Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Resumo

Descrevemos um protocolo para amplificar locais de integração retroviral a partir do DNA genômico de células infectadas, sequenciando as junções amplificadas vírus-hospedeiro e, em seguida, mapeando essas sequências para um genoma de referência. Também descrevemos técnicas para quantificar a distribuição de locais de integração em relação a várias anotações genômicas usando BEDTools.

Resumo

preferências de integração assinatura retrovírus exposição em ambos as escalas local e global. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para (1) geração de diversas bibliotecas de sites de integração retrovirais utilizando PCR amplificação mediada por ligação (LM-PCR) e sequenciamento de próxima geração (NGS), (2) o mapeamento da localização genômico de cada a vírus acolher junção usando BEDTools, e (3) para analisar os dados de relevância estatística. O ADN genómico extraído a partir de células infectadas está fragmentado por digestão com enzimas de restrição ou por sonicação. Depois de DNA final de reparação adequado, os ligantes de cadeia dupla são ligadas para as extremidades do DNA, e PCR com iniciadores semi-internos é conduzida usando iniciadores complementares para tanto a extremidade mais longa repetição terminal (LTR) do vírus e o ADN ligante ligado. Os iniciadores de PCR transportar sequências necessárias para o agrupamento de ADN durante NGS, eliminando a exigência de ligação adaptador separado. Controlo de Qualidade (QC) é conduzido para avaliar a distribuição de tamanho de fragmento de ADN e adaptarer incorporação de ADN antes de NGS. arquivos de saída de seqüência são filtrados para LTR contendo lê, e as sequências que definem o LTR e o ligante são cortadas de distância. sequências celulares hospedeiras aparadas são mapeados para um genoma de referência usando BLAT e são filtrados para 97% de identidade minimamente para um ponto único no genoma de referência. locais de integração únicas são examinados para nucleotídeo adjacente (nt) sequência e distribuição relativa a várias características genômicas. Usando este protocolo, as bibliotecas local de integração de alta complexidade pode ser construído a partir de ADN genómico em três dias. Todo o protocolo que engloba infecção virai exógeno de células de cultura de tecidos sensíveis à análise do local de integração pode, portanto, ser realizada em cerca de uma a duas semanas. Recentes aplicações desta tecnologia referem-se a análise longitudinal de locais de integração a partir de pacientes infectados com HIV.

Introdução

A integração de ADN virai (vDNA) no genoma da célula hospedeira é um passo essencial no ciclo de vida retroviral. A integração é conseguida pela integrase viral enzima (NOS), que realiza dois processos catalíticos distintos que levam à criação do provírus inserida estavelmente ^um. EM subunidades envolver as extremidades do vDNA linear que é gerada por meio de transcrição reversa, formando o intasome de ordem superior com vDNA extremidades unidas por um multímero ^4/2 NO. EM cliva 'extremidades do vDNA jusante da invariantes 5'-CA-3' a 3 em sequências de um processo conhecido como 3'-processamento, deixando um recesso 3 'termina com grupos hidroxilo reactivos em cada terminal vDNA ^5-8. O intasome subsequentemente é importado para o núcleo como parte de uma grande assembléia de acolhimento e proteínas virais conhecido como o complexo de pré-integração (PIC) ^9-11. Depois de encontrar alvo celular DNA (DNAt), IN utiliza a vDNA 3'-hidroxil groups para clivar o topo DNAt e fios de fundo de forma escalonada e, simultaneamente, se junta ao vDNA para grupos fosfato DNAt 5 'através do processo de transferência de cadeia ^12,13.

preferências do site integração exposição retrovírus nas escalas local e global. Localmente, locais de integração de consenso consistem em sequências DNAt palindr�icas fracamente conservados que vão desde cerca de 5-10 pb a montante ea jusante dos locais de inserção vDNA ^14,15. Globalmente, os retrovírus alvo anotações de cromatina específicos ^16. Há sete géneros retroviral diferente - alpha através de epsilon, lenti e SPUMA. Os lentivírus, que incluem HIV-1, favorecer a integração dentro dos corpos dos genes ativamente transcritas ^17, enquanto os gammaretroviruses integrar preferencialmente em locais de transcrição de início (TSSS) e regiões potenciador ativos ^18-20. Em nítido contraste, Spumavirus é fortemente inclinado para heterochromregiões ATIC, como domínios associados a lâmina de genes dos pobres ^21. Preferências de base DNAt locais são em grande parte ditada pelas redes específicas de contatos nucleoproteína entre IN e DNAt ^13,22,23. Para os lentivírus e gammaretroviruses, a integração em relação ao anotações genômicas é em grande parte regido por interações entre IN e fatores celulares cognatos ^24-27. Alterando as especificidades da rede de interação IN-DNAt ^13,22,23,28 e perturbando ou re-engenharia IN-hospedeiro interações fator ^25-27,29-32 são estratégias comprovadas para redirecionar integração nos níveis locais e globais, respectivamente.

