Artigo de método

Fluorescência tempo-lapso da completa

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DOI:

10.3791/53863

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28 de fevereiro de 2016

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1Department of Molecular Microbiology, John Innes Centre, Norwich Research Park, 2Department of Biology, Lund University

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Resumo

Streptomyces são caracterizados por um ciclo de vida complexo que tem sido experimentalmente desafiador para estudar por meios biológicos celulares. Aqui apresentamos um protocolo para realizar microscopia de lapso de tempo de fluorescência do ciclo de vida completo pelo cultivo de Streptomyces venezuelae em um dispositivo microfluídico.

Resumo

A imagem de células vivas de processos biológicos no nível de célula única tem sido fundamental para nossa compreensão atual da organização subcelular das células bacterianas. No entanto, a aplicação da microscopia de lapso de tempo para estudar os processos biológicos celulares que sustentam o desenvolvimento da bactéria filamentosa esporulante Streptomyces tem sido dificultada por dificuldades técnicas.

Aqui apresentamos um protocolo para superar essas limitações cultivando a nova espécie modelo, Streptomyces venezuelae, em um dispositivo microfluídico disponível comercialmente que é conectado a um microscópio de campo amplo de fluorescência invertida. Ao contrário da espécie modelo clássica, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae esporula em líquido, permitindo a aplicação de câmaras de crescimento microfluídico para cultivar e monitorar microscopicamente o desenvolvimento celular e a diferenciação de S. venezuelae por longos períodos de tempo. Além de monitorar as alterações morfológicas, a distribuição espaço-temporal das proteínas-alvo marcadas com fluorescência também pode ser visualizada por microscopia de lapso de tempo. Além disso, a plataforma microfluídica oferece a flexibilidade experimental para trocar o meio de cultura, que é usado no protocolo detalhado para estimular a esporulação de S. venezuelae na câmara microfluídica. Imagens de todo o ciclo de vida de S. venezuelae são adquiridas em intervalos específicos e processadas no software de código aberto Fiji para produzir filmes das séries temporais gravadas.

Introdução

Streptomycetes são bactérias que vivem no solo, que se caracterizam por um ciclo de desenvolvimento complexo envolvendo diferenciação morfológica a partir de, um micélio multicelular de remoção de nutrientes para dormentes, esporos unigenomic 1-3.

Sob condições favoráveis ​​de crescimento, um esporo Streptomyces típicos começa a germinar por extrusão de um ou dois tubos germinais (Figura 1). Estes tubos alongados por extensão ponta e crescer em uma rede de hifas ramificadas conhecido como o micélio vegetativo. crescimento polar e ramificação das hifas é dirigido pelo DivIVA proteína essencial. Esta proteína de filamento helicoidal é parte de um grande complexo citoplasmático chamado o polarisome, que é crucial para a inserção de material novo envelope celular na ponta que se estende 4-7. Durante o crescimento vegetativo, os filamentos tornam-se hifas compartimentada pela formação frequente de chamadas paredes transversais 8. A formação destas paredes transversais re quires FtsZ, a proteína do citoesqueleto afim da tubulina, que é essencial para a divisão celular na maioria das bactérias 9. Em Streptomyces, no entanto, estas paredes transversais vegetativas não conduzem à constrição e célula-célula de separação e, por conseguinte, a massa de micélio permanece como uma rede de compartimentos interligados sinciciais. Em resposta a limitação de nutrientes e de outros sinais que não são bem compreendidos, hifas aéreas especializado romper a partir do micélio vegetativo e crescer para o ar 3. A construção destas estruturas inicia a fase de desenvolvimento reprodutivo, durante o qual a longa hifas aéreas multi-genómico tornar-se dividida em dezenas de compartimentos prespore unigenomic de tamanho igual. Este evento divisão celular massiva é impulsionado pela constrição síncrono de múltiplos anéis FtsZ numa única esporogênico 2,10 hifas. diferenciação morfológica é completado pela liberação de dormentes, esporos, pigmentadas de paredes espessas.

