Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Resumo

Os neutrófilos são o tipo mais abundante de glóbulos brancos. O isolamento de neutrófilos do sangue humano pelo método de separação por gradiente de densidade e a diferenciação de células promielocíticas humanas (HL60) ao longo da via granulocítica são descritos aqui; testar seu papel na sensibilidade das células do linfoma aos agentes antilinfoma.

Resumo

Os neutrófilos são o tipo mais abundante (40% a 75%) de glóbulos brancos e estão entre as primeiras células inflamatórias a migrar para o local da inflamação. Eles são atores-chave no sistema imunológico inato e desempenham papéis importantes na biologia do câncer. Os neutrófilos têm sido propostos como mediadores chave da transformação maligna, progressão tumoral, angiogênese e na modulação da imunidade antitumoral; através da liberação de fatores solúveis ou de sua interação com células tumorais. Para caracterizar as funções específicas dos neutrófilos, um método rápido e confiável é cobiçado para o isolamento in vitro de neutrófilos do sangue humano. Aqui, um método de separação por gradiente de densidade é demonstrado para isolar neutrófilos e células mononucleares do sangue. O procedimento consiste em estratificação da solução de gradiente de densidade, como Ficoll, cuidadosamente acima do sangue diluído obtido de pacientes diagnosticados com leucemia linfocítica crônica (LLC), seguida de centrifugação, isolamento da camada mononuclear, separação de neutrófilos de hemácias por dextrana e lise de eritrócitos residuais. Este método demonstrou isolar neutrófilos ≥ 90 % de pureza. Para imitar o microambiente tumoral, experimentos tridimensionais (3D) foram realizados usando matriz de membrana basal, como Matrigel. Dada a meia-vida curta dos neutrófilos in vitro, experimentos 3D com neutrófilos humanos frescos não podem ser realizados. Por esta razão, as células HL60 promielocíticas são diferenciadas ao longo da via granulocítica usando os indutores de diferenciação dimetilsulfóxido (DMSO) e ácido retinóico (RA). O objetivo de nossos experimentos é estudar o papel dos neutrófilos na sensibilidade das células do linfoma aos agentes antilinfoma. No entanto, esses métodos podem ser generalizados para estudar as interações de neutrófilos ou células semelhantes a neutrófilos com uma grande variedade de tipos de células em diferentes situações.

Introdução

Células imunitárias inatas constituem uma proporção essencial das células dentro do microambiente do tumor e têm sido associados com a malignidade de tumores em pacientes e de modelos animais de cancro ^1. Recentemente, tornou-se mais amplamente apreciado que as respostas imunitárias crónicas desempenham papéis críticos na promoção da progressão do tumor, metástase e resistência às quimioterapias ^2. Os macrófagos são células imunes inatos importantes que foram mostrados para regular directamente a resposta das células de tumor à quimioterapia ^3,4. No entanto, o papel dos neutrófilos, os principais intervenientes no sistema imunitário i....

Protocolo

1. neutrófilos Isolamento e Co-cultura com células leucémicas primárias

NOTA: Os procedimentos foram realizados sob a aprovação do comitê de Lyon Hospital Ética com todos os pacientes que assinaram o consentimento informado.

1. Isolamento de células leucémicas primárias e neutrófilos
   1. Recolhe tubos de sangue periférico em EDTA (1,8 mg de EDTA por mililitro de sangue) a partir de pacientes diagnosticados com leucemia linfocítica crónica (CLL).
   2. Adicionar a cada 15 ml de sangue para um tubo estéril de 50 ml e dilui-se com 15 ml de RPMI (diluição 1: 1), em seguida, cuidadosamente e lentamente adicion....

Resultados

Densidade método de separação por gradiente descrito aqui fornece as células leucémicas primárias e neutrófilos não estimulados isolados a partir do sangue de pacientes com LLC Figura 1A representa as diferentes camadas de sangue obtidas após centrifugação em gradiente de densidade (de cima para baixo:. Plaquetas e plasma, anel branco representam as células mononucleares, solução de gradiente de densidade, granulócitos e eritrócitos). Figura 1B e 1C most.......

Discussão

Descrito aqui, um protocolo eficaz, simples, rápido e barato para o isolamento dos neutrófilos a partir de sangue humano com elevada pureza utilizando a abordagem de centrifugação em gradiente de densidade e nas mesmas células mononucleares passo também são separados e recuperados. As populações de células isoladas são ≥90% puro.

Vários métodos estão disponíveis para o isolamento dos neutrófilos a partir de sangue humano. Estes incluem métodos semelhantes utilizando gradientes descontínuos <.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
Solução salina tamponada com fosfato (PBS contém cálcio e magnésio)	Gibco Invitrogen	14040-091
N-acetil-L-alanil-L-glutamina (L-Glutamina)	Life technologies	25030-024
Penicilina estreptomicina (Pen Strep)	Life technologies	15140-122
Inibidor de tirosina quinase (Btk) de Bruton (Ibrutinibe)	CliniSciences	A3001
Vincristina	EG labo
BD Matrigel matriz de membrana de base	BD Biosciences	354234	Colocado a 4 oC durante a noite (O/N) antes do dia do experimento
Tampão de lise de glóbulos vermelhos	BD Biosciences	555899
Ficoll (Pancoll)	PAN Biotech	P04-60500
Dextran	Sigma-Aldrich	D8906
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Ácido retinóico	Sigma-Aldrich	R2625
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Cloreto de sódio (NaCl)	Euromedex	S3014
Anexando V-FLOUS	Roche	11  988  549  Kit 001
RAL 555 Kit de coloração Giemsa modificada	Cosmos Biomedical	CB361550-0000
Citometria de fluxo LSRII	BD Biosciences
Cytocentrifuge	Thermo Scientific
Leica Microscópio DMR-XA	Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Contador de Viabilidade	Nexcelom  Biociência

Kit de coloração