O poder dos procedimentos de seqüenciamento de DNA usados ​​para catalogar locais de integração retrovirais aumentou imensamente nas últimas décadas. Locais de integração foram recuperados no trabalho pioneiro utilizando purificação trabalhoso e técnicas de clonagem manuais para produzir apenas um punhado de sites únicos por ^33,34 estudo.A combinação de amplificação por LM-PCR de junções de ADN LTR-hospedeiro com a capacidade para mapear locais de integração individuais de genomas projectos de rato humanos e transformadas no domínio, com o número de sítios recuperados a partir de infecções de células de cultura de tecidos exógeno aumentando a várias centenas a milhares ^{17 , 18.} A combinação mais recente LM-PCR com a metodologia NGS enviou disparada profundidade biblioteca. Especificamente, proporcionou pyrosequencing da ordem de dezenas de milhares de locais de integração única ^30,35-38, enquanto bibliotecas sequenciado através da utilização do agrupamento de ADN pode produzir milhões de sequências únicas ^19-21,39. Aqui nós descrevemos um protocolo LM-PCR otimizado para amplificar e sequenciar locais de integração retrovirais utilizando NGS DNA de agrupamento. O método incorpora necessária sequências adaptadoras para os iniciadores de PCR e, portanto, directamente para as moléculas de ADN amplificados, impedindo assim a necessidade de um passo adicional do adaptador de ligação antes da sequenciamento ^40. O gasoduto análise bioinformática, a partir da análise de dados de sequenciamento brutos para junções de ADN LTR-host para o mapeamento dos locais de integração únicas para pertinentes características genômicas, também é geralmente descrita. De acordo com a precedência estabelecida a partir de protocolos metodológicos anteriores neste campo ^36,38,41-43, scripts personalizados podem ser desenvolvidos para auxiliar a conclusão de etapas específicas no pipeline de bioinformática. A utilidade e a sensibilidade do protocolo é ilustrado com dados representativos amplificando, sequenciação e mapeamento de HIV-1 os locais de integração a partir de células de cultura de tecidos infectadas na multiplicidade de infecção aproximada (MOI) de 1,0, bem como uma série de titulação de este DNA diluiu-se através do DNA celular infectada em 5 vezes etapas para uma diluição máxima de 1: 15.625 para se obter o equivalente MOI aproximada de 6,4 x 10 ^-5.

Protocolo

1. Gerar stocks de vírus

Nota: Um diagrama de fluxo do aspecto banco molhado deste protocolo está representado na Figura 1 Os detalhes da produção de estoque viral e infecção subsequente de células de cultura de tecido geralmente se aplicam a diferentes tipos de retrovírus.. Para algumas experiências, a célula alvo pode não expressam o receptor virai endógeno (s), e em tais casos, a construção de partículas retrovirais pseudotipados albergando heterólogo glicoproteína do envelope viral, por exemplo, da glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV-G), será necessária para a infecção ^44,45.

Nota: Devem ser tomadas precauções quando se trabalha com HIV-1. Embora orientações específicas vão variar de instituição para instituição, todo o trabalho à base de vírus deve ser realizada em um, operador restrito gabinete de segurança biológica dedicado (normalmente referido como uma capa de cultura de tecido). equipamentos de proteção individuaisque inclui proteção para o rosto, tampas da sapata, uma camada de luvas duplo, e um terno macacão de corpo inteiro deve ser usado em todos os momentos. Todos os resíduos líquidos resultantes de experiências relacionadas com o vírus deve ser inactivada com água sanitária (concentração final de 10%), e todos os resíduos, incluindo os sólidos devem ser autoclavados antes do descarte.

1. Um dia antes da transfecção, placa de 3,3 x 10 ⁶ células HEK293T em 10 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml de caldo), em cada uma das cinco placas de 100 mm.
   Nota: suplemento de DMEM é referido como DMEM-FPS a partir deste ponto.
2. No dia subsequente, transfectar as células com 10 ng de plasmídeo portador de clones moleculares retrovirais de comprimento total ou 9 ug de vectores circulares único excluído-envelope com 1 ug de uma construção de expressão de VSV-G, utilizando reagentes de transfecção disponíveis comercialmente ou fosfato de cálcio.
   1. Incubar a cells a 37 ° C numa incubadora de cultura de células humidificada com 5% de CO ₂ (esta condição daqui em diante referido como "incubador de cultura de tecido"). Após aproximadamente 48 horas, recolher o meio celular contendo vírus, utilizando uma pipeta volumétrica e passá-la através de um filtro de 0,45 um fluxo por gravidade.
   2. Concentra-se o vírus por ultracentrifugação a 200000 xg durante 1 h a 4 ° C. Ressuspender o sedimento de vírus em 500 ul de DMEM-FPS contendo 20 U de ADNase, e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
      Nota: O passo de ADNase ajuda a reduzir a recuperação de sequências de plasmídeo indesejados, eliminando o peso de DNA de plasmídeo que persiste a partir do procedimento de transfecção.
3. Determinar a concentração de p24 ⁴⁶ utilizando um kit de captura de antigénio de p24 do VIH-1 de acordo com as instruções do fabricante.
   Nota: A concentração do vírus também pode ser determinada por ensaio da actividade de transcriptase reversa ^47,48. Alternativamente, o nível de vírus funcional podeser determinada pela medição MOI. Isto é mais facilmente realizado utilizando células activadas por fluorescência com vírus que expressam genes repórteres fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde melhorada. determinação MOI pode ser particularmente útil quando se trabalha com células primárias que não podem suportar o mesmo nível de infecção como linhas celulares optimizadas.