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Figura 1:. O ciclo de vida de Streptomyces em meios sólidos Este é um modelo do ciclo de vida com base em estudos clássicos de S. coelicolor crescimento em placas de agar. O desenvolvimento celular de um esporo começa com a formação de um ou dois tubos germinais, que crescem por extensão ponta para formar uma rede de hifas ramificadas. crescimento polar e ramificação das hifas vegetativas é dirigido por DivIVA (vermelho). A formação de paredes transversais vegetativas requer FtsZ (verde). Em resposta às limitações de nutrientes e de outros sinais, hifas aéreas são erguidas. Prisão de crescimento aéreo está estreitamente coordenada com a montagem de uma escada de FtsZ-rings, que dão origem aos septos esporulação que compartimentalizar as hifas esporogênico em compartimentos prespore box-like. Estes compartimentos montar uma parede de esporos de espessura e, eventualmente, são RELEAsed esporos pigmentados como maduros.

Os eventos de desenvolvimento chave do ciclo de vida de Streptomyces estão bem caracterizados 1,3. No entanto, o que ainda é escasso são estudos com células biológicas que empregam microscopia de lapso de tempo de fluorescência para fornecer informações sobre os processos subcelulares que sustentam a diferenciação, como a dinâmica de localização de proteínas, o movimento dos cromossomas e divisão celular developmentally controlada. Processamento de imagem de células vivas do desenvolvimento Streptomyces tem sido um desafio devido à complexidade do ciclo de vida e as características fisiológicas do organismo. Estudos anteriores sobre o crescimento vegetativo e as fases iniciais da formação de septos esporulação empregaram câmaras de imagem permeável ao oxigénio, ou o crescimento de agarose-suportado de Streptomyces coelicolor num palco de microscópio 11-15. Estes métodos, no entanto, está limitado por um número de factores. Alguns sistemas só permitem imagiologia de curto prazo de um crescimento celulard proteínas fluorescentes antes que as células sofrem de fornecimento de oxigénio insuficiente ou crescer para fora do plano focal devido ao padrão tridimensional de desenvolvimento de hifas. Nos casos em imagiologia de longo prazo é possível, as células sobre os limites de almofadas de agarose flexibilidade experimental cultivo porque as células não podem ser expostos a condições de crescimento ou de stress alternativos, e a fluorescência de fundo do meio nas almofadas de agarose limita severamente a capacidade de monitorar fluorescente fraco sinais.

Aqui nós descrevemos um protocolo para a criação de imagens de células vivas do ciclo de vida completo Streptomyces com excelente precisão e sensibilidade. Ao cultivar Streptomyces num dispositivo de microfluidos ligado a um microscópio de fluorescência widefield (Figura 2), que agora são capazes de monitorizar a germinação, o crescimento vegetativo e a formação de septos esporulação ao longo de um período de tempo de até 30 horas. Isto é muito facilitada pela utilização dos novos Streptomyces organismo modelo venezuelae porque esporula a conclusão perto em cultura submersa e desse modo ultrapassa a limitação da espécie S. modelo clássico coelicolor, que esporula apenas em meios sólidos 16-20. Para ajudar a visualizar o crescimento vegetativo e esporulação, que co-expressam fluorescente etiquetado versões do DivIVA marcador polaridade celular ea proteína divisão celular chave FtsZ.

Nós estamos usando um dispositivo microfluídico disponível comercialmente que tem sido empregada com sucesso para micobactérias, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis e fermento 21-25. O sistema retém as células num único plano focal e permite o controlo da perfusão contínua do meio de cultura a partir de reservatórios diferentes. No protocolo detalhado que aproveitar este recurso para expor S. venezuelae micélio vegetativo de uma redução de marcha nutricional para promover a esporulação.

O protocolo decrito é para geração de imagens ao vivo de células de todo o ciclo de vida Streptomyces, mas as condições mídia alternativa ou configurações de microscópio pode ser escolhido se estágios de desenvolvimento específicas são de particular interesse.

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Figura 2: Esquema representando o fluxo de trabalho experimental. Os três passos principais descritos no protocolo são mostrados. Em primeiro lugar, os esporos e o meio gasto são preparados a partir de uma cultura de fase estacionária. Em segundo lugar, os esporos frescos são carregados para um sistema de microfluidos e S. venezuelae é trabalhada por todo o seu ciclo de vida de desenvolvimento usando um microscópio invertido completamente automatizado, com uma câmara de incubação para manter uma temperatura óptima de crescimento. Em terceiro lugar, a série de lapso de tempo obtidos são analisados ​​e processados ​​usando o software de código aberto Fiji.

