Aqui, demonstramos um método de produção simples para microgotículas de água em óleo (A/S) monodispersas e controláveis por tamanho usando um dispositivo microfluídico centrífugo baseado em capilares. Este método requer apenas um pequeno volume de amostra e permite uma produção de alto rendimento. Esperamos que este método seja útil para análises bioquímicas e celulares rápidas.
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Artigo de método
Dispositivo micro centrífuga baseada capilar para a Formação tamanho controlável de Monodisperse microgotas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aqui, demonstramos um método simples para a produção rápida de, monodispersas, microgotículas de E / S de tamanho controlável W usando um dispositivo de microfluidos centrífuga à base de capilar. microgotículas W / S foram recentemente utilizados em métodos eficientes que permitem miniaturizados experiências químicas. Por conseguinte, o desenvolvimento de um método versátil para produzir monodispersa W / O microgotículas é necessária. Desenvolvemos um método para gerar monodispersa microgotículas W / O com base em um dispositivo axissimétrico centrífuga à base de capilar co-corrente de microfluidos. Tivemos sucesso no controlo do tamanho das microgotículas ajustando o orifício capilar. O nosso método requer equipamento que é mais fácil de usar do que com outras técnicas de microfluidos, requer apenas um pequeno volume (0,1-1 pi) da solução de amostra para o encapsulamento, e permite a produção de centenas de milhares número de microgotículas W / O por segundo . Esperamos que este método ajudará estudos biológicos que requerem precioso s biológicaplos de conservação do volume de amostra, para uma rápida bioquímica análise quantitativa e estudos biológicos.
Introdução
W / O microgotículas 1-5 têm muitas aplicações importantes para o estudo da bioquímica e da tecnologia biológica, incluindo a síntese de proteínas 6, 7 cristalização de proteínas, emulsão de PCR 8,9, encapsulamento de células 10, e construção de sistemas semelhantes a células artificiais 5,6. Para produzir microgotículas W / O para estas aplicações, são importantes critérios de controlo de tamanho e monodispersibility das microgotículas W / O. Microcanais para fazer monodispersa, tamanho controlável W / O microgotículas 11 baseiam-se no método de co-corrente 12,13, método de focagem de fluxo de 14,15, e o método T-junção 16 em microcanais. Embora estes métodos produzem microgotículas / O w altamente monodispersas, o processo de microfabricação requer um tratamento complicado e técnicas especializadas para a preparação de microcanais, e requer também uma grande quantidade de solução de amostra (pelo menos, várias centenas81; l) por causa do volume morto inevitável nas bombas de seringa e tubos que conduzem a solução de exemplo para os microcanais. Assim, um método fácil de usar e de baixo volume morto para gerar monodisperso W / O microgotas é necessário.
Este papel, juntamente com vídeos de procedimentos experimentais, descreve um dispositivo de centrifugação com base em capilar axissimétrico co-fluir microfluidos 17 para a geração de tamanho de célula, monodispersa W / O microgotículas (Figura 1). Este método simples alcança monodispersity tamanho e controlabilidade tamanho. Ela exige apenas uma mesa mini-centrífuga e um dispositivo de co-fluindo axissimétrico baseada capilar microfluídico fixo em um microtubo de amostragem. Nosso método necessita apenas de um volume muito pequeno (0,1 ul), e não desperdiçar qualquer volume significativo da amostra.
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Protocolo
1. Fabrico de um dispositivo micro-capilar baseada
- Configurar dos titulares
Nota: O desenho titular é apresentada na Figura 2A.- Recorte cada um dos quatro discos de os suportes (figura 2A (i) - (iv)) a partir de chapa de plástico poliacetal 2 mm de espessura utilizando uma máquina de moagem. Use as seguintes dimensões para cada um dos quatro discos do titular: (i) o disco 1 de diâmetro 8,5 milímetros, furo capilar (CH) de diâmetro 1,3 mm parafuso furo (SH) de diâmetro 1,8 mm; (Ii) o disco 2 de diâmetro 8,7 mm, diâmetro CH 2,0 mm, diâmetro SH 1,8 mm; (Iii) do disco 3 de diâmetro 8,7 mm, diâmetro CH 0,5 mm, diâmetro SH 1,8 mm; e (iv) do disco 4 9,1 milímetros de diâmetro, CH diâmetro 1,0 mm de diâmetro SH 1,8 milímetros.
- Monte os suportes usando M2 × 40 parafusos (Figura 2B). Uma parte inferior do suporte (Figura 2B) é constituído por um disco e o disco 2 na figura 2A (i), (ii) e uma parte superior (Figure 2B) do suporte consiste em o disco 3 e o disco 4 na Figura 2A (III), (IV).
