, evitando quaisquer espaços. Encha o tanque com pH> 13 tampão de electroforese feita recentemente (secção 1.2.4) até que o nível do líquido cobre apenas os slides (evitar bolhas sobre a agarose e certifique-se o tanque está nivelado). Grave o pH e a temperatura no início do desenrolamento do ADN.
  3. Deixe as lâminas permanecem no tampão alcalina durante 20 min para permitir o desenrolamento do DNA e a expressão dos danos alcalino-susceptível.
  4. Durante o desenrolamento, o programa de fornecimento de energia para a produção de 0,7 V / cm no tanque de electroforese (V / cm = Volts dividida pela distância em centímetros entre os eléctrodos positivos e negativos).
  5. Depois de desenrolar, pressione o botão Executar da fonte de alimentação. Se necessário, ajustar a corrente de 300 mA, aumentando ou diminuindo o nível do tampão. Mantenha thnível tampão e apenas acima da superfície das lâminas. Efectuar a electroforese a 4 ° C durante 20 min. Grave a colocação slide, a temperatura do buffer e as correntes (AMPS) no início e no final de eletroforese.
    NOTA: O excesso de tampão irá resultar em tensões mais baixas que podem interferir com a migração de ADN.
  6. Após a eletroforese, neutralizar o excesso alcalino, levantando suavemente as lâminas do tanque e imersão em tampão de neutralização (ponto 1.2.5) durante 5 min. Escorra os slides e repetir mais duas vezes.
  7. Fixar as lâminas por imersão em etanol frio a 100% durante 5 min. Permitir que as lâminas para o ar seco e coloque em uma área seca para armazenamento.

6. DNA Coloração, Comet visualização e análise

  1. coloração DNA
    1. Colocar as lâminas em uma bandeja de papelão ou metal e adicione 200 ml de solução de mancha de trabalho nucleico fluorescente ácido (secção 1.2.7) para cada slide e cobrir com uma lamela de vidro. Proteger os slidesluz para permitir que as lâminas se mantenham em contacto com a solução de coloração, durante pelo menos 30 minutos antes da contagem. Corar as lâminas em lotes de 20 de cada vez.
    2. Antes de ler cada slide, suavemente apagar afastado solução de coloração excesso, tomando cuidado para não perturbar a tampa de vidro.
  2. Visualization cometa e Scoring
    1. Use uma câmera de vídeo acoplada a um microscópio de fluorescência para visualizar imagens ao vivo da lâmina cometa no monitor do computador.
    2. Aleatoriamente escolher um campo do microscópio contendo células. Usando um mouse, selecione uma célula. Clique no centro do "cabeça do cometa" com o botão esquerdo do mouse.
      NOTA: O software de computador calcula os parâmetros de medida para a célula e adiciona os dados para um ficheiro de dados.
    3. Marcar todas as células no campo atual (veja o passo 6.2.4), e, em seguida, usar os controles do estágio do microscópio e o vídeo na tela para encontrar um outro conjunto de células. Pontuação essas células, como descrito em 6.2.2.
    4. Marcar o slide from direita para a esquerda e para baixo para cima. Escolha cerca de 10 campos aleatoriamente. Durante este processo, qualquer célula cometa adequado que aparece no campo de visão deve ser marcado sem viés.
      NOTA: Não marcar um cometa se qualquer uma das seguintes situações: 1) ele está localizado em qualquer uma das extremidades da corrediça; 2) dois ou mais cometas se sobrepõem; 3) há detritos na cauda; 4) o software não é possível diferenciar entre a cabeça e a cauda; ou 5) a coloração do núcleo e / ou cauda difere grandemente de outras cometas sobre a corrediça.
      NOTA: cometas com quase toda a sua fluorescência do ADN na cauda são muitas vezes referidos como cometas "ouriço". cometas hedgehog não deve ser marcado, mas o número de ouriços detectados durante o placar de slides devem ser registrados e relatados como percentagem de cometas totais.
    5. Analisar pelo menos 75 cometas por slide, leitura dois slides por órgão / tecido para obter pelo menos 150 células / cometa amostra total. Depois do número requerido de células a partir de uma corrediça tem seren marcou, o resultado é salvo como um arquivo de planilha para análise de dados mais tarde.