Protocolo

1. Isolamento de fresco S. venezuelae Esporos e Preparação de Gasto Meio de Cultura

  1. Inocular 30 ml de maltose-Yeast Extract Extracto de Malte (PJM) médio, suplementado com 60 ul R2 solução oligoelemento (TE), com 10 esporos ul de tensão SV60 [attB φ BT1 :: pSS209 (P divIVA - divIVA-mCherry P FtsZ -ftsZ-ypet)]. Para o crescimento consistente e esporulação das células, utilizar um balão ou um balão confuso que contém uma mola para permitir arejamento suficiente.
  2. Células de cultura de 35-40 h a 30 ° C e 250 rpm.
  3. Examine as células por microscopia de contraste de fase líquida montado. Neste ponto fragmentos de micélio e esporos será visível.
  4. Centrifugar 1 ml de células numa centrífuga de mesa a 400 xg durante 1 min para sedimentar o micélio e os fragmentos de células maiores.
  5. Transferir aproximadamente 300 ul co sobrenadantentaining uma suspensão de esporos para um novo tubo de 1,5 ml e manter em gelo. Manter o meio de cultura restante para o passo 1.7.
  6. Diluir esporos 1:20 em MYM-TE (concentração final: 0,5-5 x 10 7 esporos / ml) e manter em gelo até ser necessário (veja o passo 2.3).
    Nota: Embora as condições exatas que desencadeiam esporulação em Streptomyces não são compreendidos, utilizando meio MYM-TE gasto, incluindo quaisquer sinais extracelulares desconhecidos de uma cultura esporulação, estimula a esporulação.
  7. Filtro-esterilizar 10 ml do meio de cultura restante para obter passou MYM-TE que é livre de esporos e fragmentos de micélio. Usar um filtro de seringa estéril de 0,22 um e transferência gasto PJM-TE para um tubo estéril de 15 ml.
  8. Mantenha o preparado passou MYM-TE por alguns dias a 4 ° C, se experimentos adicionais usando condições de crescimento semelhantes devem ser conduzidos.

2. Preparação do Dispositivo de microfluidos

Nota: Cada pla microfluídicote permite até quatro experiências independentes para ser realizado. Para evitar a contaminação das câmaras de fluxo não utilizados, usar soluções estéreis e condições de trabalho quando a criação de um experimento.

  1. Remoção da solução de transporte a partir da placa de microfluidos e lavar os poços com estéril MYM-TE.
  2. Adicionar 300 ul MYM-TE para a entrada do poço 1 e 300 ul passou MYM-TE para poços de 2 a 6.
  3. Carregar 40 ul diluída esporos do passo 1.6 em células de carga 8 da pista assim "A" e selar o colector para a placa de acordo com instruções do fabricante.
  4. Inicie o software de controle de microfluídica, selecione o tipo de placa apropriado e estabelecer um programa de fluxo para preparar o canal de fluxo e câmara de cultura por meio de fluxo de poços de entrada de 1 a 5 a 6 psi por 2 min por poço.
  5. No software de controlo microfluidos, criar um protocolo de fluxo para a experiência: fluir PJM-TE da entrada de um bem durante 6 horas para permitir a germinação e o crescimento vegetativo das células. Interruptorem seguida, a perfusão de gasto PJM-TE da cavidade 2 a 5, para o restante tempo da experiência. Durante o decurso da experiência manter o fluxo constante a pressão a 6 psi (correspondendo a cerca de 9 ul de meio / h). Iniciar o fluxo de programa depois do passo 3.5.

3. Set Up do microscópio e do Protocolo de Time-lapse

Nota: Este método foi implementado em um microscópio invertido widefield totalmente motorizada e automatizado equipado com uma câmera scmos, uma lâmpada de metal-halogeneto, um autofocus hardware, um suporte de palco para placas de 96 poços e uma câmara ambiental.

