A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-eletroporação

Resumo

O órgão auditivo medeia a audição. Aqui apresentamos um método de micro-eletroporação in ovo modificado otimizado para estudar a proliferação e diferenciação de células progenitoras auditivas no órgão auditivo de galinhas em desenvolvimento.

Resumo

Embriões de galinha são sistemas modelo ideal para estudar o desenvolvimento embrionário como manipulações da função do gene pode ser realizada com relativa facilidade in ovo. O ouvido interno órgão sensorial auditivo é fundamental para a nossa capacidade de ouvir. Ele abriga um epitélio altamente especializada sensorial que consiste em células ciliadas de transdução mecano (HCs) e envolvente glial-como células de suporte (SCS). Apesar das diferenças estruturais nos órgãos auditivos, os mecanismos moleculares que regulam o desenvolvimento do órgão auditivo são evolutivamente conservada entre mamíferos e aves Em electroporação in ovo é largamente limitado a fases precoces em E1 -. E3. Devido ao desenvolvimento tardio relativa do órgão auditivo na E5, manipulações do órgão auditivo por em eletroporação in ovo passado E3 são difíceis devido ao desenvolvimento avançado do embrião de galinha em fases posteriores. O método aqui apresentado é um método de transferência de genes transitória para alvejar genes de interesse noestágio E4 - E4.5 no frango auditivo órgão sensorial desenvolvimento via in ovo micro-eletroporação. Este método é aplicável para gain- e perda de funções com vectores de expressão baseados em DNA de plasmídeo convencional e pode ser combinada com a proliferação celular num ensaio in ovo adicionando EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) para todo o embrião no tempo de electroporação. O uso da proteína fluorescente verde ou vermelho (GFP ou RFP) plasmídeos de expressão permite que o experimentador para determinar rapidamente se a eletroporação alvo com sucesso a porção auditiva do ouvido interno em desenvolvimento. Neste trabalho método, exemplos representativos dos espécimes GFP electroporadas são ilustrados; embriões foram recolhidas 18-96 horas após a electroporação e a segmentação de GFP à região pró-sensitivo do órgão auditivo foi confirmada por RNA de hibridação in situ. O papel método também proporciona um protocolo optimizado para a utilização da timidina EdU analógico para analisar célula prolifração; um exemplo de um ensaio de proliferação celular baseado EdU que combina imuno-marcação e clique EdU química é fornecida.

Introdução

Apesar das diferenças na morfologia e padronização celular entre os mamíferos e órgão sensorial auditiva aviária, os fatores moleculares e vias responsáveis ​​pelo desenvolvimento HC sensorial são pensados ​​para ser evolutivamente conservada ^1-3. A papila basilar, que abriga os HCs auditivas e suas SCs circundantes, se desenvolve como um outpocketing do otocyst ouvido interno. Logo no início de uma piscina de progenitores HC e SC é especificado dentro do plac�io ótica ótica domínio / copo neural-sensorial competente (NSD). Dados destino de mapeamento de fornecer evidências de que linhagens neuronais e sensoriais são ligados e surgem da NSD localizada na região antero-ventral do copo ótica ou otocyst em ratos e galinhas ^4,5. Em primeiro lugar, neuroblasts delaminate da NSD para dar origem aos neurônios do gânglio auditivo-vestibular, o que acabou dividida em gânglios auditivo e vestibular. Esses neurônios inervam os HCs sensoriais do ouvido interno e núcleos no tronco cerebral. As células Them permanecer no NSD são pensados ​​para dar origem a várias manchas sensoriais, incluindo o órgão auditivo sensorial, que consiste em os HCs sensoriais de transdução mecano e seus SCs associados.

Em ambos os pintos e murino, órgão auditivo progenitor sensorial saída do ciclo celular e diferenciação HC ocorrer em gradientes opostos. Em pintinho, progenitor auditiva saída do ciclo celular começa em torno de ~ E5 e progride a partir da base para o ápice, e do centro para a periferia ^6. Um dia mais tarde, começa HC diferenciação no vértice e progride para a base ^7. Estudando o desenvolvimento do ouvido interno em frango proporciona muitas vantagens técnicas como mecanismos funcionais podem ser investigadas com relativa facilidade in ovo em oposição a manipulação de embriões no útero, em outros sistemas de modelos, que requer cirurgias complexas. O método descrito aqui utiliza in ovo micro-electroporação de genes alvo de interesse no Basila presuntivoárea de papila r ântero-ventral na vesícula ótica especificamente a E4.

