Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53839
Automatic Translation
1, 1
1Viral and Rickettsial Diseases Department, Naval Medical Research Center

Abstract

Coxiella burnetii, Q ateşi etkenidir, zorunlu hücre içi bakteridir. PCR bazlı teşhis deneyleri C saptanması için geliştirilmiştir Hücre kültürleri ve klinik örneklerde burnetii'nin DNA. PCR özel ekipman ve kapsamlı son kullanıcı eğitimi gerektirir ve bu nedenle, özellikle kaynak kısıtlı bir alanda rutin işleri için uygun değildir. Bunun C varlığını tespit etmek için bir döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) deneyi geliştirdik hasta numunelerinde burnetti. Bu yöntem, bir su banyosu ya da ısıtma bloğu 60 ° C civarında tek bir sıcaklıkta gerçekleştirilir. Bu lamba tahlilin duyarlılığı reaksiyon başına yaklaşık 25 kopya, algılama sınırı ile PCR için çok benzer. Bu rapor, liyofilize reaktifler ve hydroxynaphthol mavisi (HNB) veya reaksiyon floresan interkalasyon boya ile UV lambası kullanılarak sonuçlar görselleştirmelerine reaksiyon hazırlanmasını tarif etmektedir. LAMP reaktifler lyophili edildized ve algılama hassasiyeti kaybı olmadan bir ay süreyle oda sıcaklığında (RT) saklandı. Reaksiyon karışımı hazırlama karmaşık adımlar içermez, çünkü bu lamba deneyi özellikle sağlamdır. Bu yöntem, Q humması endemik kaynak sınırlı ortamlarda kullanım için idealdir.

Introduction

Küçük Gram-negatif bakteri Coxiella burnetii dünya çapında bir zoonoz olan Q humması etkeni olduğunu. Nedeniyle Q Ateşi dünya çapında dağıtım ve C yüksek bulaşıcılıklarına burnetii, denizaşırı dağıtılan ABD askeri ve sivil personel endemik bölgelerde enfekte olma riski vardır.

akut ve kronik enfeksiyonların: Q humması iki şekilde tezahür eder. Akut Q-humması grip benzeri semptomlar, hepatit, pnömoni veya ile kendini göstermektedir ve genellikle düşük mortalite oranı kendini sınırlayan bir hastalıktır. Kronik Q-humması, daha az yaygın olmakla birlikte, genellikle 1,2 tedavi edilmediği takdirde çok daha yüksek bir ölüm oranına sahip endokardit ile sonuçlanır. Bu nedenle erken tanı uygun bir tedavi hasta bakımı için önemlidir rehberlik. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) analizleri C saptanması için geliştirilmiştir hücre kültürleri ve klinik örneklerde 3-5 <de burnetii DNA/ Sup>. PCR ve qPCR Hem masraflı ve rutin işleri için kaynak kısıtlı alanlarda genellikle hazır değildir.

Başlangıçta Notomi 6 tarafından açıklanan döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) alternatif bir DNA çoğaltma yöntemi sunuyor. LAMBA hedef genin en az altı bağımsız bölgeleri tanıyan özel olarak tasarlanmış primer kümeleri ile birlikte sarmal yer değiştirme DNA sentezi için Bst DNA polimerazı kullanır. LAMP en önemli avantajı, amplifikasyon izotermal şartlar altında gerçekleşmesidir. Bu nedenle, yalnızca su banyosu ısıtma bloğu ya da bir inkübatör gereklidir. Bu yöntem, birkaç riketsiyal patojenleri 7-9 algılamak için kullanılır olmuştur. jel elektroforezi ile yükseltilmiş DNA ürünleri Görselleştirme nedeniyle nonspesifik amplifikasyon yanlış pozitif gelen gerçek pozitifler ayırt edebilirsiniz en doğru yöntemdir. Ancak jel elektroforezinde ilgili prosedürler kaynakları sınırlı ar için pratik değildirEAS. Birkaç alternatif yöntemler tepkime ürünlerini tespit etmek için geliştirilmiştir. Magnezyum pirofosfat oluşumu 10 veya floresan interkalasyon boya kullanılarak elde edilen bulanıklık UV ışığı 11,12 altında görüntülendi edilecek gibi bu alternatif, bir jel çalışan daha elverişli. Q humması endemik 13 olduğu tropikal ve alt tropikal ülkelerde ortam sıcaklığı olan 25 ° C ve 37 ° C'de saklandığında LAMP reaktifleri bir ay boyunca stabil idi.