  1. Pré-aquecer a câmara ambiental a 30 ° C em avanço, a fim de evitar problemas com a focagem automática, depois de começar a experiência. O tempo necessário depende da câmara ambiental utilizado, o microscópio e o sistema de aquecimento. Começam a aquecer o sistema na noite antes do experimento.
  2. Ligue o microscópio e automação de microscopia e controle softwaré. Use uma alta abertura numérica (NA) objectiva de imersão em óleo para a coleta de sinal ótima e resolução espacial, como um 100X, 1,46 NA óleo objectivo DIC. Escolha filtros adequados e espelhos dicromáticos para adquirir imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) e imagens de fusões de proteínas amarelo-fluorescente e vermelho fluorescentes.
  3. Coloque uma gota de óleo de imersão para o objectivo e adicionar fluido de imersão até ao fundo da janela de imagem na placa de microfluidos para melhorar-foco celular durante a aquisição de imagem. Cuidadosamente montar o dispositivo de microfluidos selado (passo 2.5) sobre a fase de microscópio invertido. Certifique-se de que a placa está firmemente colocado no suporte de fase e não mudar ao longo do curso do experimento.
  4. Traga a janela de imagem da câmara de cultura microfluídico em foco usando os marcadores de posição embarcados para orientação. Concentre-se para a parte mais à esquerda da primeira câmara de escoamento (identificadas como "A") com o tamanho armadilha 5, correspondendo auma altura armadilha de 0,7 um.
  5. No software microfluidos, células de carga entre a entrada bem 8 a 4 psi durante 15 seg. Verifique a densidade de células na câmara de cultura movendo o palco ao longo da janela de imagem. Se não há esporos foram presos, repetir o passo de carregamento de células ou, alternativamente, aumentar a pressão de carga e / ou o tempo até que a densidade celular desejada é atingida (1-10 esporos por janela de imagem com 2.048 x 2048 pixels). Evite sobrecarregar a câmara de cultura.
    Nota: Nós normalmente usamos tamanho armadilha 5 para imagiologia Streptomyces, mas nós também obtiveram bons resultados com a armadilha dos tamanhos 4 e 3. Consulte o manual do fornecedor para obter outras sugestões sobre como otimizar o processo de carregamento celular.
  6. Inicie o programa de fluxo no software de controlo a partir do passo 2.5 e permitir que a placa de microfluidos para aquecer-se equilibrar durante 1 hora na platina do microscópio antes de iniciar a aquisição de imagem.
  7. No software de controle de microscópio, configurar uma aquisição multi-dimensional para tomar multiple imagens em várias posições de fase ao longo do tempo:
    1. Para Autosave: Diretório especificar para a gravação automática dos arquivos de imagem.
    2. Para as configurações de iluminação, determinar as configurações de iluminação ideal para cada construção específica com antecedência. Para o experimento delineado, utilize os seguintes tempos de exposição: DIC 150 ms, YFP 250 ms, RFP 100 ms.
    3. Para o período de-série: configurar uma série de tempo para adquirir imagens nos pontos de tempo desejado em sequência. Para imagiologia do ciclo de vida de S. venezuelae, selecione um intervalo de tempo de 40 minutos ao longo de um período de 24 horas.
    4. Para os cargos de palco e autofocus: digitalizar a câmara de cultura, movendo as posições de palco e palco loja para cada posição de imagem de interesse. Certifique-se de que as posições de estágio único estão localizados suficientemente distante para minimizar a fotodegradação e phototoxicity.Typically usar até 12 posições. Executar rotina autofocus para cada ponto de tempo para corrigir o desvio focal lento. Se estiver disponível no software de controle de microscópio, A estratégia de foco automático definido como "atualização superfície local, autofocus hardware". Uma vez que os Z-coordenadas das posições estágio selecionados são verificados, ativar o autofocus hardware.
  8. Iniciar o experimento de lapso de tempo no software de controle de microscópio.
  9. Verifique se todas as posições de palco ainda estão em foco em pontos posteriores. Para experiências de lapso de tempo que funcionam ao longo de várias horas, ocasionalmente observar um desvio palco mesmo quando utilizando a focagem automática. Se as posições de estágio necessário recentrar, interromper a experiência a um ponto de tempo apropriado, ajustar o foco e reiniciar o experimento dentro do intervalo de tempo de imagem definido (passo 3.7.3). Veja o passo 4.3 para saber como concatenar a série temporal.
  10. Pare a aquisição de imagem depois de 24-30 horas, ou quando as hifas na região de interesse foram diferenciadas em esporos (ver série de imagens DIC). Pare de programa de fluxo no software e desmontar o dispositivo microfluídico.
  11. Prepare placa microfluídico utilizado para sto de curto prazoraiva. Remover restante MYM-TE e passou MYM-TE do poço 1 a 6, resíduos poço vazio 7 e carregamento de células bem 8. Em condições estéreis, re-fill poços de pista "A" e poços de pistas não utilizados ( "B", utilizado para "D") na placa com estéril salina tamponada com fosfato (PBS). Selar a placa com parafilme para evitar que ela seque e armazenar a 4 ° C.

4. Geração de Time-lapse Filmes Usando Fiji Software

Nota: Observamos que diferentes pacotes de software comercial e livre estão disponíveis para processar imagens de microscopia de lapso de tempo, incluindo ZenBlue, Metamorph, gelado, ImagePro ou ImageJ. Aqui vamos nos concentrar em Fiji, que é um programa de processamento de imagem de código aberto baseado em ImageJ, e que já oferece uma série de plugins pré-instalados úteis.

