Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Summary

Descrevemos um protocolo para amplificar locais de integração retroviral a partir do DNA genômico de células infectadas, sequenciando as junções amplificadas vírus-hospedeiro e, em seguida, mapeando essas sequências para um genoma de referência. Também descrevemos técnicas para quantificar a distribuição de locais de integração em relação a várias anotações genômicas usando BEDTools.

Abstract

preferências de integração assinatura retrovírus exposição em ambos as escalas local e global. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para (1) geração de diversas bibliotecas de sites de integração retrovirais utilizando PCR amplificação mediada por ligação (LM-PCR) e sequenciamento de próxima geração (NGS), (2) o mapeamento da localização genômico de cada a vírus acolher junção usando BEDTools, e (3) para analisar os dados de relevância estatística. O ADN genómico extraído a partir de células infectadas está fragmentado por digestão com enzimas de restrição ou por sonicação. Depois de DNA final de reparação adequado, os ligantes de cadeia dupla são ligadas para as extremidades do DNA, e PCR com iniciadores semi-internos é conduzida usando iniciadores complementares para tanto a extremidade mais longa repetição terminal (LTR) do vírus e o ADN ligante ligado. Os iniciadores de PCR transportar sequências necessárias para o agrupamento de ADN durante NGS, eliminando a exigência de ligação adaptador separado. Controlo de Qualidade (QC) é conduzido para avaliar a distribuição de tamanho de fragmento de ADN e adaptarer incorporação de ADN antes de NGS. arquivos de saída de seqüência são filtrados para LTR contendo lê, e as sequências que definem o LTR e o ligante são cortadas de distância. sequências celulares hospedeiras aparadas são mapeados para um genoma de referência usando BLAT e são filtrados para 97% de identidade minimamente para um ponto único no genoma de referência. locais de integração únicas são examinados para nucleotídeo adjacente (nt) sequência e distribuição relativa a várias características genômicas. Usando este protocolo, as bibliotecas local de integração de alta complexidade pode ser construído a partir de ADN genómico em três dias. Todo o protocolo que engloba infecção virai exógeno de células de cultura de tecidos sensíveis à análise do local de integração pode, portanto, ser realizada em cerca de uma a duas semanas. Recentes aplicações desta tecnologia referem-se a análise longitudinal de locais de integração a partir de pacientes infectados com HIV.

Introduction

A integração de ADN virai (vDNA) no genoma da célula hospedeira é um passo essencial no ciclo de vida retroviral. A integração é conseguida pela integrase viral enzima (NOS), que realiza dois processos catalíticos distintos que levam à criação do provírus inserida estavelmente ^um. EM subunidades envolver as extremidades do vDNA linear que é gerada por meio de transcrição reversa, formando o intasome de ordem superior com vDNA extremidades unidas por um multímero ^4/2 NO. EM cliva 'extremidades do vDNA jusante da invariantes 5'-CA-3' a 3 em sequências de um processo conhecido como 3'-processamento, deixando um recesso 3 'termin....

Protocol

1. Gerar stocks de vírus

Nota: Um diagrama de fluxo do aspecto banco molhado deste protocolo está representado na Figura 1 Os detalhes da produção de estoque viral e infecção subsequente de células de cultura de tecido geralmente se aplicam a diferentes tipos de retrovírus.. Para algumas experiências, a célula alvo pode não expressam o receptor virai endógeno (s), e em tais casos, a construção de partículas retrovirais pseudotipados albergando heterólogo glicoproteína do envelope viral, por exemplo, da glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV-G), será necessária para a infecção ^44,45.

Results

A Tabela 4 lista os resultados de uma experiência representativa para ilustrar a sensibilidade de NGS para a recuperação de locais de integração a partir de uma cultura de células infectadas. DNA celular não infectados foi utilizado para diluir em série de ADN genómico a partir de uma infecção em que todas as células, em média, continha uma integração ^40. As diluições foram preparadas em passos de cinco a uma diluição máxima de 1: 15.625. O ADN genómico da sér.......