A electroporação in ovo é uma técnica que está bem estabelecida e utilizada ^8-14. O princípio da técnica de electroporação, é baseado no facto de nucleótidos (por exemplo, ADN de plasmídeo, DNA sintético, RNA ou oligonucleótidos) são carregadas negativamente. O ADN é injectada no tecido de interesse. Quando uma corrente eléctrica é colocada ao longo do tecido, a actual abre poros transientes nas paredes das células e permite a captação do ADN, como flui do ADN carregado negativamente em direcção ao eléctrodo positivo (ânodo). Para as experiências de ganho-de-função, os genes de interesse são subclonados em vulgarmente plasmídeos de expressão que contêm cassetes de expressão adequados para a proteína verde fluorescente (GFP) ou a proteína fluorescente vermelha (RFP). Para as experiências de construções de perda de função com base em plasmídeos dominantes negativos repressores, ou RNAi, ou construções morfolino são commonly usado ^15,16. Para inibir microARN (miARN) função miARNs construções de esponja, que são tipicamente plasmídeo com base, pode ser usado ^17. O método aqui descrito permite investigar os mecanismos moleculares que controlam a proliferação e diferenciação no órgão auditivo, em que o método de micro-electroporação in ovo pode ser facilmente combinado com no ensaio de proliferação celular in ovo adicionando EdU a todo o embrião.

A electroporação e a adição de EdU é realizada em E4 na vesícula ótica, que é um dia antes do início da saída do ciclo celular no órgão auditivo. Análise do órgão auditivo é tipicamente realizada 18-96 horas após a electroporação em E5 (aparecimento de células progenitoras saída sensorial do ciclo celular), E6 (início da diferenciação HC), e E7 (durante a diferenciação HC); e mais tarde até ~ E9 (fim da diferenciação HC). Este método de electroporação de transferência de genes é transitória que dura aproximadamente 4 dias ~, because os genes de interesse não se integram no genoma, mas o método é aplicável para utilização com vectores de expressão à base de ADN de plasmídeo apropriado, que têm a capacidade de integrar no genoma, tal como a transferência de genes mediada ^Tol2-11. Com este método GFP robustos ou expressão RFP dura ~ 4 dias na cóclea, após o que apontam os sinais desaparecem, mas fornecem uma janela de tempo suficiente para estudar o desenvolvimento intrincado do órgão auditivo. Este, por método de transferência de genes in ovo é novo e permite que visar especificamente o órgão auditivo presuntivo em E4, que é ideal para as investigações que incidem sobre o desenvolvimento HC no órgão auditivo. É um bom complemento para métodos alternativos, que electroporate em muito mais jovens estágios de desenvolvimento ^11,12 ou em comparação com o uso de in vitro papilas basilar de explantes culturas ^18.

Protocolo

Os ovos e embriões não eclodidos são cuidadas e tratadas de forma ética e humana. Todos os protocolos de utilização de embriões unhatched foram aprovados pelo Animal Care e do Comitê Use na Johns Hopkins School of Medicine, em Baltimore, Maryland.

1. Os ovos e Preparação de construções de expressão

1. Ovos:
   1. Incubar 3-4 dúzia de ovos de galinha fertilizados (Gallus gallus) deitado em seus lados a 37 ° C.
      1. Após 24 horas de incubação, puxe 3 cc de albumina com uma seringa a partir da extremidade traseira rodada do ovo e selar o buraco com fita adesiva transparente. Isto cria uma câmara de ar entre o embrião e a casca do ovo, permitindo a facilidade de acesso para o embrião sem o embrião que adere ao invólucro de corte quando a janela de acesso no topo do ovo ^19.
      2. Em 117 horas de tempo de incubação, encenar os embriões de acordo com Hamburger e Hamilton ²⁰ estágios de desenvolvimentoa E4 (HH24-25) (ver figura 1D).
2. Expressão Constrói:
   1. Prepara-se o ADN do plasmídeo usando reagentes e o protocolo fornecido pelo fabricante do kit de uma preparação disponível comercialmente. No passo final da preparação, eluir o ADN em 500 ul de TE (Tris-EDTA) tampão fornecido no kit para um tubo de 1,5 ml.
   2. Etanol precipitar o ADN para concentrá-la por adição de 50 ul de acetato de sódio 3M e 1 ml de etanol a 100% ao tubo. Colocar o tubo à temperatura de -20 ° CO / N.
   3. Centrifuga-se o tubo durante 30 minutos a 14000 rpm a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ar-secar o sedimento durante 10 minutos à TA. Dissolve-se o sedimento em 15 ul de tampão TE, os quais devem produzir uma concentração de ~ 4 mg / mL.
      NOTA: O construções de expressão de controlo utilizados aqui são PMES-IRES-GFP, ^10, que é conduzido por um promotor de frango β-actina, ou pCI-H2B-IRES-RFP 10, que é conduzida pelo promotor de CMV.