  1. dados de imagem de transferência de sua experiência de lapso de tempo a um computador que tenha instalado Fiji.
  2. Lançamento do programa e importar o arquivo de imagem usando o &# 34; File> Import> Bio-Formatos ". Ou simplesmente arrastando o arquivo de imagem em Fiji no" bio-formatos opções de importação ", marque a caixa" canais de divisão "para obter uma pilha de imagem separada para cada canal de iluminação (DIC , RFP, YFP).
  3. Opcional: Para mesclar as séries cronológicas em separado resultante de uma ruptura na na aquisição de imagem devido à reorientação (passo 3.9), abra respectivas pilhas de imagens e executar "Imagem> Pilhas> Ferramentas> Concatenar" para cada canal (DIC, RFP, YFP ).
  4. Avaliar a qualidade dos dados de intervalo de tempo percorrendo as pilhas de imagens. Procure por hifas que ficou em foco ao longo do tempo, mostra o crescimento micelial e, eventualmente, formar esporos (DIC pilha). Examinar a localização subcelular esperado para DivIVA-mCherry nas pontas das hifas (pilha RFP) e FtsZ-YPet formando anéis simples ou múltiplas estruturas, escada-like em vegetativa ou hifas esporogênico (pilha YFP), respectivamente.
  5. Isolar uma região de interesse para reciclag jusanteng das imagens. microscopia de lapso de tempo, muitas vezes produz grandes arquivos que podem retardar o processamento de Fiji. Por conseguinte, recomenda-se a identificar e isolar uma região de interesse (ROI) e a realização de mais passos de processamento de imagem nesta versão mais pequena da pilha de imagem.
    1. Seleccionar a função "Selecção retangular" no menu e desenhar uma ROI rectangular na pilha de DIC, de tal maneira que as hifas em desenvolvimento são delimitados por o ROI ao longo da série de imagens.
    2. Duplicar ROI-stack com "Ctrl" + "Shift" + "D".
    3. Clique na barra de nome da pilha de YFP e selecione "Editar> Seleção> Restaurar seleção" no menu para restaurar a seleção retangular anterior do DIC originais pilha ao mesmo positon na pilha YFP e duplicar o ROI com "Ctrl" + "Shift" + "D".
    4. Repita esse processo para a pilha de RFP.
  6. Alinhar as imagens na imagem Três pilhas to remover desvios estágio no plano xy ao longo do tempo. Vá até o último quadro na pilha DIC e selecione "Plugin> Registro> StackReg> RigedBody" a partir do menu. Repita este passo para a RFP ea pilha de YFP. Se necessário, cortar o ROI repetindo o passo 4.5.1-4.5.3.
  7. Opcional: Ajustar o brilho eo contraste manualmente para cada pilha de imagens com o "Ajustar o brilho eo contraste da ferramenta" ( "Ctrl" + "Shift" + "C") ou selecione "Processo> Melhorar Contraste" do menu e aplicar o "Normalizar" comando para todas as imagens da pilha. Deve notar-se que o último comando irá alterar os valores de pixel e, portanto, pode afectar a jusante de análise de imagem.
  8. Opcional: Combine pilhas individuais (convertido para o formato de arquivo RGB, consulte 4.11) horizontalmente ou verticalmente usando o plugin "Imagem> Pilhas> Ferramentas> Combinar".
  9. Adicionar uma barra de escala ( "Analisar> Ferramentas> Barra de Escala") e um batedor de tempo (&# 34; Imagem> Pilhas> Tempo Stamper ").
  10. Salvar pilhas de imagens modificadas como uma sequência de imagens no formato "tiff". Para produzir um filme, salvar como ".avi". Alternativamente, série de imagens de exportação no formato QuickTime usando o "Bio-Formatos> Bio-Formatos Exportador" plug-in e selecione a opção ".mov" tipo de arquivo.
  11. Para obter imagens de quadros individuais, selecione o quadro de interesse e duplicar a imagem "Ctrl" + "Shift" + "D". Alterar o tipo de imagem, resultando em "RGB" ou "8-bit" em "Imagem> Tipo> a cor RGB ou 8-bit" e salvar a imagem como "tiff".
    Nota: Fiji oferece uma série de funções adicionais para anotar mais ou séries processo de lapso de tempo. Ir para suporte on-line Fiji para obter informações detalhadas (http://fiji.sc/Fiji).