- Para construir a parte inferior do suporte, insira o parafuso em cada três SH de cada disco 1 e 2. Encurtar os parafusos por beliscar fora de uma parte da porção de discussão. Manter o comprimento de parafuso em 0,9 cm (o mesmo comprimento que a parte inferior do suporte).
- Para construir a parte superior do suporte, inserir os parafusos para os dois SH de cada disco 3 e 4. Encurtar os parafusos beliscando fora de uma parte da porção de rosca. Manter o comprimento de parafuso com 0,7 cm (o mesmo comprimento que a parte superior do suporte).
- Para montar o suporte, se juntar as partes inferior e superior do suporte utilizando um parafuso comprido.
Nota: Mantenha o comprimento da cada parte do titular exata: a parte inferior é de 0,9 cm; a parte superior é de 0,7 cm (Figura 2B).
- Fabricação dos capilares de vidro
- Usar dois tipos de capilares de vidro com um capilar de vidro interior (diâmetro externo (OD) / diâmetro interno (ID): 1,0 / 0,6 mm) e um capilar de vidro exterior (OD / ID: 2,0 / 1,12 milímetros).
- Use um cortador de vidro para dividir o capilar de vidro exterior em três partes iguais, e depois usar o cortador de vidro para dividir o capilar de vidro interna em duas partes iguais.
- Afiar cada um dividido capilares de vidro interior e exterior, utilizando um extractor de capilar de vidro (Figura 3A). Defina o peso do extrator no máximo. Defina o nível de calor do extrator a 60 graus para o capilar de vidro exterior e 70 graus para o capilar interior. Cuidadosamente aguçar o capilar de vidro.
- Manter o comprimento da ponta no interior da parte de constrição do tubo capilar de vidro: o capilar interna é 1,5-1,8 cm; o capilar externa é 0,8-1,0 cm (Figura 3C). Se este comprimento é mais curto ou mais longo do que o comprimento descritos, por favor, ajustar o nível de calor do puxador.
- FIX os capilares de vidro interior ou exterior para o microforge suporte utilizando fita (Figura 3B).
- Cortar a ponta do capilar em vidro usando o microforge em três etapas (Figura 3B): (i) toque na ponta do capilar de vidro para as pérolas de vidro sobre um fio de platina, (ii) aquecer o fio de platina por pisar um pé alternar para 1-2 segundos, e (iii) após 1-2 seg, cortou a ponta do capilar em vidro pelo arrefecimento do fio de platina.
- Ajustar o diâmetro do interior (d i) e exterior (d o) orifícios capilares, respectivamente. O diâmetro do orifício do capilar de vidro interior é de 5, 10, e 20 um (d i = 5,10, 20 mm) e o exterior capilar de vidro (d o) é de 60 um (d o = 60 uM) nesta experiência.
Nota: O capilar de vidro, é descartável. Repetir a fabricação do vidro capilars.
- Ajustar o diâmetro do interior (d i) e exterior (d o) orifícios capilares, respectivamente. O diâmetro do orifício do capilar de vidro interior é de 5, 10, e 20 um (d i = 5,10, 20 mm) e o exterior capilar de vidro (d o) é de 60 um (d o = 60 uM) nesta experiência.
2. Procedimento para microgotas Geração W / S
- Preencher um capilar de vidro exterior com surfactante óleo contendo. A mistura de óleo e agente tensioactivo é hexadecano contendo 2% (w / w) monooleato de sorbitano nesta experiência (Figura 4A).
Nota: Não há muitas combinações de óleos e agentes tensioactivos (por exemplo, os óleos podem ser fluorado ou carbonatada; surfactantes pode ser iónico, não iónico, ou produto químico fluorado).- Introduzir 10 ml de hexadecano contendo mono-oleato de sorbitano em um capilar de vidro exterior. Na Figura 4A, o diâmetro do orifício do capilar de vidro exterior (d o) é de 60 um (d o = 60 uM). Para ajustar o orifício do capilar de vidro, voltar a passos 1.2.4-1.2.5.
- Definir o capilar exterior na parte inferior do suporte (Figura 4B).
- DraW cerca de 0,1 ul de uma solução aquosa para um capilar de vidro interior (Figura 4C), por acção capilar. Na Figura 4C, o diâmetro do orifício do capilar de vidro interno (d i) é de 10 um (d i = 10 uM). Para ajustar o orifício do capilar de vidro, de regresso aos passos 1.2.4-1.2.5.
