A autorradiografia do receptor Protocolo para a visualização localizada da angiotensina II Receptores

Summary

Aqui apresentamos um protocolo para descrever a localização dos receptores de angiotensina II tipo 1 no cérebro de ratos por autorradiografia quantitativa, densitométrica e in vitro do receptor usando um análogo marcado com iodo-125 da angiotensina II.

Abstract

Este protocolo descreve os padrões de ligação do receptor de angiotensina II (Ang II) no cérebro de rato usando um radioligando específica para os receptores de Ang II para executar o mapeamento do receptor de auto-radiografia.

Os espécimes de tecido são colhidas e armazenadas a -80 ° C. A criostato é usado para a secção coronal do tecido (cérebro) e descongelar-montar as secções em lâminas carregadas. As secções de tecido em lâminas são incubadas em ^125I-SI-Ang II para marcar radioactivamente receptores de Ang II. Lâminas adjacentes são separados em dois conjuntos: "ligação não específica" (NSP) na presença de uma concentração saturante de receptores de não-marcado radioactivamente Ang II, ou um subtipo AT ₁ do receptor de angiotensina II (AT ₁ R) antagonista selectivo do receptor Ang II e 'ligação total ", sem AT ₁ antagonista R. Uma concentração saturante de AT ₂ subtipo do receptor Ang II _(2R) antagonista (PD123319, 10 uM) também está presente no incubatiem tampão de limitar ^125I-SI-Ang II se ligarem ao subtipo AT ₁ R. Durante 30 min de pré-incubação à temperatura de ~ 22 ° C, as lâminas NSP são expostas a 10? M e PD123319 losartan, enquanto 'ligação total "slides são expostas a 10? M PD123319. As lâminas são então incubadas com ¹²⁵ I-Si-Ang II, na presença de PD 123319 para 'ligação total ", e PD 123319 e de losartan para PEN em tampão de ensaio, seguido de várias lavagens' 'em tampão, e água para remover o sal e não- radioligando especificamente ligado. As lâminas são secas com secador por, em seguida, exposto a filme de auto-radiografia usando um filme especializada e cassete. O filme é desenvolvido e as imagens são digitalizadas em um computador para densitometria visual e quantitativa usando um sistema de imagem proprietária e uma planilha. Um conjunto adicional de slides são tionina-coradas para comparações histológicas.

A vantagem de utilizar a autorradiografia do receptor é a capacidade de visualizarAng II receptores in situ, dentro de uma secção de uma amostra de tecido, e anatomicamente identificar a região do tecido por comparação desta com uma secção histológica de referência adjacente.

Introduction

A doença cardiovascular continua a ser a principal causa de morte e incapacidade nos Estados Unidos, causando mais de 30% das mortes em os EUA em 2011 ^1. As estatísticas mais recentes da American Heart Association indicam que mais de uma em cada três pessoas tem uma ou mais tipos de doenças cardiovasculares. pesquisa cardiovascular continua a fazer progressos contra a compreensão desta doença, mas como as gerações começam a envelhecer, é imperativo para continuar esses esforços. O sistema renina-angiotensina (RAS) desempenha um papel central na regulação do sistema cardiovascular, principalmente através da promoção da aterosclerose, a inflamação, a vasoconstrição sistémica, e a activação do sistema nervoso simpático (Figura 1) ^2-8.

O RAS é um sistema hormonal que é activada quando as células justaglomerulares do rim secretam renina na corrente sanguínea em resposta à diminuição da pressão sanguínea, aumento sympatestimulação hetic, ou diminuição do fluxo de sódio pela mácula densa. A renina metaboliza o angiotensinogénio (sintetizado no fígado) para formar a angiotensina I (Ang I). Ang I é então metabolizado pela enzima conversora de angiotensina (ACE), uma ectoenzima no lado luminal das células endoteliais vasculares, principalmente nos pulmões e rins, para formar angiotensina II (Ang II), o péptido de efector principal do RAS. Ang II é capaz de activar dois subtipos de receptores; o receptor de tipo 1 _(AT1 R) e o receptor de tipo 2 (AT ₂ R), tanto que regulam o sistema cardiovascular, manter a homeostase de fluidos e eletrólitos e agora são considerados para afetar a função cognitiva e doença neurodegenerativa processa ^8,9. A RAS local, específica do cérebro é relatado para sintetizar de forma independente Ang II. No cérebro, o angiotensinogénio proteína precursora é sintetizado de astroglia ¹⁰ convertido a Ang I por uma enzima ^renina-3 como, possivelmente, a pro-renina ligado ao receptor de pro-renina^11, e, subsequentemente, convertida em angiotensina II pela enzima conversora de angiotensina que é abundantemente expresso na superfície extracelular de neurónios no cérebro ^12. Este intrabrain gerado Ang II é o agonista para o cérebro AT ₁ e AT ₂ receptores que são isoladas a partir de sangue-carregada de Ang II.

