A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia

Summary

A imuno-histoquímica é uma poderosa técnica de laboratório para avaliar a localização e expressão de proteínas nos tecidos. Os métodos semiautomatizados atuais de quantificação introduzem subjetividade e muitas vezes criam resultados irreproduzíveis. Aqui, descrevemos métodos para imuno-histoquímica multiplexada e quantificação objetiva da expressão e co-localização de proteínas usando imagens multiespectrais.

Abstract

A imuno-histoquímica é uma técnica de detecção clínica e laboratorial comumente usada para investigar a expressão e localização de proteínas nos tecidos. Muitos sistemas semiquantitativos foram desenvolvidos para pontuar a expressão usando imuno-histoquímica, mas a subjetividade inerente limita a reprodutibilidade e a precisão dos resultados. Além disso, a investigação de biomarcadores espacialmente sobrepostos, como fatores de transcrição nuclear, é difícil com as técnicas atuais de imuno-histoquímica. Desenvolvemos e otimizamos um sistema para investigação simultânea de múltiplas proteínas usando métodos de alto rendimento de imuno-histoquímica multiplexada e imagem multiespectral. A imuno-histoquímica multiplexada é realizada pela aplicação sequencial de anticorpos primários com anticorpos secundários conjugados à peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina. Diferentes cromógenos são usados para detectar cada proteína de interesse. As lâminas coradas são carregadas em um scanner de lâminas automatizado e um protocolo é criado para aquisição automatizada de imagens. Uma biblioteca espectral é criada colorindo um conjunto de lâminas com um único cromógeno em cada uma. Um subconjunto de imagens coradas representativas é importado para o software de imagem multiespectral e um algoritmo para distinguir o tipo de tecido é criado definindo compartimentos de tecido nas imagens. Os compartimentos subcelulares são segmentados usando a contracoloração de hematoxilina e ajustando o algoritmo intrínseco. O limiar é aplicado para determinar a positividade e a co-localização de proteínas. O algoritmo final é então aplicado a todo o conjunto de tecidos. Os dados resultantes permitem ao usuário avaliar a expressão de proteínas com base no tipo de tecido (por exemplo, epitélio vs. estroma) e compartimento subcelular (núcleo vs. citoplasma vs. membrana plasmática). A análise de co-localização permite a investigação de tipos de células duplamente positivas, duplamente negativas e uni-positivas. A combinação de imagens multiespectrais com imuno-histoquímica multiplexada e aquisição automatizada de imagens é um método objetivo e de alto rendimento para investigação de biomarcadores dentro dos tecidos.

Introduction

A imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica de laboratório padrão para a detecção de proteína dentro do tecido, e IHC ainda é largamente utilizado tanto em pesquisa e de diagnóstico da patologia. A avaliação da coloração IHC é frequentemente semi-quantitativa, a introdução de potencial de polarização para interpretação dos resultados. Muitas abordagens semi-quantitativos foram desenvolvidos que incorporam tanto a intensidade da coloração e medida coloração em diagnóstico final ^1-4. Outros sistemas incluem intensidade de pontuação e localização subcelular, a fim de melhor localizar a expressão ^5. Incorporação de pontuações médias de vários esp....

Protocol

NOTA: O protocolo aqui descreve coloração e análise de um tissue microarray (TMA), descrito anteriormente ^12,17,18. A seção TMA espessura 4 mm foi obtida a partir de um bloco de parafina usando um micrótomo padrão.

NOTA: A biblioteca espectral para os 4 cromógenos e contrastante deve ser criado para quantificação de imagem. A fim de fazer isso, o protocolo otimizado para cada anticorpo indivíduo deve ser executado com um anticorpo por slide, menos o counterstain final. Um quinto slide deve ser corado com hematoxilina para gerar as 5 imagens necessárias para criar a biblioteca espectral.

1. Multiplex Imunohistoquímica

1. lâminas Asse....

Results

Na Figura 1, a formação é realizada sobre os tecidos da próstata para segmentar imagens em porções epiteliais e do estroma, juntamente com o compartimento de não-tecido. Ao utilizar o marcador de membrana de E-caderina epitelial, a segmentação de células foi realizada para separar o núcleo, citoplasma, e porções de membrana, apresentados na Figura 2.

Numa experiência, foi utilizado multiplexad.......