Resultados

O processamento de imagem de células vivas bem sucedida de toda a S. ciclo de vida venezuelae produz uma série temporal contínua, incluindo os estágios de desenvolvimento chave de germinação, crescimento vegetativo e esporulação (Figura 3, Filme 1). A visualização da progressão através do ciclo de vida é ainda reforçada pela localização subcelular distinta de DivIVA-mCherry e FtsZ-YPet. Durante a germinação e crescimento vegetativo, DivIVA-mCherry acumula exclusivamente nas pontas das hifas crescem ou marcas recém-formando pontos de ramificação (Figura 4A). Estes resultados estão em linha com o posicionamento subcelular anteriormente relatados de DivIVA 12,26. Em contraste, FtsZ-YPet forma estruturas semelhantes a anéis individuais em intervalos irregulares no micélio crescente (Figura 4B). Estas estruturas proporcionam o andaime para a síntese de não-constritiva paredes transversais vegetativas, levando à formação de interconncompartimentos de hifas ete 8. A diferenciação celular de crescer hifas em hifas esporogênico se torna visível pelo desaparecimento da polar focos DivIVA-mCherry, a prisão de crescimento polar eo aumento concomitante de FtsZ-YPet de fluorescência (Figura 4C). Em esporulação hifas, o padrão de localização de FtsZ-YPet muda drasticamente; primeiros helicoidais filamentos FtsZ-YPet cair ao longo da hifa e, em seguida, em um evento súbito, quase síncrono, estas hélices se aglutinam em uma escada de anéis de FtsZ-YPet regularmente espaçados. Sob as condições experimentais descritas aqui, essas escadas FtsZ-YPet uniformemente distribuídos persistir durante aproximadamente 2 h. Finalmente, esporulação septos se tornar perceptível nas imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) (Figura 4D) e, eventualmente, novos esporos são liberados.

O protocolo subsequente que descreve o processamento de imagem usando o software Fiji prevê o TEP-a-passo de como produzir um filme para a publicação da série de lapso de tempo adquirida (Filme 1).

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Figura 3: Fotografias instantâneas de uma série de microscopia de fluorescência representante de lapso de tempo de S. venezuelae produzir fluorescente etiquetado FtsZ (verde) e DivIVA (vermelho) São mostrados os quadros selecionados de imagens fundidas (painel superior: RFP-YFP-DIC, painel inferior: DIC). visualizar o ciclo de vida Streptomyces incluindo germinação, crescimento vegetativo e esporulação. Imagens foram tiradas de Filme 1. O tempo é na hr: min. Barras de escala = 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Os resultados representativos para uma bem sucedida série de lapso de tempo do ciclo de vida Streptomyces (A) Localização dos DivIVA-mCherry.. Mostrado são instantâneos da dois pontos de tempo subsequentes do Filme 1 com imagens fundidas da SDP e canais DIC. DivIVA-mCherry marca novos sites de hifas Branch (cabeça da seta cheia) e localiza na ponta de hifas para direcionar o crescimento polar (ponta de seta aberta). Barra de escala = 10 mm (B) FtsZ-YPet localização durante o crescimento vegetativo (cabeça de seta). FtsZ-YPet forma estruturas semelhantes a anéis individuais (painel superior) que não se contraem (DIC, painel inferior). (C) FtsZ-YPet (verde) de localização durante a septação esporulação. focos DivIVA-mCherry são mostrados em vermelho, com o tempo decorrido representado abaixo (hr: min). Barra de escala: 5 um. (D) correspondente imagens DIC das hifas esporulados a partir de (C) que mostra a formação de compartimentos prespore com septos esporulação visível (imagem da esquerda), que eventualmente amadurecer em uma cadeia de esporos (imagem à direita). O tempo é na hr: min. Scale bar = 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Filme 1: Time-lapse série microscopia de fluorescência dos Streptomyces venezuelae ciclo de vida O filme consiste de imagens RFP-YFP mescladas (esquerda) e as imagens correspondentes contraste de interferência diferencial (DIC) (à direita).. DivIVA-mCherry é mostrado em vermelho e FtsZ-YPet em verde. O intervalo de tempo entre quadros individuais é de 40 min. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver this filme.