Enquanto o NO desempenha _um R um importante papel fisiológico, é melhor conhecida pelos seus efeitos patofisiológicos de todo o corpo, que afecta principalmente o sistema cardiovascular e nos rins (figura 2). Quando a Ang II liga-se a AT ₁ R, que provoca vasoconstrição; aumento da resistência ao fluxo sanguíneo e aumentar a pressão sanguínea. Além disso, promove a síntese e secreção de aldosterona e vasopressina, levando ao aumento da retenção de sódio e água. Estes efeitos podem também induzir a lesão cerebral isquémica e deficiências cognitivas e está ligada à doença de Parkinson, doença de Alzheimer, e diabetes, bem como a ser recentemente identificado para afectar de aprendizagem e de memória ^13-15. Há um ciclo de feedback no RAS em que a AT ₁ R nas células justaglomerulares no rim inibe a secreção de renina. Curiosamente, o NO ₂ R geralmente contra-regula a acção de pelo _1R, causando vasodilatação, o crescimento de neurites, a regeneração axonal, anti-proliferação e cerebroprotection entre muitos outros ^16-20. O NO ₂ R também foi identificado como um alvo para anti-hipertensão e, recentemente, drogas anti-câncer ^21. Determinar a localização e densidade de receptores de Ang II no prazo de vários tecidos e como eles são influenciados por diversos tratamentos e estados de doença, utilizando auto-radiografia receptor densitometria quantitativa irá ajudar a descobrir o papel que o RAS desempenha nas doenças específicas.

Autorradiografia do receptor foi usado há mais de 30 anos como um método eficaz para a indicação da presença de angiotensina II receptores e outros componentes do RAS no cérebro e outros tecidos do rato, murganho, cobaia, cão e ser humano sob uma variedade de condições experimentais ^22-34. A importância de localizar receptores de Ang II no cérebro é que se pode aplicar neuroanatomy funcional para as acções de Ang II no cérebro, por exemplo, a presença de pelo _um de R no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) sugere uma função de Ang II no cérebro para estimular a vasopressina, a oxitocina ou libertação da hormona de libertação de corticotropina (CRH), ou a activação do sistema nervoso simpático. Assim, as drogas que bloqueiam a AT ₁ R pode diminuir alguns destes efeitos PVN mediadas associados com relação à actividade das RAS cerebrais. Trabalhos em curso sugere que o uso de AT ₁ antagonistas R pode diminuir Stress Disorder (PTSD) a libertação induzida pós-traumático de CRH e melhorar os sintomas de PTSD (ferir et al., Submetido para publicação). O PVN, subfornicialórgão (SFO), e na amígdala são conhecidas por regular a homeostase, o apetite / sede, sono, memória, reações emocionais, e são as áreas-alvo deste estudo demonstração. Estas regiões foram examinados através da recolha de secções coronais de cérebro em lâminas de microscópio, e o tratamento das secções com inibidores específicos, juntamente com um ligando radioactivo específico para receptores de Ang II. Neste estudo, todos os materiais e reagentes juntamente com os fornecedores sugeridas são listados, Iodo-125 foi utilizado para radiomarcar um antagonista de angiotensina II receptor, sarcosina ^1, isoleucina ⁸ Ang II (SI Ang II), que foi depois purificado como o mono ^125I -Si Ang II utilizando métodos de HPLC conforme descrito anteriormente ^35. O uso desta elevada actividade específica de radioligando permite a visualização de áreas de baixa, moderada e alta densidade de receptor após a exposição das secções radiomarcado a um filme de raios-x. Ao calibrar o filme com os padrões de pasta cerebrais que contenham quantidades conhecidas de iodo-125, a quantidade específicaAng II de ligação ao receptor em uma área pode ser quantificada. Em estudos experimentais, o receptor de Ang II de ligação nos cérebros de sujeitos experimentais pode ser comparada com a no cérebro de indivíduos de controlo. Isto pode indicar se as acções de Ang II são alteradas em resposta a uma condição genética, anormalidade fenotípica, estado de doença ou de tratamento da droga. Este conhecimento pode, então, ser aplicada ao desenvolvimento de terapias para o tratamento de doenças associadas com a desregulação da RAS. As técnicas alternativas que a identificação de sítios de ligação ao receptor, mas com uma resolução reduzida anatómica, são ensaios que utilizam preparações de membrana de tecidos derivadas de homogenatos de tecidos, as quais são incubadas com o radioligando ao longo de uma gama de concentrações a fim de avaliar a afinidade de ligação de radioligandos como a constante de dissociação _(Kd de ligação ) e capacidade de ligação máxima (B _max) do tecido de interesse.