2. galinha In Ovo Micro-electroporação e In Ovo celular Ensaio de Proliferação

1. Em Ovo Micro-injecção de construção de expressão e Micro-eletroporação:
   1. Retire os tubos capilares de vidro em agulhas finas utilizando um extractor de micropipeta com os seguintes parâmetros optimizados para um 2,5 x 2,5 milímetros Caixa de platina de aquecimento de filamento: Pressão = 500, de calor = 600 ° C, Pull = 64, velocidade = 105, e Tempo = 150 mseg (ver Tabela 1).
   2. Configure a esquerda e para a fase micro-manipulador destros flanqueando o microscópio (ver Figura 1A). O micro-manipulador Destro segura a agulha capilar de vidro e micro-manipulador canhota detém os eletrodos (Figura 1A).
   3. Prepare a agulha finamente puxado capilar de vidro para micro-injecção, cortandoa ponta da agulha com uma pinça, enquanto trabalha com o microscópio.
   4. Encher a agulha manualmente à mão usando o micro-manipulador com 2,5 ul de ADN de plasmídeo coloridas com 0,1% de Fast Green, enquanto que trabalham sob o microscópio.
   5. Coloque o ovo deitado de lado dentro de um dispositivo de suporte para moldes / ovo (ver Figura 1A). Cortar uma janela redonda na parte superior do ovo usando uma tesoura ¹⁹ (Figura 1A).
   6. Enquanto trabalhava sob o microscópio, abra com cuidado as duas membranas que recobrem o embrião usando uma pinça.
   7. Ao trabalhar sob o microscópio, entregar aproximadamente ~ 0,5 ul de ADN de plasmídeo para o lúmen vesícula ótica direita por micro-injecção manualmente utilizando a mão direita, utilizando o micro-manipulador e por micro-electroporação.
      1. Para tal, a micro-injectar o lúmen vesícula ótica direita com o ADN com o lado direito do micro-manipulador (Figura 1B-D), ao mesmo tempo usando a mão esquerda Holdinga pinça para segurar a cabeça do embrião, porque a cabeça do embrião mergulha na fase E4. Não micro-injetar passado o lúmen vesícula ótica, porque isso irá prejudicar a vesícula ótica.
      2. Imediatamente após a micro-injecção, enquanto trabalhava sob o microscópio, use a Esquerda mão micro-manipulador para colocar o positivo (ânodo) 2 milímetros eletrodo de platina ântero-ventral à vesícula ótica direita e o eletrodo de 2 milímetros negativo (cátodo) em paralelo 1 mm entre si (ver Figura 1 C). Deliver 4 impulsos a 12 V com 100 mseg de duração e espaçamento 200 mseg. A vesícula ótica esquerda serve como um controlo não tratado interno.
         NOTA: Limpe os eléctrodos entre electroporations com um chumaço de algodão embebido em 1x PBS.
2. In Ovo celular Ensaio de Proliferação:
   1. Imediatamente após a electroporação adicionar 50 uL de 0,25 mg / mL em 1X PBS EdU soltando manualmente a solução EdU 50 ul para o conjuntoembrião no ovo usando uma pipeta. Selar os ovos com fita e retornar para o incubador durante 18-96 horas.
   2. Remova cuidadosamente a fita e verifique os embriões para GFP fluorescente ou sinal de RFP dentro da vesícula ótica após 18-24 horas usando um microscópio de fluorescência padrão (veja a Figura 1 EE '). Se o sinal fluorescente está presente, neste ponto colher os embriões para análise ou feche com fita adesiva e devolvê-lo para a incubadora para a colheita e analisa em fases posteriores (ver Figura 1 FP '').
      NOTA: Expressão de sinal de GFP com o constructo PMES-IRES-GFP é evidente 6-7 horas após a electroporação ^10.