7. Análise Histopatologia

  1. Depois de um mínimo de 72 horas de fixação em NBF a 10%, seguido de tecido de corte 21, rotineiramente processar e incorporar o lobo lateral esquerdo do fígado das amostras em uma parafina-cera com base em forma 22. Secção as amostras em cerca de 5 micra e recolher em lâminas de vidro.
  2. Corar as secções com hematoxilina e eosina (H & E):
    1. Aquece-se as lâminas com as secções de tecido de parafina numa estufa a 60 ° C durante 2 horas antes do procedimento de coloração.
    2. Use xileno para Desparafinar os lados. Reidratar as lâminas com etanol graduado (EtOH) a uma lavagem com água da torneira em execução.
    3. Colocar as lâminas em 450 ml de hematoxilina em 2 min e 40 seg. Lavar as lâminas com ácido (ácido acético glacial 2 ml a 450 ml de água deionizada) para 4 seg seguido de 5 min correndo lavagem com água da torneira.
    4. Coloque o deslizouES em EtOH 450% 70 mL contendo 1 mL de hidróxido de amónio durante 2 min, seguido por água corrente da torneira de lavagem durante 2 min e 30 seg, e 70% de EtOH de lavagem para 1 min.
    5. Incubar as lâminas com 450 ml de solução de eosina Y contendo ácido acético glacial, 4 ml, durante 3 minutos.
    6. Desidratar as lâminas com EtOH classificados. Limpar as lâminas com xileno (três vezes 1 min cada), e mantenha slides em xileno até lamínulas são colocados sobre os slides.
  3. Examine os slides por microscopia de luz, os resultados recordes, e as lesões de grau não neoplásicas para a gravidade como 1 (mínima), 2 (moderada), 3 (moderada), ou 4 (marcado).
    NOTA: O grau de gravidade aplicada para uma lesão específica baseia-se no peso relativo do fígado, com a lesão (= mínimas <1-15%; 16-35% = ligeira, moderada = 36-60%; e marcado = 61- 100%).

8. Análise de Dados

  1. O animal é considerado a unidade experimental para avaliações estatísticas. dano do ADN é expressa como% DNUm na cauda.
  2. dano oxidativo ao DNA é calculado da seguinte forma: os slides de referência (sem tratamento enzimático) fornecer uma estimativa das rupturas dos filamentos de ADN de fundo (SB).
    NOTA: Os slides tratado com enzimas fornecer uma medida de rupturas dos filamentos e bases oxidadas (SB + Ox). Assumindo que uma resposta a dose linear de DNA% em cauda como uma função de danos no ADN, a partir da subtracção do SB SB + OX dá uma estimativa de quebras da cadeia de ADN a partir de purinas / pirimidinas oxidados alterados 23.
  3. Analise% em ADN da cauda, ​​como uma função da dose por ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Dunnett para comparações de pares de respostas nos animais tratados com o controlo do veículo.
    NOTA: Todos os testes são uma cauda e um valor de p inferior a 0,05 é definido como o critério para a significância estatística.

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Resultados

O ensaio cometa alcalina in vivo foi realizada em conjunto com o ensaio cometa modificado por enzima para medir tanto o dano oxidativo directa de ADN e no fígado dos ratos tratados com o acetato de ciproterona (CPA) 5. CPA é um fármaco hormonal sintética que induz tumores de fígado de rato de uma forma dependente do sexo, com cinco vezes doses mais elevadas necessárias para induzir tumores do fígado em ratos machos em comparação com as fêmeas 24. Nós descob...

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Discussão

Este protocolo descreve a medição simultânea tanto dos danos de ADN directa e oxidativo no fígado de rato ao nível da célula individual. O protocolo geral é aplicável a qualquer tecido a partir do qual as células individuais ou núcleos podem ser isolados com o mínimo de danos de DNA induzidos por transformação (isto é, danos no ADN induzida não pelo agente de teste, mas pelo manuseamento e processamento dos tecidos animais). Em nossa pesquisa, realizamos ensaios cometa alcalino em células da medula óssea 7...

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Divulgações

Nenhum dos autores tem interesses conflitantes ou conflitantes. As informações contidas nesses materiais não são uma disseminação formal de informações pela FDA e não representam a posição ou política da agência.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Food and Drug Administration dos EUA. Reconhecemos a publicação original do estudo CPA da Elsevier BV: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Análise dose-resposta específica por sexo da genotoxicidade em ratos F344 tratados com acetato de ciproterona. Pesquisa de Mutação 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Lamínulas (Nº 1, 24 x 50 mm) Fisher12-544-14
Fisher12-550-123
 Fisher67-68-5
EDTA, DissódicoFisherBP120-1
Solução salina tamponada com fosfatoFisherICN1860454
1x Hanks Solução salina balanceada (HBSS) (Ca2+, Mg2+ livre)HyCloneSH30588.02
HEPESFisherBP310-1
Baixo ponto de fusão Agarose ( LMP)Lonza50081NuSieve GTG Agarose
Normal Melting Agarose (NMA) TirasBP1356-100
(pH 7.5-14)FisherM95873
Cloreto de PotássioFisher7447-40-7
Hidróxido de PotássioFisher1310-58-3
etiquetas deslizantes (0.94 x 0.5 in.)FisherNC9822036
Cloreto de Sódio (NaCl) Fisher7647-14-5
Hidróxido de Sódio (NaOH) Fisher1310-73-2
SYBR™ Ouro InvitrogenS11494
Triton X-100 Trizma9002-93-1
da FisherFisher77-86-1
2.0 mlFisher05-402-6
(40 µ m)Fisher22363547
Endonuclease III (Nth) New England BiolabsM0268SDiluição 1:1.000
hOGG1 New England BiolabsM0241SDiluição 1:1.000
Lâminas de Microscópio Dimetilsulfóxido (DMSO) de papel de teste de pH Fisher Base Tubos de microcentrífuga Filtro de células

Referências

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