O protocolo aqui descrito pode ser dividido em 5 dos principais components: Preparando secções de tecido para o receptor autorradiografia; Receptor autorradiografia; Exposição de Cinema e Desenvolvimento; Histologia; Análise de Imagem e densitométrica.

Protocol

Todos os procedimentos com animais realizados para este estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Nova Southeastern University de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, 8 ^th Edition (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ).

1. Preparar as secções de tecido para o receptor A autorradiografia

1. No momento do sacrifício, colheita frescos tecidos cerebrais, e embrulhe em papel alumínio e coloque em um freezer -20 ° C o mais rapidamente possível. Para manter a forma correta, coloque cérebros em um molde cérebro que simula o interior do crânio, embrulhe em papel alumínio e coloque em um - 20 ° C congelador. Após 30 min, os tecidos lugar em um saco de armazenamento vedável congelador e mover-se para um congelador de -80 ° C para armazenamento a longo prazo.
   1. Obter os amostra fresca de tecido congelado de interesse a partir do descongelamento -80 ° C congelador, e transferir para um criostato definido para um mínimo de -10 ° C e um máximo de -18 ° C, a fim de evitar.
   2. Coloque a amostra sobre o tecido de montagem com um glicol e meio de incorporação à base de resina, apenas a incorporação de uma pequena parte da amostra para o meio. Para cérebro, o cérebro é montado verticalmente para permitir que o corte no plano coronal.
2. Coloque montar o tecido para o micrótomo dentro do criostato e aperte firmemente no lugar. Assegurar o lado esquerdo e direito do cérebro estão nas mesmas coordenadas ântero-póstero, e que o eixo dorso-ventral do cérebro é atlas perpendicular ao vulgarmente utilizados.
3. Iniciar o corte com a espessura desejada (20 uM recomendado) e descongelar montar as secções em lâminas de microscópio numa direcção vertical para ter uma área de superfície maior de espaço na corrediça. Recolha secções em lâminas em conjuntos sequenciais de cinco anos, ou seja, o primeiro conjunto de slides são rotulados 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, e 1-5 (Figura 3).
4. Depois de preencher um conjunto de slides com seções, deixar as lâminas secar ao ar durante até 1 hora, em seguida, coloque o SLIdes em uma caixa plástica de slides em um saco de armazenamento congelador auto-selante, e armazenar a -20 ° C.

2. Receptor autorradiografia

CUIDADO: Radioactividade. Use roupas de proteção para lidar com radioatividade. Eliminação é dependia estabelecimento, e deve seguir as orientações para se decompor adequadamente (meia-vida de 60 dias) ou ser pego por uma empresa certificada.