Bir lamba deneyi C varlığını tespit etmek için laboratuvarda geliştirilmiştir Plazma örneklerinde 14 burnetti. Burada liyofilize reaktifler lamba Reaksiyon karışımının hazırlanması için bir protokol açıklamaktadır. Oda sıcaklığında muhafaza edildiğinde liyofilize reaktif bir ay boyunca stabildir. Kolay bir görselleştirme yöntemi ile kombine edildiğinde, bu C tespit için kullanılacak ideal bir yöntemdir Bir kaynak sınırlı bir ortamda burnetti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. LAMBA Reaksiyon Standardı olarak plazmid DNA dilüsyonları hazırlayın

  1. DNA konsantrasyonu plazma (C burnetii RSA 493 ihtiva eden hedef gen IS1111a) belirlenmesi için, 260 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçmek için bir spektrofotometre kullanarak. 1 OD 260 DNA 50 ug / ul eşittir.
  2. kopya sayısında plazmit DNA miktarını dönüştürün. Plazmid büyüklüğü 6330 bp olduğu için, bu plazmid moleküler ağırlığı 4.1 x 10 6 g (6.330 bp'lik bir X 649 g / BP) 'dir. (Adım 1.1 belirlenir) plazmidinin DNA konsantrasyonu 34.2 ng / ml. Bu DNA, örnek 1 ul DNA, 5 x 10 9 kopya (34.2 x 10 -9 g / 4.1 x 10 6 gx 6.02 x 10 23) denk, plasmid DNA 34.2 ng içerir.
  3. 5 x 10 8 kopya DNA örneği yapmak için bir 10-kat seyreltme için su 90 ul plasmid DNA (5 x 10 9 kopya / ml) 10 ul ekle / ml.
  4. Tekrar adım 1.3, 5 x 10 7 DNA numuneleri hazırlamak için 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1 ve 5 x 10 0 kopya / ul.

2. LAMBA Reaksiyon için Örneklerden DNA şablonu hazırlayın

  1. imalatçının protokolüne göre, ticari bir DNA mini kiti kullanılarak insan plazma örneklerinden DNA izolasyonu. çıkarılması için 200 ul örnek bir toplam kullanım ve 20 ul hacim içinde ekstre DNA Zehir.

3. 2x LAMP reaksiyonu tamponu hazırlayın

  1. 10x Pol tampon 200 ul, 5 M Trimethylglycine 320 ul, E MgSO 4, dNTP karışımı 280 ul (10 mm) ve suyun 188 ul 2x LAMBASI 1 ml tampon olmak için 1 12 ul karıştırın. 10 saniye boyunca darbe vorteks ile karıştırın.

4. Standart LAMBA Reaksiyonu gerçekleştirin

  1. 2x LA 12.5 ul karıştırınAşama 3'te hazırlanan MP tamponu (40 mM Tris-HCI (pH 8.8), 20 mM KCI, 16 mM MgSO 4, 20 mM (NH4) 2 SO4,% 0.2 Triton X-100, 1.6 M Trimethylglycine, 1.4 mM dNTP karışımı), primer karışımının 1.2 ul, Bst DNA polimerazı (8 U / ul) 1 ul ve 0.2 ml PCR tüpü içinde, reaksiyon karışımı (20 ul) yapmak için su 5.3 ul.
  2. 20 ul reaksiyon karışımına 5 (aşama 1 ya da 2) DNA ul ekleyin ve iyice karıştırın.
  3. Yakın boru ve bir su banyosu ya da ısıtma bloğu içinde 60 dakika süre ile, 60 ° C'de inkübe edin. Bu önceden belirlenmiş optimal reaksiyon sıcaklığıdır.
  4. Tepkimeyi sonlandırmak için 10x, jel yükleme tampon maddesi 5 ul ekle.
  5. nükleik asit, leke interkalasyon ile boyanmış% 2 agaroz jeli reaksiyon ürünlerin yük 5 ul.
  6. 1x TBE tamponu içinde 35 dakika boyunca 100 V'ta jel üzerinde çalıştırıldı.
  7. UV ışığı ile sonuçları görselleştirmek.