Discussão

Microscopia de lapso de tempo do ciclo de vida Streptomyces tem sido tecnicamente desafiador no passado. Aqui apresenta-se um protocolo robusto para realizar processamento de imagem de células vivas do ciclo de vida completo utilizando fusões de proteínas fluorescentes para o marcador DivIVA polaridade celular e a divisão celular proteína FtsZ para ajudar a visualizar e detectar a progressão através do programa de desenvolvimento (Figura 2).

Central ao presente método é a cultura de S. venezuelae em um dispositivo micro que permite perfusão média constante e a troca de meio de crescimento normal (MYM-TE) com meio gasto (gasto MYM-TE). A mudança de condição de cultura é importante para o protocolo descrito porque o downshift nutricional como poços como quaisquer sinais extracelulares ainda não identificados (por exemplo, detecção do quórum sinais) no meio de cultura gasto, promover a esporulação, ao passo que um fornecimento contínuo de meio rico em nutrientes estimula growt vegetativoh, com quase nenhuma formação de esporos (dados não mostrados). Assim, a cultura de células neste sistema microfluídico é superior para a cultura de células em agarose, pois oferece uma maior flexibilidade e experimental permite a monitorização de longo prazo de alterações de crescimento bacteriano em resposta à mudança das condições de cultura. Embora as placas microfluídicos são projetados para uso único, o fluxo canais que não foram inoculados com células podem ser utilizados em experiências posteriores. Recomendamos a utilização de todos os canais de uma placa de microfluidos dentro de uma semana, como temos experimentado problemas de vedação do colector de placas que foram abertas por mais tempo.

Quando da criação de uma experiência, verificou-se que os esporos preparados de fresco germinado dentro de duas horas de serem carregados para dentro da câmara de fluxo, enquanto que os esporos derivados de um estoque de glicerol congelado necessária, pelo menos, 6 horas antes de tubos germinais, emergiu (dados não mostrados). Este atraso na germinação prolonga a duração da experiência e podem interferir coma disponibilidade do equipamento e das condições experimentais. É também importante para iniciar a experiência com a perfusão de PJM-TE para, pelo menos, três horas para proporcionar nutrientes suficientes para o desenvolvimento e crescimento de tubos germinativos. Perfusão com MYM-TE pode ser estendido para além do 3 hr inicial se o experimento é projetado para estudar o crescimento vegetativo. Enquanto esporos proporcionar a escolha de material de partida preferido, os fragmentos de hifas curta também pode ser carregado para a placa de microfluidos. No entanto, a eficiência de carga quando se utiliza micélio cortado é significativamente menor e muitas vezes requer várias corridas de carga que pode ser uma limitação ao examinar mutantes não-esporulantes. Independentemente do tipo de inóculo utilizado, é importante não sobrecarregar a câmara de cultura com esporos ou fragmentos de hifas como isso vai levar a superlotação rápida, que pode interferir com a difusão da mídia e complicar a análise de imagem.

É importante planejar a construção de proteínas repórter carefully para uso na fluorescência de imagem time-lapse em Streptomyces. comprimento do ligante entre a proteína alvo e o repórter fluorescente e a escolha de N- ou fusões de terminal C pode ser crítica. Além disso, as condições experimentais ótimas, incluindo a frequência de imagem e tempo de exposição, precisa ser determinado antecipadamente para cada proteína fluorescente-marcadas. S. venezuelae hifas exibem auto-fluorescência no canal verde / amarelo, que pode tornar-se problemática quando imagiologia de uma proteína marcada com fluorescência que é expressa em níveis baixos. Além disso, deve notar-se que, durante a germinação e a fase de crescimento vegetativo inicial, S. venezuelae é particularmente sensível à luz de curto comprimento de onda (por exemplo, quando se utiliza proteínas de fusão para PCP).

Apesar dos contínuos avanços nas técnicas de imagem e sistemas repórter fluorescentes para imagens ao vivo de células de bactérias, a maioria dos pacotes de software (por exemplo MicrobeTracker, Schnitzelcells, CellProfiler) para o processamento automatizado subsequente destes tipos de conjuntos de dados não suportam a análise de imagens derivadas de bactérias filamentosas com um estilo de vida multicelular 27-29. Assim, existe uma necessidade de desenvolver um algoritmo adequado para a análise de alto rendimento quantitativo de dados de imagem a partir de Streptomyces e outras bactérias filamentosas.