2. Células infectar com o vírus

1. Placa de 3,0 x 10 ⁵ células HEK293T por poço numa placa de 6 poços em 2,5 ml de DMEM-FPS e incubar durante a noite numa incubadora de cultura de tecidos.
   Nota: o número de sítios de integração únicas recuperados com este protocolo é directamente proporcional ao número de células e a quantidade de vírus activos utilizados na infecção.
2. Infectar as células com uma concentração de p24 virai final de 500 ng / ml num volume final de 500 ul fresco de DMEM-FPS durante 2 h numa incubadora de cultura de tecidos, em seguida, adiciona-se 2 ml de DMEM-FPS pré-aquecido a 37 ° C por poço e continuar a incubação.
3. em48 horas após a infecção, remova a mídia e lavar as células com 2 ml de solução salina fosfato tamponada (PBS). Adicione 0,5 ml de tripsina-EDTA pré-aquecido a 37 ° C, e depois de alguns segundos inspeccione visualmente os poços para desalojamento célula.
4. Adicionar 2 ml de pré-aquecido DMEM-FPS e voltar a suspender as células mediante gentil up / down pipetagem com uma pipeta volumétrica ~ 10 vezes. Transferir a solução para um balão de cultura de 75 centímetros de tecidos contendo ² 18 ml pré-aquecido DMEM-FPS, e incubar as células numa incubadora de cultura de tecidos.
5. Após minimamente cinco dias a partir do início da infecção, recolher as células, removendo os meios de comunicação, lava-se com 5 ml de PBS, adicionar 2 ml pré-aquecido tripsina-EDTA, e ressuspender com 5 ml pré-aquecido DMEM-FPS por pipetagem. Centrifugar a solução durante 5 min à temperatura ambiente a 2500 xg, e desprezar o sobrenadante.
   Nota: Embora a integração sob estas condições planaltos em cerca de 48 horas após a infecção ^49,50, o adicional de 3 dias de cultura são obrigados a sufficientlY diluir a concentração de moléculas de DNA não integrados que resultam da recombinação de ADN baseado em células ou autointegration mediada por vírus.
6. Extracto de ADN genómico a partir do sedimento celular utilizando um kit disponível comercialmente (por exemplo, ver ^51). Elui-se o ADN a partir da coluna de permuta iónica fornecido com 200 ul de Tris-HCl a 10, pH 8,5.
   Nota: uma alíquota de células deve ser repartida em 48 horas pós-infecção (Passo 2.3) para um ensaio de infecciosidade para assegurar a infecção pelo vírus adequado antes de NGS.

3. ADN fragmento genómico por sonicação ou por Enzima de Restrição Digest

Nota: fragmentos sonicação DNA genômico de uma forma independente de sequência virtualmente e é, portanto, o preferido de fragmentação no seqüenciamento amostras com uma baixa taxa esperada recuperação (por exemplo, células de pacientes infectados ou infecções iniciadas a relativamente baixa MOI). Por outro lado, ultra-sons permite distinguir duplicados de PCR de um partisequência do sítio de integração cular de integrações únicas no mesmo local, o que é crítico para distinguir a expansão clonal de células contendo pró-vírus em pacientes infectados (ver Passo 11 abaixo) ^39,52-54.
Nota: O ADN deve ser clivada imediatamente a jusante da LTR a montante para diminuir a amplificação de sequências virais internas durante LM-PCR. A enzima de restrição BglII que está 43 pb a jusante da sequência U5 a montante e que é incompatível para subsequente ligação com ADN MseI-gerado termina funciona bem com muitas estirpes de HIV-1 (Figura 1B). Quando se prepara DNA por sonicação, a enzima de restrição de clivagem interna deve ser aplicado após a ligação ligante (ver Figura 1C - E e Passo 4.3 abaixo).