5. sulandırılmış ile LAMBA Reaksiyonu gerçekleştirinReaktifler

  1. 10x Pol Tamponu 125 ul 5 M Trimethylglycine 200 ul, 1 M MgSO 4 7.5 ul karıştırın, su 667.5 ul sulandırma tamponu 1 ml yapmak için. 10 saniye boyunca darbe vorteks ile karıştırın.
  2. mühürlü alüminyum folyo çanta liyofilize reaktif ihtiva tüpleri çıkarın. alüminyum folyo çanta mühürlü değilse tüpleri kullanmayın veya hasarlı olup olmadığını.
  3. Liyofilize reaktifler yeniden askıya almak için her bir tüp halinde yeniden tamponu 20 ul ekle.
  4. Tampon yukarı ve aşağı 5 kez pipetleme karıştırın. Liyofilize reaktifler tamamen yeniden askıya alınır emin olmak için bir göz atın. beyaz toz tüp içinde kaybolur.
  5. yeniden reaktifler (aşama 1 ya da 2) DNA şablonu 5 ul ilave edin ve iyice karıştırın.
  6. Yakın boru ve bir su banyosu ya da ısıtma bloğu içinde 60 dakika süre ile, 60 ° C'de inkübe edin.
  7. Tepkimeyi sonlandırmak için 10x, jel yükleme tampon maddesi 5 ul ekle.
  8. Yük reaksiyon 5 ulnükleik asit, leke interkalasyon ile boyanmış% 2 agaroz jel ürünleri.
  9. 1x TBE tamponu içinde 35 dakika boyunca 100 V'ta jel üzerinde çalıştırıldı.
  10. UV ışığı ile sonuçları görselleştirmek.

6. Sulandırma Tampon HNB veya Floresan araya eklenen boyanın İçeren ile LAMBA Reaksiyonu gerçekleştirin

  1. 10x Pol Tamponu 125 ul 5 M Trimethylglycine 200 ul, 1 M, 7.5 ul MgSO 4, 20 mM HNB (ya da 100X flüoresan araya eklenen boyanın 12.5 ul) ve 660 ul (veya 655 ul) su için 7.5 ul karıştırın sulandırma tamponu 1 ml yapmak. 10 saniye boyunca darbe vorteks ile karıştırın.
  2. 5.6 - adımlarını 5.2 tekrarlamak için 6. bölümde hazırlanan sulandırılmış tampon kullanın.
  3. çıplak gözle sonuçları (HNB içeren reaksiyon) ya da bir UV ışığı (floresan interkalasyon boya içeren reaksiyon) gözünüzde canlandırın.

7. Tüp Tarayıcı ile gerçek zamanlı LAMBASI Reaksiyonu gerçekleştirin

  1. reconstitut DNA ul 5 ekleyinfloresan interkalasyon boya, yakın tüp içeren ve tüp tarayıcıya yerleştirin ed reaktifleri.
  2. 60 ° C'ye ayarlanmış inkübasyon sıcaklığı. 60 dakika boyunca 520 nm de floresan ölçülür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

0.2 ml tüp içinde liyofilize LAMP reaktifler Bst DNA polimeraz, astar ve dNTP içerir. Sulandırma tamponu 20 ul yeniden askıya liyofilize reaktifler kullanılır. 1 taze hazırlanmış reaktifler ve liyofilize reaktiflerle agaroz jelleri üzerinde LAMP reaksiyonu sonucu göstermektedir. Liyofilize reaktif aktivitesini azaltmaz. DNA şablonu. Şekil 2'nin 25 kopya tespit her iki reaktiflerle hazırlanan LAMP reaksiyonları HNB veya reaksiyon içinde mevcut fluoresan interkalasyon boya ile reaksiyon ürünlerinin belirlenmesini göstermektedir. Reaksiyona HNB katılma reaksiyonları için, bu DNA şablonu 25, 50 ve 100 kopya mavi, mor bir görsel renk değişimi üretir. Reaksiyonun floresan araya eklenen boyanın dahil, DNA şablonları, 25, 50 ve 100 kopya mevcut UV ışığı ile, güçlü bir floresan sinyali gösterir. Bir tüp tarayıcı kullanıldıGerçek zamanlı saptama için bu çalışmada. Bu makine. Aynı anda 8 reaksiyonları gerçekleştirmek floresan interkalasyon boya varlığı ile gerçek zamanlı olarak floresan sinyalleri izlemek için tüp tarayıcı kullanarak 3 gösterileri Şekil edebilirsiniz. Floresan sinyalleri 14, 18, ​​21 sonra taban üzerindedir ve 10 6 23 dak, 10 4, 10 3 ve reaksiyonlarda DNA şablonu, 100 kopya.