- Jogo do capilar interno na parte superior do suporte (Figura 4D-a). Inserir o capilar interno para dentro do capilar exterior (Figura 4D-a). Olhando para o círculo branco de ponto, como na Figura 4D-um, observar a posição do capilar interno no interior do capilar exterior (diâmetro interno do tubo capilar externo (w) = 130 um) (Figura 4D-b, c) usando um microscópio digital . A posição do capilar interno no capilar exterior deve ser definido para W = 100-150? M.
Nota: Para alterar a posição do interiorcapilar capilar no exterior, por favor rode o parafuso na parte superior do suporte. Desse modo, a distância W pode ser controlada com precisão. - Introduzir 100 ul de hexadecano contendo mono-oleato de sorbitano (2% w / w) na parte inferior de um microtubo de 1.5 ml de amostra. Instalar o suporte, com os capilares interior e exterior, na amostra microtubo (Figura 4E-A). Certifique-se de verificar o capilar externa para mantê-lo longe da interface ar-óleo (Figura 4E-b).
- Centrífuga microtubo amostra usando uma mesa-out do tipo de balanço mini-centrifugar a uma gravidade de 1.600 xg por 1-2 seg para gerar microgotas (Figura 4F). Realizar todos os experimentos em temperatura ambiente.
Nota: Use a-out do tipo oscilante centrífuga. Uma gotícula pode colidir com uma parede lateral do microtubo amostra e se desintegram quando um ângulo de tipo fixo centrífuga é usado. - Lentamente elaborar a W / O gotículas com uma pipeta, e, em seguida, colocá-los em um s de vidrolide.
- Capturar imagens de microgotículas gerado usando um microscópio digital (ampliação, 200X).
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Resultados
Neste estudo, são apresentados um método simples para a geração de microgotículas W / O de tamanho de células usando um dispositivo de microfluidos centrífuga à base de capilar (Figura 1). O dispositivo de microfluidos foi composto por um suporte de capilar (Figura 2B), dois capilares de vidro (capilares de vidro interior e exterior na Figura 3C), e um microtubo contendo um óleo incluindo surfactante. Nós injectado 0,1 mL de solução de a...
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Discussão
Usando este dispositivo, o monodispersa W / O foram gerados por microgotículas planalto-Rayleigh instabilidade de um jacto de fluxo 17. O exame microscópico não revelou a presença de gotículas de satélite. Na fabricação do dispositivo, três passos críticos são essenciais para gerar sucesso microgotículas / O w monodispersas. Em primeiro lugar, a fornecer um fluxo linear de tensioactivo contendo óleo e uma solução aquosa, os furos capilares de quatro discos devem ser dispostas num padrão concêntrico. Em segund...
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Divulgações
Nenhum conflito de interesse é declarado.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela área de pesquisa PRESTO "Design and Control of Cellular Functions" da Agência Japonesa de Ciência e Tecnologia (JST), uma Grant-in-Aid for Scientific Research of Innovative Areas "Molecular Robotics" (Projeto nº 24104002) do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT), Japão, Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (Projeto nº 24680033) e Pesquisa Científica (B) (Projeto nº 26280097) da Sociedade Japonesa de Robótica Molecular. o curso de Promoção da Ciência (JSPS) e o curso de Design Criativo para Biociência e Biotecnologia da Escola de Biociência e Biotecnologia da Tokyo Tech.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de plástico de poliacetal de 2 mm de espessura | Ferramenta | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japão) | 244-6432-08 |
| Fresadora | Roland DG Co., Ltd. (Japão) | MDX-40A | |
| Fresa de topo RSE230-0.5 * 2.5 | Ferramenta | NS Tool Co., Ltd. (Japão) | 01-00644-00501 |
| Parafusos M2 * 40 | Ferramenta | Jujo Química Sintética Labo. (Japão) | Nº 0001-024 |
| Ferramenta extratora de capillry de vidro | Narishige (Japão) | Ferramenta PC-10 | |
| Microforge | Narishige (Japão) | Ferramenta | |
| capilar de vidro interno | Narishige (Japão) | Ferramenta | |
| capilar de vidro externo | World Precision Instruments Inc. (EUA) | 1B200-6 | |
| Ferramenta de tubo de amostra de 1,5 ml | INA OPTIKA CO.,LTD (Japão) | ST-0150F | |
| Reagente Hexadecano | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japão) | 080-03685 | |
| Monoleato de sorbitano (Span 80) | Reagente | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japão) | Reagente do sistema S0060 |
| Milli Q | Merck Millipore Corporation (Alemanha) | ZRQSVP030 | |
| Ferramenta de mini-centrífuga do tipo oscilante | Hitech Co., Ltd. (Japão) | Ferramenta de microscópio digital ATT101 | |
| KEYENCE Corporation (Japão) | VHX-2001 |
Referências
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Reimpressões e permissões