Discussion

A utilização de imuno-histoquímica tradicional para avaliar a expressão de proteínas é limitado por métodos subjectivos, semi-quantitativos de análise ^22,23. plataformas de avanço de ter sido criado por análise de alto rendimento de expressão de biomarcadores e localização. segmentação detalhada de ambos os tecidos e compartimentos subcelulares permite aos usuários estudar a expressão de biomarcadores, localização e co-localização com outros marcadores de interesse. Em estudos anteriores, que demonstraram a u.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xileno	Fisher Chemical	X3F1GAL	Classificação NFPA: Saúde – 2, Fogo – 3 , Reatividade – 0
Álcool Etílico-200 à prova Fisher	Scientific	4355223	Classificação NFPA: Saúde – 0, Fogo – 3 , Reatividade – 0
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Classificação NFPA: Saúde – 2, Fogo – 0 , Reatividade – 0
Tris Hidroximetil aminometano HCl	Fisher Scientific	BP153-1	Classificação NFPA: Saúde – 2, Fogo – 0 Reatividade – 0
Tween 20	Chem-Impex	1512	Classificação NFPA: Saúde – 0, Fogo – 1 , Reatividade – 0
Solução salina tamponada com fosfato	Fisher Scientific	BP2944-100	Classificação NFPA: Saúde – 1, Fogo - 0 , Reatividade – 0
Peroxidazed	Biocare Medical	PX968	Evite o contato com a pele e os olhos. Pode causar irritação na pele e danos aos olhos.
Receptor de estrogênio alfa	Thermo Fisher Scientific-Labvision	RM9101	Não classificado como perigoso
Receptor de andrógeno	SCBT	sc-816	Não classificado como perigoso
CD147	Biodesign	P87535M	Não classificado como perigoso
E-caderina	Dako	M3612	Não classificado como perigoso
Renoir Red Andibody Diluent	Biocare Medical	PD904	É especialmente projetado para trabalhar com anticorpos baseados em Tris
de Decamuflagem	Biocare Medical	Modelo DC2002	Tome as precauções normais ao usar uma panela de pressão
Caneta barreira-Immuno Edge	Vector Labs	H-4000
Kit de Desnaturação - Etapa de eluição	Biocare	Medical DNS001H	Não classificado como perigoso
Mach 2 Cabra anti-Coelho HRP Polímero	Biocare Medical	RHRP520	Não classificado como perigoso
Mach 2 Cabra anti-Coelho AP Polímero	Biocare Medical	RALP525	Não classificado como perigoso
Mach 2 Cabra anti-Mouse HRP Polímero	Biocare Medical	M3M530	Não classificado como perigoso
Kit de cromogênio Betazoid DAB	Biocare Medical	BDB2004	1. Sabe-se que o BAD é suspeito de ser cancerígeno. 2. Não exponha os componentes DAB à luz forte ou luz solar direta. 3. Use equipamentos e roupas de proteção individual adequados. 4. O DAB pode causar sensibilização da pele. Evite o contato com a pele e os olhos. 5. Observe todos os ambientes federais, estaduais e locais em relação ao descarte
Warp Red Chromogen Kit	Biocare Medical	WR806	Corrosivo. Ácido que pode causar irritação na pele ou danos aos olhos.
Kit de Cromogênio Verde Vina	Biocare Medical	BRR807	Nocivo se ingerido
Kit de Cromogênio Roxo Bajoriano	Biocare Medical	BJP807	Líquido inflamável. Mantenha longe do calor, chamas e faíscas. Nocivo por ingestão ou absorção. Evite o contato com a pele ou os olhos e evite a inalação.
Hematoxilina para Gatos	Biocare Medical	CATHE	Roxo   solução   com   a   leve   acético   ácido   (vinagre)   perfume.   Maio   be   irritante   para   pele   ou   olho.   Evite   Contato   com   pele   e   olho.   Evite   ingestão.
Mídia de Montagem XYL	Richard Allen	8312-4	Classificação NFPA: Saúde – 2, Fogo – 3 , Reatividade –
0 1.5 Lamínulas	Marca Fisher	22266858	Bordas afiadas
Incubação (Umidade)Câmara	obsoleta	obsoleto	Vários fornecedores disponíveis
Forno de Convecção	Estável- Therm	C-4008-Q
Fundo Reagente de Bloqueio Punisher	Biocare Medical	BP974	Este produto não é classificado como perigoso.
Software inForm	PerkinElmer	CLS135781	Software de imagem multiespectral primário usado no manuscrito
Software Nuance	PerkinElmer	Nuance EX	Software usado para fazer bibliotecas espectrais dentro do manuscrito
Microscópio Vectra e scanner de lâminas	PerkinElmer	VECTRA	Scanner de lâminas automatizado e microscópio para obtenção de cubos de imagem IM3