1. Por ultra-sons, mistura de 10 ug de ADN genómico em água isenta de nuclease para um volume final de 120 ul. Sonicate usando parâmetros para um tamanho médio de ruptura de 500 pb (duas rodadas de o seguinte parágrafometros: Ciclo de funcionamento: 5%; Intensidade: 3; ciclos por explosão: 200; tempo: 80 segundos).
2. Purifica-se o DNA sonicado utilizando um kit de purificação de PCR. Reparar as extremidades do DNA utilizando um estojo de fim-de reparação do ADN e purifica-se o ADN utilizando um kit de purificação de PCR. A-cauda ao ADN de Klenow utilizando exo ^- enzima e purificar o ADN de cauda-A utilizando um kit de purificação de PCR. Consulte ^51,52 para obter detalhes adicionais de uso de kit.
3. Para a digestão com endonucleases de restrição, corte de 10 ug de ADN genómico durante a noite a 37 ° C num volume de 100 ul com tampão fornecido pelo fabricante e um cocktail de enzimas (100 L cada) que geram saliências 5'-AT, bem como um enzima incompatíveis tais como BglII que cliva a jusante do LTR viral a montante. Purifica-se o ADN no dia seguinte utilizando um kit de purificação de PCR.
   Nota: Nenhum dos enzimas de restrição deve cortar dentro do terminal de ~ 30 pb da extremidade do ADN viral que é amplificado pelo protocolo LM-PCR. Este protocolo amplifica especificamente o U5final do HIV-1 DNA.

4. Hibridar Linker oligonucleotídeos e ligarão a fragmentada DNA genômico

Nota: Preparar um ligante assimétrica contendo uma saliência que é compatível com os fragmentos de ADN acima (ver Tabela 1 para as sequências dos oligonucleótidos utilizados neste protocolo). O ligante a ser utilizado com o DNA sonicado deve conter uma saliência compatível T-3 ', enquanto que o ligante de ADN digerido MseI-deve conter uma saliência compatível 5'-AT (Figura 1). O filamento de ligação curto deve conter adicionalmente uma modificação química não-extensível, tal como 3'-amina, para limitar as reacções de amplificação subsequentes para com o ADN de interesse.
Nota: Quando a preparação de várias bibliotecas sítio de integração diferentes em paralelo e / ou quando as amostras originais de multiplexagem no mesmo sequenciação de execução, é recomendável usar ligadores únicos para cada amostra a limitar o potencial para a amostra cruzada contaminção durante a PCR. Isto implica adicionalmente o uso de iniciadores ligantes únicos para cada amostra durante a PCR com iniciadores semi-internos (descrito abaixo). Fios ligantes originais e iniciadores ligador pode ser concebido por embaralhamento as sequências de oligonucleótidos ligantes listados na Tabela 1, mantendo a teor de% GC global semelhante e posições saliência aplicáveis.

1. Emparelhar as cadeias curtas e longas ligantes em 35 ul de Tris-HCl a 10, pH 8,0-0,1 mM de EDTA (concentração final de 10 jiM de cada oligonucleótido) por aquecimento a 90 ° C e arrefecimento lento até à temperatura ambiente em intervalos de 1 ° C por min.
2. Preparar pelo menos quatro reacções de ligação paralelas por amostra de ADN genómico, que contêm 1,5 uM ligante ligado, ADN fragmentado 1 ug e 800 U de ligase de ADN de T4 em 50 ul. Ligadura durante a noite a 12 ° C. Purifica-se no dia seguinte com um kit de purificação de PCR.
3. Para amostras preparadas por sonicação, digestão a reacção de ligação purificado com 100 L de uma restricenzima ção que cliva a jusante da LTR a montante (por exemplo, BglII para o HIV-1) sob o fabricante de condições recomendadas durante a noite. Purifica-se o ADN utilizando um kit de purificação de PCR.

5. Amplify virais LTR-anfitrião DNA genômico Junções por PCR Semi-aninhados

Nota: Para assegurar a diversidade da biblioteca óptima, pelo menos, 4-8 PCR paralelas, dependendo da concentração de DNA da reacção de ligação recuperado, deve ser preparada para cada amostra para duas voltas de PCR. concentração de molde de ADN devem ser quantificada por espectrofotometria. Neste protocolo, os primeiro e segundo ciclos de PCR, primers específicos empregar-LTR aninhadas, mas o mesmo iniciador específico do ligante é usado para ambas as fases (Tabela 1). O segundo primer específico-LTR rodada e as sequências de adaptador primário codificação específica do vinculador para o agrupamento do DNA, bem como locais de ligação de iniciador de sequenciação. O primer específico aninhado-LTR também codifica uma sequência de índice de 6 nt, WHich pode variar entre os diferentes primers para bibliotecas de multiplexação dentro do mesmo sequenciamento prazo.