Şekil 1
Yeni hazırlanmış reaktiflerle (A) ve beyaz bir katı Reagents (B) agaroz jeli üzerinde Şekil 1. lamba Sonuçlar. Reaksiyon karışımları 60 dakika için 60 ° C'de inkübe edilmiştir. (A) Şerit 1, 100 bp'lik bir basamağı ifade; Şerit 2-3, 4-7 ve 8 - - 5, 6 9, 2.5 x 10 3 reaksiyonlarıdır 2.5 x 10 x 10 2, 2.5 ve plazmid DNA yok kopya. 11, 12 - - (B) Şerit 10 13, 14 - 15 ve 16-17 rea vardır2.5 x 10 3 seksiyonlar, 2.5 x 10 2 x 10 2.5, ve plazmid DNA 0 kopya. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. Yöntemleri LAMP Ürünleri Algılama için. HNB (A) veya floresan interkalasyon boya (B) lamba ürünleri tespit etmek için kullanılmıştır. Reaksiyonlar, 60 dakika boyunca 60 ° C 'de gerçekleştirildi. 5 Lane 1, reaksiyonlar 0, 10, plazmid 25, 50 ve 100 kopya. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Armatür Ürün güçlü> gerçek zamanlı saptama. Reaksiyonlar, 60 dakika boyunca 60 ° C 'de gerçekleştirildi. 10 6 (siyah), 10 4 (kırmızı), 10 3 (yeşil), 100 (sarı), 10 (mavi), 1 (turuncu) ve 0 (kahverengi ve açık kahverengi) plazmid kopyaları ile Reaksiyonları. Üç tespitler bağımsız gerçekleştirildi. Bunlar son derece tekrarlanabilir idi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Daha önce, ekleme elemanı IS1111a 14 hedefleyen duyarlı ve özgül LAMBA testi geliştirdi. Derece C arasında, farklı türleri arasında korunduğu için IS1111 elemanı seçilmiştir burnetti ve bakteri kopya yüksek numarası (110 7) (Klee 2006). Bizim sonuçlarımız LAMP Coxiella DNA gibi kısa bir sürede kromozomal kopyasını ilişkili olabilir IS1111 elemanı, yaklaşık 25 kopya tespit edebilen gösterdi. Bu çalışmada, Bst DNA polimerazı, lamba primerleri ve dNTP liyofilize edildi ve sıkıştırılmış alüminyum folyo torba içinde paketlenir. Bu liyofilize reaktiflerin duyarlılığı 25 kopya kalır; en az bir ay süreyle taze hazırlanmış maddelerine benzer oda sıcaklığında saklanabilir. Alüminyum folyo çanta düzgün açmadan önce mühürlü olduğundan emin olmak için çok önemlidir. alüminyum folyo çanta mühürlü değilse tüpleri kullanmayın veya hasarlı olup olmadığını. Bu yeniden hidrasyon o yol açabilirreaktivite kaybına neden olur liyofilize reaktifler f. diğer kritik adım sulandırma tamponu ile liyofilize reaktiflerin yeniden askıya alınmasıdır. LAMP reaksiyonu tamamen yeniden askıya olmayan reaktif ile düzgün çalışmaz. Çünkü reaksiyon tamponu ve Trimethylglycine çözeltinin viskozitesinin yüksek, yüksek tuz konsantrasyonu, başarılı Bst DNA polimerazı, lamba primerler ve dNTP'ler ile liyofilize edilemez. Özel bir adım bu bileşenleri ile sulandırma tamponu hazırlamak için gereklidir. Potansiyel LAMP reaksiyonu düşük ya da hiç Trimethylglycine ile düşük tuz konsantrasyonlarında test edilebilir. Aynı algılama hassasiyeti ancak düşük tuz ve düşük Trimethylglycine konsantrasyonu ile olan bir reaksiyon koşulu ise, liyofilize reaktif yalnızca su ile yeniden gerekmektedir. Bu da reaksiyon adımlarını basitleştirecek.

