A Bioensaio simples para a avaliação dos fatores de crescimento endotelial vascular

Steven A. Stacker; Michael M. Halford; Sally Roufail; Carol Caesar; Marc G. Achen

doi:10.3791/53867

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Artigo de método

A Bioensaio simples para a avaliação dos fatores de crescimento endotelial vascular

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DOI:

10.3791/53867

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15 de março de 2016

Steven A. Stacker¹ , Michael M. Halford¹ , Sally Roufail¹ , Carol Caesar¹ , Marc G. Achen¹

¹Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Neste artigo

Resumo

Descreve-se um bioensaio baseado em células simples para a detecção, quantificação e a monitorização da actividade de membros da família de ligandos vasculares factor de crescimento endotelial. O ensaio utiliza receptores quiméricos expressos numa linha celular dependente de factores para proporcionar uma avaliação semi-quantitativa ou quantitativa de ligação ao receptor e a reticulação pelo ligando.

Resumo

A análise de tirosina-quinases de receptor e seus ligandos que interagem envolvidas na biologia vascular é muitas vezes difícil devido à expressão constitutiva de famílias dos receptores relacionados, uma ampla gama de ligantes relacionados, e a dificuldade de lidar com as culturas primárias de células endoteliais especializadas. Descrevemos aqui um bioensaio para a detecção de ligandos para o factor de crescimento endotelial vascular receptor-2 (VEGFR-2), um transdutor chave de sinais que promovem a angiogénese e linf angiogénese. Um ADNc que codifica uma fusão da região extracelular (de ligação ao ligando) do VEGFR-2 com as regiões transmembrana e citoplasmático do receptor de eritropoietina (EpoR) é expressa na linha celular dependente de factor de Ba / F3. Esta linha de células cresce na presença de interleucina-3 (IL-3) e retirada deste factor resulta na morte das células dentro de 24 horas. A expressão da fusão do receptor VEGFR-2 / EpoR fornece um mecanismo alternativo para promover a sobrevivência e potencially proliferação de células Ba / F3 estavelmente transfectadas na presença de um ligando capaz de se ligar e de reticulação a porção extracelular da proteína de fusão (ou seja, um que pode cruzar-ligação VEGFR-2 a região extracelular). O ensaio pode ser realizado de duas formas: uma abordagem semi-quantitativa, em que pequenos volumes de ligando e células permitir um resultado rápido, em 24 h, e uma abordagem quantitativa envolvendo marcadores substitutos de um número de células viáveis. O ensaio é relativamente fácil de realizar, é altamente sensível às conhecidas VEGFR-2 e ligandos podem acomodar inibidores extracelulares do VEGFR-2 de sinalização, tais como anticorpos monoclonais para o receptor ou ligandos, e armadilhas ligando solúvel.

Introdução

A família do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) de factores de crescimento de proteínas secretadas e dos seus receptores de superfície celular cognato é um grupo importante e diverso de ligandos e receptores solúveis incorporados à membrana, respectivamente, que em função de transdução de sinais através das membranas celulares. Eles funcionam principalmente em células endoteliais mas também em células de origem epitelial e as do sistema imunológico ^1,2. Vias de sinalização envolvidas por receptores activados por ligandos VEGF (VEGFR) são críticos em grandes patologias, tais como a degeneração macular relacionada com a idade e cancro e terapêu....