Colheita 3. Embryo e processamento de tecidos para o RNA hibridização in situ e imuno-histoquímica

1. Colher os embriões usando uma pinça. Lavar o embrião em 1x PBS frio. Retirar as cabeças dos embriões, cortando a cabeça por seu pescoçousando uma pinça e coloque as cabeças em paraformaldeído a 4% O / N a 4 ° C. Perfurar o cérebro utilizando um fórceps para permitir a penetração do paraformaldeído 4% dentro da cabeça.
2. Desidratar as cabeças em 30% de sacarose (em 1x PBS) O / N a 4 ° C.
3. Montar as cabeças em forma crioprotector por congelação rápida em uma suspensão de gelo seco e metilbutano (2-metilbutano). Alternativamente, rápida congelar as cabeças em meio crioprotector com nitrogênio líquido. Armazenar as cabeças montadas à temperatura de -80 ° C.
4. Criocorte as cabeças em 12 mm cortes de tecidos grossos e recolher todas as secções de tecido contendo ouvido interno em lâminas de microscópio de vidro superfrosted.
5. Realizar ARN padrão de hibridação in situ e imuno-histoquímica como previamente descrito ^4,21, analisar e para a proliferação celular EdU seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante do kit.
   NOTA: As células ciliadas podem ser identificadas usando policlonais de coelho α-MyosinVIIa (MYO7A) umtibody (1: 1000, Proteus Biosciences) e o anticorpo secundário marcado fluorescentemente (1: 250, de cabra anti-coelho AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Captura e Processamento de Imagem

1. Tire fotos com equipamentos de imagem digital. Resultados de imunohistoquímica imagem com um microscópio de fluorescência padrão e os resultados dos controlos no local utilizando um microscópio de campo amplo padrão (que varia de 5x a 40x em ampliação).
2. Processar as imagens usando o software de processamento de imagem.

Resultados

Neste ADN método papel plasmídeo consistindo de proteína fluorescente verde (GFP) cassetes de expressão foi alvo para o desenvolvimento de frango papila basilar (PA), com parâmetros optimizados de 12 V e 4 impulsos com 100 duração do impulso mseg e intervalos de 200 mseg, obtendo-se uma ~ taxa de sobrevivência embrionária 50% e eficiência de plasmídeo de DNA alvo para a BP. Imagiologia de fluorescência da expressão da GFP nativa no desenvolvimento de embriões mostraram este método de ele...

Discussão

O método aqui descrito de in ovo micro-electroporação é optimizado para a transferência de genes para o órgão auditivo em desenvolvimento. É compatível com vectores de expressão baseados em DNA de plasmídeo tipicamente usadas para manipular a função do gene / expressão. O momento da eletroporação na E4 é o ideal para as investigações que incidem sobre o desenvolvimento HC no órgão auditivo. Os passos mais críticos são micro-injecção do ADN para o lúmen vesícula ótica sem ir muito profunda, com a agulha e danifi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Estéril 1x PBS pH 7.4	gibco	10010-023
Fast Green FCF Powder	Sigma	F7252-5G
EdU Powder	Invitrogen	E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit	Invitrogen	C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)	Qiagen	12643
ECM 830 ElectroSquarePorator	BTX Harvard Apparatus
Banana para Micrograbber Cable Kit	BTX Harvard Apparatus	45-0216
Destro & Micromanipuladores Canhotos	World Precision Instruments Inc.	M3301R & M3301L
Dois Dispositivos de Fixação Magnética de 12 mm com Postes Verticais de 7 polegadas	World Precision Instruments Inc.	M10
12x24 polegadas	World Precision Instruments Inc.	5479
Tesouras para ovos com 12 cm de comprimento curvas, lâminas extrafinas de 12 mm; Tesoura de Mola	World Precision Instruments Inc.	14120
Extrator de micropipeta para puxar agulhas	Sutter Instrument Co.	P-97
2.5x2.5 mm Caixa de Filamento de Aquecimento de Platina	Sutter Instrument Co.
Tubos Capilares de Vidro/Agulhas/Sem Fibra/Borosil 1 mm	FHC	27-30-0
Seringa de Vidro Hamilton 100 μ l	Hamilton	80601 Modelo 710LT
Óleo Mineral (Pesado) para Seringa de Vidro	Hamilton Fisher Scientific	O122-1
Tubo de Polietileno para conectar a Seringa de Vidro e Agulhas Cappilares de Vidro/ Não Tóxico	Becton Dickinson and Company (BD)	427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Seringas Descartáveis	Becton Dickinson and Company (BD)	309657
Agulhas descartáveis de calibre 21	Becton Dickinson and Company (BD)	305122
Um par de eletrodos de platina de 2 mm	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY611P3-2
Suporte de eletrodo	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY580
Um par de pinças finas Dumont número 5	Fine Science Tools (FST)
Fita invisível com acabamento fosco para selar ovos	Cotonetes de Algodão Office Depot	520-928
	Fisher Scientific	23-400-101
Pontas

Placa de Base de Aço Metálico de filtro estéreis