1. Prepare primeiros PCRs redondos contendo os ingredientes por tubo como listados na Tabela 2.
   Nota: O iniciador específico do ligante abriga 22 nt de complementaridade com o ligante, uma temperatura de fusão de 53 ° C, um conteúdo GC de 45%, e a sua extremidade 3 'está localizado a montante 15-16 pb de terminais 3' de os diferentes ligantes longos fios (Tabela 1). A primeira ronda de 27 nt LTR iniciador tem uma temperatura de fusão de 59 ° C, um conteúdo GC de 48%, e a sua extremidade 3 'está localizado 34 pb a montante do terminal U5 do HIV-1. A região da segunda volta iniciador 26 nt LTR que é complementar ao VIH-1 LTR tem uma temperatura de fusão de 60 ° C, um conteúdo GC de 50%, e a sua extremidade 3 'está localizado 18 pb a montante do U5 viral terminus. Recomenda-se que a temperatura oligonucleotídeo fusão e GC-índice deve imitar esses parâmetros se os usuáriosiniciadores de PCR projeto com sequências alteradas (incluindo para uso com outros retrovírus) ^21.
2. Execute primeira rodada PCR nas seguintes parâmetros termociclador: Um ciclo: 94 ° C durante 2 minutos; 30 ciclos: 94 ° C durante 15 seg, 55 ° C durante 30 seg, 68 ° C durante 45 seg; um ciclo: 68 ° C durante 10 min.
3. Piscina reacções e purifica-se utilizando um kit de purificação de PCR. Prepare segundo PCRs redondos que contêm os ingredientes por tubo conforme Tabela 3. Execute a segunda rodada de PCR utilizando os parâmetros termociclador descritos no Passo 5.2. Reunir as reacções e purifica-se o ADN utilizando um kit de purificação de PCR comercial seguindo as instruções do fabricante.
   Nota: Uma variedade de sequências de índice recomendadas compatíveis com NGS DNA de agrupamento estão disponíveis ^71.

6. Execute QC e NGS (normalmente terminada por um serviço de sequenciação)

1. (QC ensaio # 1) Confirmar Passo 5.3 concentração de DNA da biblioteca usando um flúormedidor de ^55. Resumidamente, preparar padrões e amostras experimentais em um volume final de 200 de água livre de nuclease ul. tubos de vórtice durante 2-3 segundos, incubar à temperatura ambiente durante 2 min e, em seguida, ler as amostras no fluorómetro.
   Nota: As amostras devem conter uma concentração mínima de 2 nM de ADN da biblioteca num volume mínimo de 15 ul.
2. (QC ensaio # 2) Confirmar distribuição de tamanho de fragmento de ADN utilizando um ensaio à base de fita ^56.
   Nota: A distribuição ideal é um pico de ADN relativamente larga centrado em torno de 500 pb de comprimento. Se uma quantidade significativa de material é maior do que 1 kb, então recomenda-se a incorporar um processo de selecção de tamanho para eliminar as espécies de ADN mais longos, o que vai impedir a amplificação ponte durante o agrupamento. Em contrapartida, se um pico significativo é aparente cerca de 100 a 200 pb, um dímero de primer pode ter formado durante a PCR. Neste caso, o processo deve ser optimizada para minimizar a formação de dimeros de iniciadores.
3. (QC ensaio # 3) Confirm incorporação adequada de adaptadores em biblioteca de ADN por PCR quantitativa ^57.
4. Executar NGS seguinte literatura aplicação do fabricante. Utilizar uma espiga em de 10% (w / w) ΦX174 ADN, que irá optimizar a métrica de qualidade de tempo real, proporcionando a composição de base equilibrada para a sequenciação de execução.
   Nota: experimentos local de integração de seqüenciamento são normalmente submetidos a única final de 150 pb (SE150) ou emparelhado-end 150 pb (PE150) sequenciamento. PE150 é particularmente útil para capturar o ponto de fixação vinculador em cada molécula de ADN (por exemplo, aquando do exame de locais de integração para a evidência da expansão clonal da célula hospedeira).

7. Use um script Python ou Perl personalizado para analisar Sequenciamento de dados para LTR contendo seqüências, Colheita de distância LTR e sequências ligantes, e Mapa de genoma de referência com BLAT

1. ficheiros FASTA de digitalização para LTR contendo sequência lê, LTR de culturas e sequências de ligação longe de sequência de DNA genómico hospedeiro eexportar estas sequências para um novo arquivo FASTA. Mapa cortada lê tanto a um genoma de referência (por exemplo, versões do genoma hg19 humanos ou GRCh38) e o genoma viral usando BLAT ^58, com local de integração de saída coordenadas exportado para um arquivo .txt separado, utilizando as seguintes definições:
   stepSize = 6, minIdentity = 97, e maxIntron = 0
2. Analisar a saída BLAT txt ficheiro, remover autointegrations (isto é evidência de que o fim LTR tem integrado numa região interna do genoma de ADN virai) e outras sequências de mapeamento para o genoma do VIH-1, e criar uma saída separada txt ficheiro no qual todos os locais de integração duplicados foram condensadas em individuais, únicas coordenar hits.