Son zamanlarda, Wang ve ark. 15 on iki karşılaştırıldığındaticarileştirildi izotermal Master Mix kiti ile haus LAMP analizleri ve in-house deneyleri yalancı pozitif sonuçlar bulundu. Laboratuvarımızda, biz farklı bakterilerin saptanması için çeşitli LAMBA deneyleri geliştirdik ve bu in-house tahlillerinde yanlış pozitif sonuçlar bulmadım. Ayrıca, lamba yönteminin geliştirilmesi başlangıç ​​aşamalarında, tahliller hem in-house hazırlanan master mix ve ticari ana karışımı ile test edildi ve fark Tahliller 'duyarlılığı ve özgüllüğü gözlendi.

Bizim çalışmamızda da laboratuvar çapraz bulaşma olasılığını azaltmak için reaksiyon tüpleri açmadan LAMP ürünlerini algılamak değil, aynı zamanda sonuçları jel elektroforezi yöntemi karşılaştırmak okumak için daha kısa bir süreç vakit geçirebilirsiniz sadece birkaç yöntem sunar. Bu algılama yöntemleri kullanmanın avantajı büyük ölçüde hızla tahlil yapmak ve C olan bireysel bir teşhis yeteneğimizi artıracak burnetti

60 ° C civarında sabit bir sıcaklıkta muhafaza PCR bazlı bir PCR gerekli yöntem bir ısıtma bloğu, bir su banyosu ya da kuluçka aksine tüm lamba deneyi için yeterlidir. Bu kaynak sınırlı bir ortamda deney özellikle uygun hale getirir. Orijinal lamba tahlilinde, Bst DNA polimerazı, lamba primerler ve dNTP farklı -20 ° C'de muhafaza edilmesi gerekir. Bu liyofilize reaktifler daha da yararlı bir Q humması endemik olan bir kaynak sınırlı ayar yapar oda sıcaklığında saklanabilir. 4 ° C, 25 ° C ve 37 ° C 'de liyofilize reaktiflerin uzun vadeli stabilite çalışması halen devam etmektedir. Gelecekte, bu lamba tahlil C algılayabilir liyofilize reaktifler kullanılarak göstermek istiyorum benzer hassasiyetle burnettiPCR uzak bir ortamda.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu araştırma Deniz Araştırma Merkezi, araştırma iş birimi 6000.RAD1.J.A0310 tarafından desteklenmiştir. Bu makalede ifade edilen görüşler yazarlara aittir ve ille de Deniz Kuvvetleri, Savunma Bakanlığı, ya da ABD Hükümeti Bölümü resmi politikasını ya da yansıtmaz. Wei-Mei Ching ABD Hükümetinin bir çalışanıdır. Bu eser onun resmi görevlerinin bir parçası olarak hazırlanmıştır. Başlık 17 USC §105 'bu başlık altında Telif hakkı koruması Birleşik Devletler Hükümeti'nin herhangi bir iş için mevcut değildir.' Öngörmektedir Başlık 17 USC §101 o kişinin resmi görevlerinin bir parçası olarak askerlik üyesi veya ABD Hükümeti çalışanı tarafından hazırlanan bir eser olarak bir ABD Hükümeti işi tanımlar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LAMP primers Eurofins MWG operon 10 nmol, salt free Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase New England Biolabs M0275L 8 units/ml
10x Thermo pol buffer New England Biolabs B9004S
dNTP mixture New England Biolabs N0447L 10 mM each
Betaine Sigma-Aldrich B0300 5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M3409-1ML 1 M
10x Bluejuice Invitrogen 10816-015 gel loading buffer
SYBR green Invitrogen S7585 10,000x, visualize products in tubes
GelRed Phenix Research Products RGB-4103 10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents Gene Reach
Hydroxynaphthol blue Fluka 33936-10G
ESEQuant tube scanner Qiagen real-time detection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
  2. Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
  3. Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
  4. Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
  5. Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
  6. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
  7. Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
  8. Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
  9. Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
  10. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
  11. Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
  12. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
  13. Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
  14. Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
  15. Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).

Tags

Enfeksiyon Sayı 110 Liyofilizasyon LAMP İzotermal, Q ateşi DNA saptama
tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H. W., Ching, W. M. The… More

Chen, H. W., Ching, W. M. The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii. J. Vis. Exp. (110), e53839, doi:10.3791/53839 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter