O órgão auditivo medeia a audição. Aqui apresentamos um método de micro-eletroporação in ovo modificado otimizado para estudar a proliferação e diferenciação de células progenitoras auditivas no órgão auditivo de galinhas em desenvolvimento.
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Artigo de método
A transferência de genes para o frango auditivo órgão por
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embriões de galinha são sistemas modelo ideal para estudar o desenvolvimento embrionário como manipulações da função do gene pode ser realizada com relativa facilidade in ovo. O ouvido interno órgão sensorial auditivo é fundamental para a nossa capacidade de ouvir. Ele abriga um epitélio altamente especializada sensorial que consiste em células ciliadas de transdução mecano (HCs) e envolvente glial-como células de suporte (SCS). Apesar das diferenças estruturais nos órgãos auditivos, os mecanismos moleculares que regulam o desenvolvimento do órgão auditivo são evolutivamente conservada entre mamíferos e aves Em electroporação in ovo é largamente limitado a fases precoces em E1 -. E3. Devido ao desenvolvimento tardio relativa do órgão auditivo na E5, manipulações do órgão auditivo por em eletroporação in ovo passado E3 são difíceis devido ao desenvolvimento avançado do embrião de galinha em fases posteriores. O método aqui apresentado é um método de transferência de genes transitória para alvejar genes de interesse noestágio E4 - E4.5 no frango auditivo órgão sensorial desenvolvimento via in ovo micro-eletroporação. Este método é aplicável para gain- e perda de funções com vectores de expressão baseados em DNA de plasmídeo convencional e pode ser combinada com a proliferação celular num ensaio in ovo adicionando EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) para todo o embrião no tempo de electroporação. O uso da proteína fluorescente verde ou vermelho (GFP ou RFP) plasmídeos de expressão permite que o experimentador para determinar rapidamente se a eletroporação alvo com sucesso a porção auditiva do ouvido interno em desenvolvimento. Neste trabalho método, exemplos representativos dos espécimes GFP electroporadas são ilustrados; embriões foram recolhidas 18-96 horas após a electroporação e a segmentação de GFP à região pró-sensitivo do órgão auditivo foi confirmada por RNA de hibridação in situ. O papel método também proporciona um protocolo optimizado para a utilização da timidina EdU analógico para analisar célula prolifração; um exemplo de um ensaio de proliferação celular baseado EdU que combina imuno-marcação e clique EdU química é fornecida.
Introdução
Apesar das diferenças na morfologia e padronização celular entre os mamíferos e órgão sensorial auditiva aviária, os fatores moleculares e vias responsáveis pelo desenvolvimento HC sensorial são pensados para ser evolutivamente conservada 1-3. A papila basilar, que abriga os HCs auditivas e suas SCs circundantes, se desenvolve como um outpocketing do otocyst ouvido interno. Logo no início de uma piscina de progenitores HC e SC é especificado dentro do plac�io ótica ótica domínio / copo neural-sensorial competente (NSD). Dados destino de mapeamento de fornecer evidências de que linhagens neuronais e sensoriais são ligados e surgem da NSD localizada na....
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Protocolo
Os ovos e embriões não eclodidos são cuidadas e tratadas de forma ética e humana. Todos os protocolos de utilização de embriões unhatched foram aprovados pelo Animal Care e do Comitê Use na Johns Hopkins School of Medicine, em Baltimore, Maryland.
1. Os ovos e Preparação de construções de expressão
- Ovos:
- Incubar 3-4 dúzia de ovos de galinha fertilizados (Gallus gallus) deitado em seus lados a 37 ° C.
- Após 24 horas de incubação, puxe 3 cc de albumina com uma seringa a partir da extremidade traseira rodada do ovo e selar o buraco com fita adesiva transparente. Isto cria uma câmara de ar....
- Incubar 3-4 dúzia de ovos de galinha fertilizados (Gallus gallus) deitado em seus lados a 37 ° C.
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Resultados
Neste ADN método papel plasmídeo consistindo de proteína fluorescente verde (GFP) cassetes de expressão foi alvo para o desenvolvimento de frango papila basilar (PA), com parâmetros optimizados de 12 V e 4 impulsos com 100 duração do impulso mseg e intervalos de 200 mseg, obtendo-se uma ~ taxa de sobrevivência embrionária 50% e eficiência de plasmídeo de DNA alvo para a BP. Imagiologia de fluorescência da expressão da GFP nativa no desenvolvimento de embriões mostraram este método de ele.......
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Discussão
O método aqui descrito de in ovo micro-electroporação é optimizado para a transferência de genes para o órgão auditivo em desenvolvimento. É compatível com vectores de expressão baseados em DNA de plasmídeo tipicamente usadas para manipular a função do gene / expressão. O momento da eletroporação na E4 é o ideal para as investigações que incidem sobre o desenvolvimento HC no órgão auditivo. Os passos mais críticos são micro-injecção do ADN para o lúmen vesícula ótica sem ir muito profunda, com a agulha e danifi.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Doris K. Wu por plasmídeos de expressão e sondas in situ, o Centro Universitário Johns Hopkins para a instalação de imagem Biologia Sensorial e do Centro de Audição e Equilíbrio. Este trabalho foi apoiado por NIDCD Grant T32 DC000023 a LE
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Estéril 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 | |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G | |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 | |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 | |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | ||
| Banana para Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 | |
| Destro & Micromanipuladores Canhotos | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L | |
| Dois Dispositivos de Fixação Magnética de 12 mm com Postes Verticais de 7 polegadas | World Precision Instruments Inc. | M10 | |
| 12x24 polegadas | World Precision Instruments Inc. | 5479 | |
| Tesouras para ovos com 12 cm de comprimento curvas, lâminas extrafinas de 12 mm; Tesoura de Mola | World Precision Instruments Inc. | 14120 | |
| Extrator de micropipeta para puxar agulhas | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 2.5x2.5 mm Caixa de Filamento de Aquecimento de Platina | Sutter Instrument Co. | ||
| Tubos Capilares de Vidro/Agulhas/Sem Fibra/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 | |
| Seringa de Vidro Hamilton 100 μ l | Hamilton | 80601 Modelo 710LT | |
| Óleo Mineral (Pesado) para Seringa de Vidro | Hamilton Fisher Scientific | O122-1 | |
| Tubo de Polietileno para conectar a Seringa de Vidro e Agulhas Cappilares de Vidro/ Não Tóxico | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand | |
| 3 cc Seringas Descartáveis | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 | |
| Agulhas descartáveis de calibre 21 | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
| Um par de eletrodos de platina de 2 mm | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 | |
| Suporte de eletrodo | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 | |
| Um par de pinças finas Dumont número 5 | Fine Science Tools (FST) | ||
| Fita invisível com acabamento fosco para selar ovos | Cotonetes de Algodão Office Depot | 520-928 | |
| Fisher Scientific | 23-400-101 | ||
| Pontas |
Referências
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
- Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochl....
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Reimpressões e permissões