8. Criar arquivos .bed que compreendam intervalos 15-NT circundantes Integrações, converter esses arquivos para FASTA, e construir Sequence Logos para exibir Preferências de Base redor Sites Integração

1. Criar arquivos .bed que listam um intervalo de bases paracada local de integração. Pelo menos 15 bases (5 a montante e a jusante 10) são sugeridos para a geração de sequência de logotipo. Gerar um arquivo FASTA a partir desses arquivos .bed usando a função fastaFromBed de BEDTools ⁵⁹ e este comando:
   fastaFromBed-fi / diretório / para / de referência / genoma / -name -s -cama 15_base_pair_file.bed Fo output_file.fasta
   Nota: O viral 5'-CA-3 'dinucleótido invariante é unida a acolher de ADN durante a integração, e a verificação da junção terminal do LTR de ADN celular é um filtro inicial importante para identificar bona fide locais de integração. Nós, adicionalmente, compilar logos sequência deste host população sequência de DNA para verificar os resultados experimentais. Como retrovírus exibir preferências assinatura base que cercam seus locais de integração ^14,15, os logos sequência servir para validar que os locais genómicos mapeadas surgiu através da integração IN-mediada, em comparação com outros mecanismos de recombinação tais como DNA não homólogoacabar juntando ^60,61.
2. Use WebLogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) para criar logotipos de sequência a partir dos arquivos FASTA. Clique em "Escolher arquivo" para fazer o upload do arquivo FASTA, e use as seguintes configurações: Formato de saída, PDF (vetor); tamanho do logotipo, grande; Primeiro número da posição, -5; gama Logo, -5 a 5; escala do eixo Y, 0,1, espaçamento tic do eixo Y, 0,5, esquema de cores, clássico (NA).

9. Criar Base Central Par .bed arquivos, verifique por Amostra contaminação cruzada, e mapear a distribuição de originais Integração Sites Relativo ao Features pertinentes Genomic

1. Uma vez que a integração retroviral ocorre de forma escalonada entre os fios DNAt, ajustar as coordenadas exactas de locais de integração de modo a reflectir o pb central da duplicação local alvo para o mapeamento genómico correcto de distribuição relativa a características genómicas.
   1. Portanto, para 5 pb duplicação de vírus como o HIV-1, crie um arquivo .bed com o deslocamento do i pb Centrallocal NTEGRAÇÃO por duas bases a jusante para o mapeamento de integrações para a cadeia positiva, e duas bases a montante para o mapeamento de integrações à cadeia menos.
2. Para verificar se há contaminação cruzada de amostras, calcular o número de locais de integração comuns entre as diferentes bibliotecas usando os BEDTools cruzam função para se cruzam bp centro .bed arquivos para duas amostras diferentes e seguindo este comando:
   bedtools cruzam -a central_basepair_1.bed -b central_basepair_2.bed -f 1,00 r -s> overlap1v2.txt
3. Contar o número de linhas dentro do arquivo overlap1v2.txt de saída a fim de quantificar o número exato de locais comuns entre as duas bibliotecas usando o seguinte comando:
   wc -l overlap1v2.txt
4. Baixe o arquivo .bed RefSeq anotação para a versão do genoma de referência que foi utilizado para o mapeamento local de integração do banco de dados UCSC Genome Anotação (por exemplo http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/database) ^62.
   1. Calcule o número de locais de integração abrangidos genes RefSeq usando os BEDTools cruzam função para intersectar o arquivo .bed par de bases central que foi gerado para a amostra com o RefSeq .bed seguinte arquivo este comando:
      bedtools cruzam -a central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38.bed u> RefSeq_sample1.bed
5. Contar o número de linhas dentro do arquivo RefSeq_sample1.bed de saída a fim de quantificar o número exato de sites de queda nos genes RefSeq usando o seguinte comando:
   wc -l RefSeq_sample1.bed
6. Repita os passos 9.3 e 9.4 para locais de integração de mapeamento para qualquer outra anotação de interesse para o qual um intervalo .bed arquivo está disponível. Baixe o arquivo .bed mais atual CpG ilha de anotação para o genoma de juro de referência do Banco de Dados do Genoma UCSC Anotação conforme indicado no Passo 9.4.
   1. Calcular o número de locais de integração caindo dentro de uma determinada diposição (ilustrado neste exemplo é uma janela de 5 kb) de ilhas de CpG utilizando a funo de janela de BEDTools e seguindo este comando:
      janela bedtools -w 2500 central_basepair_1.bed -b CpG_hg38.bed u> CpG_sample1.bed
7. Contar o número de linhas dentro do ficheiro CpG_sample1.bed de saída, a fim de quantificar o número exacto de sítios que caem dentro de 2,5 kb a montante ou a jusante de ilhas de CpG utilizando o comando seguinte:
   wc -l CpG_sample1.bed
8. Repita os passos 9.6 e 9.7 para locais de integração de mapeamento nas proximidades das EAT. Gerar uma versão alternativa do arquivo RefSeq.bed, onde genômica coordenadas de mapeamento para mais de um gene foram ajustados para refletir apenas um único gene presente nessa posição. Isso impede que superestimação da densidade gene circundante locais de integração. Calcular a densidade gene na região de 1 Mb redor de cada local de integração usando a função de janela BEDTools e seguindo este comando:
   Janela bedtools -w 500000 central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38_NonRedundant.bed u> GeneDensity_sample1.bed
9. Calcular a densidade média gene para todas as integrações no conjunto de dados, seguindo este comando:
   awk '(soma + = $ 7) END (impressão "Média =", soma / NR) "GeneDensity_sample1.bed