1. Retire o "-1" e "-2" slides de juros a partir do freezer -20 ° C e montar em suportes de slide (Figura 5). Monte os "-1" slides juntos para o tratamento "não específica", e os "-2" desliza para o tratamento 'total'. Frascos 'não-específicas "irá conter 10 uM concentrações finais de PD123319 um antagonista ₂ R, e do losartan um AT _um antagonista de R, em tampão de meio de ensaio (AM5) (Tabela 1), o" total "frascos de ligação irá conter apenas 10 ? M PD123319 em AM5.
2. Inverta a corrediçaapertos para colocar as lâminas em frascos Coplin pré-incubação enchidos com 35-40 ml de AM5, e respectivos inibidores durante 30 min à temperatura ambiente. Comece séries subsequentes em seu banho de pré-incubação em intervalos de 4 min.
3. Imediatamente transferir lâminas a partir da solução de incubação pré aos utentes incubação de deslizamento, contendo 10 ml de AM5, além de uma concentração pré-determinada de ^125I-SI-Ang II (calculada na Figura 4) com os respectivos inibidores, para 60-90 min a sala temperatura. Se houver radioactivo suficiente, 10 lâminas podem ser colocados (back to back) em suportes de slide modificados e incubadas com ¹²⁵ I-SI-Ang II em frascos Coplin.
4. Colocar as lâminas de volta para os suportes de slide (se necessário), mancha, e lavar por agitação suave para 1-2 seg em 400 ml de água destilada em dois recipientes separados.
5. Transferir as lâminas sequencialmente em quatro frascos Coplin contendo 35-40 ml de AM5 durante exactamente 1 min cada (como ilustrado na Figura 4 </ Strong>).
6. Após a última lavagem 1 min, agitar suavemente as seções de 1-2 segundos em quatro mudanças de gelo frio água destilada.
7. Seque as lâminas com ar frio (Atenção: o ar quente volatiliza o composto radioactivo) usando quatro secadores de cabelo criados a partir de ângulos diferentes para 4 min (Figura 5), até que todas as seções estão secos, em seguida, coloque sobre uma toalha de papel.
8. Mount desliza com os tecidos para cima em um papelão para aposição ao filme de raios-X usando fita dupla face.
9. Montar pelo menos um, ¹²⁵ calibração corrediça iodo padrão para cada cartão (Figura 6).
   Nota: Os padrões de calibração consiste de pasta de cérebro completamente misturado com ¹²⁵ Iodo ligado a um composto contendo um anel de fenol, compactado por centrifugação numa seringa de 1 ml de tuberculina, que são criostato segmentado com a mesma espessura como as secções do cérebro e descongelar-montada em microscópio slides. Alternativamente, ¹²⁵ padrões de calibração em Iresina plástica seccionados a 20 uM de espessura podem ser obtidas comercialmente. A resina plástica nestas normas protege parcialmente o filme da radiação tal que uma equivalência de tecido de ~ 40% devem ser tidos em conta na calibração.

3. Exposição e Desenvolvimento Film

1. Proceder a uma câmara escura com uma cassete de raios-X strap-costas e filmes auto-radiografia. Abrir a cassete e colocar o cartão com corrediças no interior (Figura 6).
   1. Desligue as luzes e ligue a luz de segurança. Cuidadosamente abra a caixa de filme de Raios-X, remova um filme, e coloque o lado da película brilhante para cima (com a borda irregular no canto inferior direito) sobre os slides da cassete. Feche cuidadosamente a cassete, e torcer as barras de travamento para selar a luz (Figura 6). Expor as lâminas para vários dias a várias semanas a -20 ° C.
2. Na câmara escura, abra a gaveta e prossiga com a proc revelação de filmesess.
   1. Colocar as lâminas nas bandejas consecutivamente; programador durante 2 min, água contendo 5% de ácido acético glacial durante 30 seg, e fixador durante 5 min. As películas são colocadas no dentro de um tabuleiro com água corrente durante 20 minutos, em seguida, colocados em Photoflo para não mais do que 10 segundos e penduradas.
      Nota: O tempo de exposição é determinada empiricamente e pode envolver vários filmes com diferentes tempos de exposição: o tempo suficiente para obter sinais mensuráveis ​​de áreas com baixa ligação, mas não tão longo como a saturar o filme de áreas com alta de ligação. Uma vez que as exposições aceitáveis ​​são obtidos, em seguida, avance para a próxima etapa.

4. Histologia

1. Preparar a mancha tionina e reagentes de coloração (Tabela 2, Figura 7).
   1. Colocar as lâminas "-3" no porta-lâminas, e transferência de forma sequencial começando com água desionizada durante 1 min, em seguida, tionina solução corante durante 10 min seguido de três mergulha deionáguas ized, e uma lavagem de 30 segundos em água deionizada.
   2. Após a água, coloque o porta-lâminas para lavagens de etanol como segue; 50%, 70% e 90% durante 30 segundos, seguido por duas lavagens de etanol a 100% durante 1 min cada. Por último, coloque o porta-lâminas em xileno por 3 min, em seguida, transferir para uma segunda solução xileno durante 5 min.
2. Remover uma lâmina de cada vez a partir do último banho de xileno, e cobrir a borda superior da lâmina com uma base de resina em meio de montagem solvente orgânico, e colocar uma lamela de 24 milímetros x 60 milímetros sobre a lâmina. Deixar as lâminas suficientemente seca para ~ 48 horas e, em seguida, digitalizar para o computador a 2.400 dpi em tons de cinza.