Em resumo, o trabalho aqui descrito demonstra o imenso potencial de S. venezuelae como um novo sistema de desenvolvimento modelo para o género, devido à sua capacidade de esporulação em líquido. O dispositivo microfluídico cultura é simples de usar, mesmo para usuários inexperientes. Ele fornece uma excelente plataforma para estudar processos biológicos celulares centrais para o ciclo de vida Streptomyces, incluindo localização dinâmica de proteína, o crescimento polarizado, ea diferenciação morfológica de um micélio multicelular em cadeias de esporos unigenomic. Além disso, este conjunto experimental up também fornece um ponto de partida atraente para investigar acontecimentos do desenvolvimento que requerem alternadas condições de cultura, ou a utilização de corantes fluorescentes, tais como D-aminoácidos fluorescentes para monitorizar a síntese do peptidoglicano ou iodeto de propídio e 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) organização de visualizar cromossoma 30,31.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Grant Calder pela assistência técnica com o microscópio, Matt Bush pelos comentários sobre o protocolo e ao John Innes Center pela compra do microscópio de campo amplo Zeiss. Este trabalho foi financiado pela bolsa BBSRC BB / I002197 / 1 (para MJB), pela bolsa do Programa Estratégico do Instituto BBSRC BB / J004561 / 1 para o John Innes Centre, pela bolsa do Conselho de Pesquisa Sueco 621-2010-4463 (para KF) e por uma bolsa de pós-doutorado Leopoldina (para SS).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
B04A Placa CellAsic ONIX para células bacterianasMerck-MilliporeB04A-03-5PKPlacas de cultura microfluídica
CellAsic ONIX Sistema de Perfusão Microfluídica e ONIX FG (versão 5.0.2)Merck-MilliporeEV-262A versão mais recente do ONIX (julho de 2015) e as instruções sobre como usar o programa podem ser encontradas aqui: http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 MicroscópioZeiss431007-9902-000Microscópio de campo amplo invertido totalmente automatizado e motorizado
Incubadora XL multi S1 com Módulo de Temperatura S1 e Unidade de aquecimento XL S2Zeiss411857-9061-000Câmara ambiental ao redor do microscópio
Plan-Apochromat 100x/1.46 Óleo DIC objetivoZeiss420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2Hamamatsu Photonics K.K.C11440-22CU
Iluminador HXP 120VZeiss423013-9010-000
FL Conjunto de filtros 46 HE YFP sem deslocamentoZeiss489046-9901-000Conjunto de filtros fluorescentes, excitação 500/25 nm, emissão 535/30 nm
Conjunto de filtros FL 63 HE RFP sem deslocamentoZeiss489063-0000-000Conjunto de filtros fluorescentes, excitação 572/25 nm, emissão 629/30 nm
Estrutura de montagem K-M para multipoços placasZeiss000000-1272-644Suporte de platina para placa microfluídica
ZEN pro 2012Zeiss410135-1002-120Software de controle de microscópio
Módulo ZEN Time LapseZeiss410136-1031-110Módulo de software para configurar experimentos de microscopia de lapso de tempo
Módulo ZEN Ladrilhos/PosiçõesZeiss410136-1025-110Módulo de software para salvar posições específicas de palco (xzy)
Pacote de software de código abertoFijihttp://fiji.sc/FijiGeração de filmes de lapso de tempo
Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM)
4 g de Maltose
4 g de extrato de levedura
10 g de extrato de malte
adicionar 1 L de H2O usando 50% de água da torneira e 50% de água de osmose reversa e suplementar com 200 ml de solução de oligoelementos R2 por 100 ml após autoclavagem		Meio de esporulação usado para cultura S. venezuelae SV60
R2 Solução de oligoelementos (TE)
8 mg ZnCl2
40 mg FeCl3-6H2O
2 mg CuCl2-2H2O
2 mg MnCl2-4H2O
2 mg Na2B4O7-10H2O
2 mg ( NH4)6Mo7O24-4H2O
adicionar 200 ml de autoclave H2O
e armazenar a 4 oC		Adicionar 0,002 volumes a MYM
PBS (solução salina tamponada com fosfato)SigmaP4417-100TABUsado para reabastecer poços de entrada de pistas não utilizadas em placas B04A para preparar a placa para armazenamento de curto prazo.
0,22 µ Filtros de seringaSatorius stedim16532-KPreparação da
SV60John Innes CentreS. venezuelae expressando cepas divIVA-mcherry e ftsZ-ypet
coleção de cepas MYM-TE gasta

Referências

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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device
Posted by JoVE Editors on 7/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

The author's name was updated from:

Mark Buttner

to:

Mark J. Buttner

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