Discussion

Um protocolo para a análise de sítios de integração retroviral, a partir do passo inicial de infecção pelo vírus através do mapeamento dos padrões de distribuição genómicas, é descrito. Este protocolo é aplicável a qualquer retrovírus e qualquer tipo de célula infectáveis. Além disso, a tubagem de ensaio é muito sensível, com o potencial de recuperar um número de locais de integração satisfatória únicas a partir de diluições em série de ADN genómico equivalente ao de uma infecção iniciada com um MOI de 6,4 x 10 ^-5........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	11965-084 Meio de	cultura celular padrão, compatível com células HEK293T
Soro bovino fetal	Thermo Scientific	SH 30088.03	Diferentes lotes de soro podem precisar ser pré-selecionados para produção viral ideal
Penicilina/Estreptomicina	Corning	30-002-Cl	Antibióticos a serem adicionados ao DMEM
Solução salina tamponada com fosfato	Mediatech	21-040-CV	Usado para lavar células
Tripsina EDTA	Corning	25-053-CI	Usado para separar células aderentes de placas de cultura de tecidos
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688	reagente de transfecção de DNA
0,45 µ m Filtros	Thermo Scientific	09-740-35B	Usado para filtrar meios de cultura de células contendo partículas de vírus
Turbo DNase	Ambion	AM2239	Usado para degradar o DNA do plasmídeo de transferência de estoques de vírus
HIV-1 p24 Ensaio de captura de antígeno	ABL Inc.	5447	Usado para quantificar o rendimento da produção de vírus
DNeasy Blood & Kit de Tecidos	Qiagen	69506	Usado para purificar o DNA genômico das células
Sonicator	Covaris	S2	Com este modelo de sonicador, execute duas rodadas de ciclo de trabalho, 5%; intensidade, 3; ciclos por explosão, 200; tempo, 80 seg
Água Livre de Nuclease	GeneMate	G-3250-125	Água disponível comercialmente é recomendada para reduzir a possibilidade de contaminação cruzada da amostra
Purificação de PCR QIAQuick Kit	Qiagen	28106	Usado para purificar DNA durante a construção da biblioteca
Kit de Reparo Final de DNA	Epicentro	ER81050	Usado para reparar extremidades de DNA de amostras de DNA sonicado
Fragmento de Klenow (3'-5' exo–)	New England Biolabs (NEB)	M0212S	Usado com dATP para fragmentos de DNA reparados com cauda A
dATP Thermo	Scientific	R0141	Trifosfato de desoxiadenosina
MseI	NEB	R0525L	Endonuclease de restrição para clivagem de DNA genômico
BglII	NEB	R0144L	Endonuclease de restrição para suprimir a amplificação da sequência T4 DNA ligase U5 do HIV-1 a montante
	NEB	M0202L/6218	Enzima para união covalente de extremidades de DNA compatíveis
Oligonucleotídeos	de DNA Tecnologias integradas	de DNA personalizadas	Faça com que a empresa purifique os oligos. A purificação por HPLC é suficiente para os ADN < 30 nucleotídeos; PAGE purifica DNAs mais longos
Vantagem 2 Mistura de Polimerase	Clontech	639202	Mistura comercial contendo DNA polimerase para PCR
dNTPs (soluções de 100 mM)	Thermo Scientific	R0181	Dilua os quatro produtos químicos no gelo com água estéril para atingir as concentrações intermediárias de 2,5 mM cada dNTP
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Espectrofotômetro para determinação da concentração
de DNAQubit Fluorímetro	Life Technologies	Qubit® 3.0	Fluorômetro usado para confirmar a concentração de DNA da biblioteca do site de integração
2200 Sistema Agilent		G2964AA	Ensaio baseado em fita para confirmar a distribuição do tamanho do DNA da biblioteca do site de integração
MiSeq	Illumina	SY-410-1003	Usado para NGS