10. Estatisticamente Compare Integração site Distribuições entre as amostras usando dois de cauda teste exato de Fisher e Dois-atado Wilcoxon Rank Sum Test em R

Nota: o teste exato de Fisher Use para comparar a proporção de locais de integração dentro de genes RefSeq ou dentro de uma janela de ilhas CpG ou TSSs, mas usar o teste de Wilcoxon para comparar a distribuição da densidade gene em torno dos locais de integração. O programa está disponível em R http://www.r-project.org/.
Bicaudal teste exato de Fisher:

1. Usando os números calculados conforme indicado nos Passos 9.4 e 9.7, create matrizes para cada comparação em R de ocorrências observadas (integrações dentro de uma anotação ou dentro de uma janela em torno de uma anotação) versus restantes locais, seguindo este comando:
   (Annotation_of_interest <- matriz (c (SampleA # in, SampleA # restante, SampleB # in, SampleB # restante), nrow = 2, dimnames = list (c ( 'Center', 'Restante'), c ( 'SampleA', 'SampleB'))))
2. Calcule o valor P para a comparação por bicaudal teste exato de Fisher com o seguinte comando:
   fisher.test (annotation_of_interest, alternativa = 'two.sided') $ p.value
   Bicaudal de Wilcoxon rank sum:
3. Criar um arquivo .txt delimitado por tabulação em que cada coluna contém o nome da amostra na célula superior, seguido abaixo dos valores de densidade de genes para todos os locais de integração em que biblioteca (obtido a partir do arquivo .bed gerado no Passo 9.9). Importar este arquivo .txt delimitado por tabulação em R usando o seguinte comando e navigating para o diretório do arquivo correto:
   FILENAME <- as.data.frame (read.delim (file.choose (), header = T, check.names = FALSE, preencha = TRUE, setembro = ' t'))
4. Calcule o valor P para a comparação por bicaudal teste de Wilcoxon com o seguinte comando:
   wilcox.test (FILENAME $ SampleA, FILENAME $ SampleB, = alternativas "two.sided ', emparelhado = F, exato = T) $ p.value
   Nota: Os valores de P pode ser calculado apenas até um certo (extremamente baixo) limite em R, após o qual zero será retornado pelo programa. Para maciçamente diferentes amostras que produzem uma P = 0 em R, estimar o valor P como <2,2 x 10 ^-308.

11. Examine Raw Seqüenciamento de Dados para a evidência de expansão clonal de células contendo DNA Integrada Viral

Nota: Existe uma pequena possibilidade de mais de uma integração no exato nt no genoma de referência. Alternativamente, em uma únicategração caso podem tornar-se presentes em forma redundante de dados de sequenciação, devido à utilização de PCR durante a preparação da biblioteca e / ou através de duplicação de células antes da preparação do ADN. Análises recentes de DNA genômico de pacientes infectados pelo HIV têm distinguido estas possibilidades através da identificação de pontos pontos sonicação de cisalhamento / fixação de ligação únicos (que só pode surgir antes da PCR) dentro de sequências de DNA que contêm locais de integração idênticos ^52-54. Não existe actualmente um debate quanto ao facto de provírus abrigadas no interior das células clonalmente expandidas contribuir para o reservatório viral latente, e, portanto, é de particular interesse para caracterizar o seu nível de expansão ao estudar os locais de integração em pacientes humanos.

1. Semelhante ao procedimento listado na etapa 8.1, gerar ficheiros .bed listagem de um intervalo de bases estendendo-se, neste caso, de 25 nt a jusante de cada local de integração único (bases a montante são aqui desnecessários). Gerar um arquivo FASTA a partir desses arquivos .bed (conforme indicado noPasso 8.1) usando a função fastaFromBed de BEDTools e seguindo este comando:
   fastaFromBed-fi / diretório / para / de referência / genoma / -name -s -cama 25_base_pair_file.bed Fo output_file.fasta
   Nota: Para melhorar a especificidade de cada pesquisa é recomendado para extrair pelo menos 25 nt a jusante de cada local de integração para análises expansão clonal.
2. De preferência usando um script personalizado, procure o arquivo FASTA dados de seqüência cru para todas as cadeias que contêm uma correspondência exata com a 25 nt a jusante de cada local de integração único, e depositar estas sequências em um novo arquivo. Apare LTR e sequências de ligação das cordas matérias. Mesclar sequência PE lê através da conversão de leituras para o complemento reverso, aparando as sequências LTR e vinculador, e depois atribuir cordas READ2 ao seu par READ1 se as cordas partilham pelo menos 20 sobreposição nt.
3. Digitalizar os pontos de fixação vinculador de cada bloco local de integração. Classificar cada integração como "clonagem expandiu &# 34; Se os pontos de fixação ligante são ≥3 pb separados.
   Nota: Um protocolo para a análise expansão clonal, sem sequência fusão lê tem sido descrita ^52.
   Nota: A fragmentação do genoma no mesmo local exato por ultra-sons leva a uma subestimação da extensão da expansão clonal, e métodos para corrigir o viés experimental resultante foram descritos ^63,64.

