De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

Summary

Usando o conjunto de DNA, vectores de múltiplos CRISPR podem ser construídos em paralelo numa única reacção de clonagem, tornando a construção de um grande número de vectores CRISPR uma tarefa simples. Tomate raízes peludas são um excelente sistema modelo para validar vetores CRISPR e gerar materiais mutantes.

Abstract

Mutações de DNA direcionadas geradas por vetores com tecnologia de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR)/Cas9 provaram ser úteis para estudos de genômica funcional. Embora a maioria das estratégias de clonagem seja simples de executar, elas geralmente usam várias etapas e podem levar vários dias para gerar as construções finais. O método apresentado aqui é baseado na montagem de DNA e pode produzir vetores CRISPR totalmente funcionais em uma única reação de clonagem. A construção vetorial também pode ser agrupada, aumentando ainda mais a eficiência e a utilidade do processo. Uma modificação do método é usada para criar vetores CRISPR com vários alvos genéticos. Os vetores CRISPR são então transformados em raízes peludas de tomate para gerar materiais transgênicos com modificações de DNA direcionadas. As raízes peludas são um sistema útil para testar a funcionalidade do vetor, pois são tecnicamente simples de gerar e passíveis de produção em larga escala. Os métodos apresentados aqui terão ampla aplicação, pois podem ser usados para gerar uma variedade de vetores CRISPR e ser usados em uma ampla gama de espécies de plantas.

Introduction

A capacidade de gerar modificações no DNA orientadas e dotadas de CRISPR / Cas9 tem um grande potencial para estudos de genômica funcional. Existem dois componentes do sistema CRISPR / Cas9; a nuclease Cas9, derivada de Staphylococcus pyogenes e um 100-nt ARN guia (gRNA) de aproximadamente molécula que dirige Cas9 ao local de ADN alvo (s) ^1. Reconhecimento do alvo é conferido pelo primeiro ~ 20 nt do gRNA, que permite a produção de alto rendimento de segmentação vetores ^2,3. A maioria dos organismos que podem ser modificadas, já esteve com CRISPR tecnologia / Cas9 ^4,5.

Em plantas, os promotores co....

Protocol

1. Guia de RNA Concepção e Construção Vector

1. Identificar sequências alvo para os genes de interesse. Há uma variedade de programas de encontrar alvo CRISPR linha adequados para este passo ^13,14.
   NOTA: Aqui usamos o GN ₂₀ GG motivo alvo, mas outros desenhos podem ser adequadas, dependendo do sistema de aplicação ou vector usado.
2. Design 60-mer oligonucleótidos gRNA para incluir a porção GN ₁₉ dos motivos alvo flanqueado em 5 'e 3' as sequências de 20 nt que são necessárias para a montagem de ADN. O motivo final de 60-mer é: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN ₁₉ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.

Results

construção CRISPR vector com montagem de DNA normalmente gera dezenas a centenas de clones independentes. Triagem Colony por PCR facilmente identifica clones corretos e pode distinguir entre plasmídeos com e sem inserções (Figura 2A) que é útil para solução de problemas. Normalmente, todos os clones contêm uma inserção e um usuário pode optar por ignorar as etapas de triagem colónia completamente. Digestões de diagnóstico (Figura 2B) e Sanger de sequenci.......

Discussion

Como a montagem de DNA é usada para recombinar quaisquer sequências de DNA sobrepostas, esse método de clonagem pode ser aplicado a qualquer construção de vetor CRISPR. A maioria dos esquemas de clonagem CRISPR usa síntese gênica do gRNA, enzimas de restrição tipo IIS^17,18 ou PCR de extensão de sobreposição¹⁹. Cada uma dessas técnicas tem vantagens e desvantagens inerentes, mas normalmente exigem várias etapas práticas de clonagem. A principal vantagem do método de clonagem apresentado aqui é que to.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® (Mistura de montagem de DNA HiFi)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	O plasmídeo p201H:Cas9 (59176) também é compatível com as sobreposições e enzimas relatadas.
pUC gRNA Shuttle	Addgene	47024
SwaI	New England Biolabs	R0604S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
Zymo limpeza e concentrador-5 purificação de coluna	Zymo Research	D4003
NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (Buffer 4)	New England Biolabs	B7204S
NEB Buffer 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Spin Column (preparação de plasmídeos)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	New England Biolabs	R3195S
StyI-HF®	New England Biolabs	R3500S
MS Salts + Gamborg Vitaminas	Fitotecnologia Laboratórios	M404
Phytagel™ (goma gelana)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 Caixas	Sigma Aldrich	V8505
Micropore™ fita cirúrgica	3M	1535-0
Timentin® (Ticarcilina/ácido clavulânico)	Vários	0029-6571-26
Primers 5' → 3'SwaI_MtU6F
	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
ScaffoldF	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	Não pode ser usado para sequenciamento de Sanger, pois há um segundo sítio de ligação no plasmídeo
UNS1_Scaffold R	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
As sequências em negrito denotam sobreposições de 20 nt com p201N:Cas9 linearizado.