5. densitom�rica Análise de Imagem

1. Coloque o lado do filme brilhante para baixo, com a borda irregular no canto inferior esquerdo e digitalizar usando um scanner proprietária capaz de transmitir a informação densidade do filme, sem qualquer distorção no computador sistema de imagem.
2. Abra as sys imagem proprietáriasTEM e utilizam as barras de calibração para estabelecer padrões de calibração para a futura análise densitométrica das imagens sobre o filme (Figuras 9 - 12).
3. áreas medida de interesse por qualquer estabelecimento de um modelo ou empiricamente, indicando as áreas de interesse. Os dados são recolhidas e separadas baseado no filme, controlo ou de tipo selvagem (seção), e região. Certifique-se incluir densidade (fmol / g), área de digitalização, e uma área de meta total nas medições (Figura 9).
   1. Ajuste bares área de digitalização, assegurando que a região de interesse cai entre parâmetros de destacar (Figura 10).
   2. Exportar dados em uma planilha (Tabela 4). Multiplicar as vezes de densidade da área alvo total, então dividir pela área de leitura, a fim de obter o valor para a ligação do que a área específica. Uma vez que isto é feito para todos os valores medidos, o substrato não-específica estabelecida total e produzir o p de ligação específicaressentir-se. Médias também pode ser realizada por estes valores.

Results

A síntese da via metabólica do sistema renina-angiotensina é mostrado na Figura 1 e o foco directo sobre os subtipos de receptores da angiotensina II (AT ₁ R e AT ₂ R) está descrita na Figura 2. A Figura 3 mostra a transferência de cérebro coronal secções em lâminas de microscópio, que são executados através de um processo de auto-radiograf ia do receptor utilizando uma concentração pré-determinada ^{de 125I-SIAN...}

Discussion

O protocolo descrito identifica a visualização de "total" e "não específica" de ligação do radioligando em secções adjacentes de secções coronais de cérebro de roedor anteriormente colhido e armazenado a -80 ° C, e pode ser facilmente aplicável a virtualmente todos os tecidos que tem anatomicamente resolvido subestruturas que mostram quantidades diferenciais de receptores ou locais de ligação de radioligandos. Os procedimentos descritos no âmbito do protocolo são simples e a análise é fundamental par...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copos de Plástico de 500 ml	Fisher	02-591-30
24 mm x 60 mm Lamínulas	Fisher	22-050-25
Filme de Imagem de Autorradiografia 24 mm x 30 cm	Filme MR Carestream-Biomax	891-2560
Bacitracina (de Bacillus licheniformis)Folha de	Sigma	B-0125
8 x 11	Placa de Ilustração Crescente #201	201
Frascos Coplin	Fisher Scientific	E94
Secadores de cabelo comerciais	Conair	Modelo SD6X
	Fisher	14-961-26
EDTA (sal dissódico, di-hidratado)	USB Corporation	15-699
Etanol	Fisher	16-100-210
Substituto do Formulário para Fotógrafos Desenvolvedores D-19	Formulary, Inc.	01-0036
Ácido Acético Glacial	Fisher	A38 SI-212
Histoprep/OCT	Fisher	SH75-125D
Fixador de Filme	Kodak	5160320
Foto flo	Kodak	1464502
Losartan	Fisher/Tocris	37-985-0
MCID™ Core 7.0	MCID	N/A
NaCl	Fisher	S271
Punhos de lâmina Peel-A-Way	VWR	48440-003
Permount	Fisher	SP15-100
PD123319	Fisher	13-615-0
Lâminas de Microscópio Premium Carregadas, Lâmina	Microscópio Premiere	9308W
125I Ligantes	Perkin Elmer	NEX- 248
125SI-Ang II	Universidade George Washington	Radioiodado pelo Dr. Speth
Slide Mailers	Fisher Scientific	HS15986
Fosfato Dibásico de Sódio Anidro (Na2PO4)	Fisher	RDCS0750500
Acetato de Sódio (Anidro)	Fisher	BP333-500
Thionin	de	T409-25
(10 x 12)	Spectronics Corporation	Four Square
Xylene	Fisher	X3P-1GAL