Method Article

Análise Funcional Complementação (FCA): Um Exercício Laboratório concebido e implementado para complementar o Ensino de Bioquímica Pathways

DOI:

10.3791/53850

⸱

June 24th, 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

In This Article

Summary

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A validação de actividades enzimáticas envolvidas nas vias bioquímicas podem ser elucidada utilizando a análise de complementação funcional (FCA). Descritos neste manuscrito é o ensaio de FCA que demonstra a actividade enzimática de enzimas envolvidas no metabolismo de aminoácidos, resposta rigorosas bacteriana e biossíntese bacteriana do peptidoglicano.

Abstract

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Ensaio de complementação funcional (FCA) é um ensaio in vivo que é amplamente utilizado para elucidar a função / função de genes / enzimas. Esta técnica é muito comum em bioquímica, genética e muitas outras disciplinas. Uma visão abrangente da técnica para complementar o ensino de vias bioquímicas que pertencem aos aminoácidos, peptidoglicano e da resposta rigorosa bacteriana é relatado neste manuscrito. Dois ADNc do thaliana organismo modelo Arabidopsis planta que estão envolvidas no metabolismo de lisina (L, aminotransferase L-diaminopimelato (dapL) e tirosina aminotransferase (tyrB) envolvida no metabolismo da tirosina e fenilalanina são realçados. Além disso, o peptidoglicano bacteriano via anabólico é realçada por meio da análise da -acetylmuramoyl-L-alanil-D-meso-ligase glutamate- -2,6-diaminopimelato (mûre) gene UDP-N a partir da bactéria Verrucomicrobium spinosum envolvido na transversal-linking de peptidoglicano. A resposta rigorosa bacteriana também é relatado por meio da análise do rsh (R ela / s Pot h omolog) gene bifuncional responsável por um fenótipo hiper-mucóide na sp bactéria Novosphingobium. Quatro exemplos de FCA são apresentados. O vídeo vai se concentrar em três deles, ou seja, lisina, peptidoglicano e da resposta rigorosa.

Introduction

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complementação funcional no contexto da elucidação da função (s) / papel (s) de um gene é definido como a capacidade de um homólogo particular ou gene ortólogo para restaurar um mutante particular com um fenótipo observável para o estado de tipo selvagem quando o homólogo ou gene ortólogo é introduzido na forma cis ou trans para o fundo mutante. Esta técnica tem sido amplamente utilizado para isolar e identificar a função (s) / papel (s) de vários genes. Um exemplo particular é o isolamento e identificação de descarboxilase orotidina-5-fosfato a partir de Cândida albicans utilizando o mutante URA3 de S. cerevisiae e o muta....

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Protocol

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NOTA: Os autores estão dispostos a fornecer estirpes bacterianas e plasmídeos recombinantes para facilitar a incorporação da análise de complementação funcional para fins de ensino para os indivíduos que estão interessados. Os plasmídeos que foram usados ​​para facilitar experiências de complementação funcionais estão listados na Tabela 1.

1. Construção de plasmídeos para a complementação funcional

  1. Clonagem de diaminopimelato aminotransferase (dapL) para complementação funcional.
    1. Amplificar o enquadramento de leitura aberto dapL (ORF) do V. spinosum e ADNc a partir de A. thaliana e

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Results

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As estirpes bacterianas que são empregues nas várias análises de complementação funcional estão listados na Tabela 2.

análise de complementação funcional: L, aminotransferase L-diaminopimelato (dapL)

A E. coli mutante duplo AOH1 (Δ dapD :: Kan2, dapE6) abriga uma mutação no gene DAPE e uma deleção completa do gene dapD

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Discussion

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Muitos dos cursos que são parte integrante da Biotecnologia e currículo Molecular Bioscience no Instituto de Tecnologia de Rochester têm uma componente laboratorial, além da parte de leitura do curso. O currículo para o ano lectivo 2014-2015 contém um total de 48 cursos, 29 dos quais contêm um componente laboratorial que representam aproximadamente 60%. Um tal curso é Fundamentos de Bioquímica e Patologia (FPBP), um curso de blended aula / laboratório e Bio Separação: Princípios e Práticas (BPP), um curso baseado em lab.......

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Disclosures

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

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AOH e MAS reconhece a Faculdade de Ciências e da Thomas H. Gosnell Escola de Ciências da Vida no Instituto de Tecnologia de Rochester para o apoio. Este trabalho foi apoiado em parte pela United States National Science Foundation (NSF) prêmio para AOH MCB-1120541.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli mutantesHudson/Savka lab ou CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElectroporatorBiorad-USA1652100
Electroporation CuvettesBiorad-USA1652082
Incubadora com temperatura controladaMicrocentrífuga Genérica Genérica
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Caldo LuriaThermofisher Scientific12795084
M9 MédioSigma-Aldrich63011
Batata Dextrose MédiaFisher Scientfic DF0013-15-8
CanamicinaSigma-AldrichK1377
DiaminopimelatoSigma-Aldrich92591
TiminaSigma-AldrichT0376
CloranfenicolSigma-AldrichC0378
TirosinaSigma-AldrichT3754
FenilalalaninaSigma-AldrichP2126
AspartatoSigma-AldrichA9256
ValinaSigma-AldrichV0500
LeucinaSigma-AldrichL8000
IsoleucinaSigma-AldrichI2752
UracilSigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
ArabinoseSigma-AldrichA3256
TetracylineSigma-Aldrich87128
Taq DNA polimeraseThermofisher Scientific10342-020
Platinum pfx DNA polimeraseThermofisher Scientific11708-013
T4 DNA ligaseThermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alphaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/topo vectorThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 VectorThermofisher ScientificK2030-01

References

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  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C.

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Functional ComplementationEnzyme Activity AssayGene Function AnalysisElectroporation TransformationBacterial Mutant SelectionIn Vivo ConditionsAmino Acid MetabolismPeptidoglycan SynthesisStringent Response PathwayArabidopsis Thaliana

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