Resultados

A Tabela 4 lista os resultados de uma experiência representativa para ilustrar a sensibilidade de NGS para a recuperação de locais de integração a partir de uma cultura de células infectadas. DNA celular não infectados foi utilizado para diluir em série de ADN genómico a partir de uma infecção em que todas as células, em média, continha uma integração ^40. As diluições foram preparadas em passos de cinco a uma diluição máxima de 1: 15.625. O ADN genómico da sér...

Discussão

Um protocolo para a análise de sítios de integração retroviral, a partir do passo inicial de infecção pelo vírus através do mapeamento dos padrões de distribuição genómicas, é descrito. Este protocolo é aplicável a qualquer retrovírus e qualquer tipo de célula infectáveis. Além disso, a tubagem de ensaio é muito sensível, com o potencial de recuperar um número de locais de integração satisfatória únicas a partir de diluições em série de ADN genómico equivalente ao de uma infecção iniciada com um MOI de 6,4 x 10 ^-5....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Gibco	11965-084 Meio de	cultura celular padrão, compatível com células HEK293T
Soro bovino fetal	Thermo Scientific	SH 30088.03	Diferentes lotes de soro podem precisar ser pré-selecionados para produção viral ideal
Penicilina/Estreptomicina	Corning	30-002-Cl	Antibióticos a serem adicionados ao DMEM
Solução salina tamponada com fosfato	Mediatech	21-040-CV	Usado para lavar células
Tripsina EDTA	Corning	25-053-CI	Usado para separar células aderentes de placas de cultura de tecidos
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688	reagente de transfecção de DNA
0,45 µ m Filtros	Thermo Scientific	09-740-35B	Usado para filtrar meios de cultura de células contendo partículas de vírus
Turbo DNase	Ambion	AM2239	Usado para degradar o DNA do plasmídeo de transferência de estoques de vírus
HIV-1 p24 Ensaio de captura de antígeno	ABL Inc.	5447	Usado para quantificar o rendimento da produção de vírus
DNeasy Blood & Kit de Tecidos	Qiagen	69506	Usado para purificar o DNA genômico das células
Sonicator	Covaris	S2	Com este modelo de sonicador, execute duas rodadas de ciclo de trabalho, 5%; intensidade, 3; ciclos por explosão, 200; tempo, 80 seg
Água Livre de Nuclease	GeneMate	G-3250-125	Água disponível comercialmente é recomendada para reduzir a possibilidade de contaminação cruzada da amostra
Purificação de PCR QIAQuick Kit	Qiagen	28106	Usado para purificar DNA durante a construção da biblioteca
Kit de Reparo Final de DNA	Epicentro	ER81050	Usado para reparar extremidades de DNA de amostras de DNA sonicado
Fragmento de Klenow (3'-5' exo–)	New England Biolabs (NEB)	M0212S	Usado com dATP para fragmentos de DNA reparados com cauda A
dATP Thermo	Scientific	R0141	Trifosfato de desoxiadenosina
MseI	NEB	R0525L	Endonuclease de restrição para clivagem de DNA genômico
BglII	NEB	R0144L	Endonuclease de restrição para suprimir a amplificação da sequência T4 DNA ligase U5 do HIV-1 a montante
	NEB	M0202L/6218	Enzima para união covalente de extremidades de DNA compatíveis
Oligonucleotídeos	de DNA Tecnologias integradas	de DNA personalizadas	Faça com que a empresa purifique os oligos. A purificação por HPLC é suficiente para os ADN < 30 nucleotídeos; PAGE purifica DNAs mais longos
Vantagem 2 Mistura de Polimerase	Clontech	639202	Mistura comercial contendo DNA polimerase para PCR
dNTPs (soluções de 100 mM)	Thermo Scientific	R0181	Dilua os quatro produtos químicos no gelo com água estéril para atingir as concentrações intermediárias de 2,5 mM cada dNTP
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Espectrofotômetro para determinação da concentração
de DNAQubit Fluorímetro	Life Technologies	Qubit® 3.0	Fluorômetro usado para confirmar a concentração de DNA da biblioteca do site de integração
2200 Sistema Agilent		G2964AA	Ensaio baseado em fita para confirmar a distribuição do tamanho do DNA da biblioteca do site de integração
MiSeq	Illumina	SY-410-1003	Usado para NGS