Artigo de método

A Bioensaio simples para a avaliação dos fatores de crescimento endotelial vascular

DOI:

10.3791/53867

⸱

15 de março de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Neste artigo

Resumo

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Descreve-se um bioensaio baseado em células simples para a detecção, quantificação e a monitorização da actividade de membros da família de ligandos vasculares factor de crescimento endotelial. O ensaio utiliza receptores quiméricos expressos numa linha celular dependente de factores para proporcionar uma avaliação semi-quantitativa ou quantitativa de ligação ao receptor e a reticulação pelo ligando.

Resumo

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A análise de tirosina-quinases de receptor e seus ligandos que interagem envolvidas na biologia vascular é muitas vezes difícil devido à expressão constitutiva de famílias dos receptores relacionados, uma ampla gama de ligantes relacionados, e a dificuldade de lidar com as culturas primárias de células endoteliais especializadas. Descrevemos aqui um bioensaio para a detecção de ligandos para o factor de crescimento endotelial vascular receptor-2 (VEGFR-2), um transdutor chave de sinais que promovem a angiogénese e linf angiogénese. Um ADNc que codifica uma fusão da região extracelular (de ligação ao ligando) do VEGFR-2 com as regiões transmembrana e citoplasmático do receptor de eritropoietina (EpoR) é expressa na linha celular dependente de factor de Ba / F3. Esta linha de células cresce na presença de interleucina-3 (IL-3) e retirada deste factor resulta na morte das células dentro de 24 horas. A expressão da fusão do receptor VEGFR-2 / EpoR fornece um mecanismo alternativo para promover a sobrevivência e potencially proliferação de células Ba / F3 estavelmente transfectadas na presença de um ligando capaz de se ligar e de reticulação a porção extracelular da proteína de fusão (ou seja, um que pode cruzar-ligação VEGFR-2 a região extracelular). O ensaio pode ser realizado de duas formas: uma abordagem semi-quantitativa, em que pequenos volumes de ligando e células permitir um resultado rápido, em 24 h, e uma abordagem quantitativa envolvendo marcadores substitutos de um número de células viáveis. O ensaio é relativamente fácil de realizar, é altamente sensível às conhecidas VEGFR-2 e ligandos podem acomodar inibidores extracelulares do VEGFR-2 de sinalização, tais como anticorpos monoclonais para o receptor ou ligandos, e armadilhas ligando solúvel.

Introdução

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A família do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) de factores de crescimento de proteínas secretadas e dos seus receptores de superfície celular cognato é um grupo importante e diverso de ligandos e receptores solúveis incorporados à membrana, respectivamente, que em função de transdução de sinais através das membranas celulares. Eles funcionam principalmente em células endoteliais mas também em células de origem epitelial e as do sistema imunológico 1,2. Vias de sinalização envolvidas por receptores activados por ligandos VEGF (VEGFR) são críticos em grandes patologias, tais como a degeneração macular relacionada com a idade e cancro e terapêutica de segmentação eles estão em uso clínico frequente (por exemplo, o bevacizumab, anticorpo monoclonal que tem como alvo VEGF-A) 3,4.

Uma das complexidades da família VEGF é a diversidade de ligandos solúveis presentes na natureza (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, as proteínas VEGF codificadas pela ORF parapox vírus da família e de veneno de cobra de VEGF, além de outros inibitórioisoformas de VEGF-A) 2.

Estes ligandos interagem com os três membros da família do receptor de tirosina-quinase, nomeadamente VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. Estes receptores são variavelmente expressa em diferentes tipos de células, mas são muitas vezes co-expressos na superfície das células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos e linfáticos de todos os tamanhos 5. VEGFR-2 podem ligar-se a mamíferos ligandos VEGF-A 6, VEGF-C e VEGF-7 D 8,9, bem como vírus da ORF de VEGF 10 e 11 de veneno de cobra de VEGF. VEGFR-2 desempenha um papel importante na condução da angiogénese (a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes) no desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas, cancro e doenças dos olhos. Nestes contextos, os ligandos, tais como VEGF-A, -C e -D ligam-se e activam o receptor de sangue em células endoteliais vasculares 12-15. Em células endoteliais linfáticas, VEGFR-2 desempenha um papel na linf angiogénese, a formação de novos vasos linfáticos 16. VEGFR-2 também pode promover dilatação e expansão das grandes artérias e vasos linfáticos em tecidos saudáveis ​​e doenças 17. Uma compreensão completa do VEGFR-2: ligante é, por conseguinte, importante para o desenvolvimento de inibidores para utilização no tratamento de doenças dependentes de angiogénese 18. Enquanto a maioria das isoformas do VEGF-A se ligam ao VEGFR-2, a clivagem proteolítica de VEGF-C e VEGF-D é necessária para libertar um fragmento que consiste no domínio de homologia de VEGF-que exibe ligação para o VEGFR-2 de elevada afinidade 19,20.

Nós desenvolvemos um ensaio biológico para monitorar ligantes de VEGFR-2, que é projetado para contornar a necessidade de células primárias endoteliais, que são tecnicamente difíceis de passagem, caro para comprar e cultura (o que exige especializados de média) 21 e expressar múltiplos VEGFRs e associado co- receptores 22. Heterodimerização de VEGFR-2 com outros receptores VEGF ou co-receptores podem causar complexidade indesejada quando com o objetivo de parafuso prisioneiroy interacções receptor-ligando binários, avaliando a actividade atribuível a um receptor específico, ou avaliar o efeito dos reagentes de inibidores. 23. O bioensaio mantém a mobilidade do receptor relevante na membrana da célula e permite a avaliação da capacidade de um ligando para se ligar e reticular o VEGFR-2 região extracelular.

O bioensaio baseia-se na criação de um receptor quimérico em que a região extracelular de um receptor de VEGF (neste caso, o VEGFR-2) é fundida com as regiões transmembrana e intracelular do receptor de eritropoietina (EpoR), um membro da família do receptor de citocina 8,24. Esta proteína de fusão é então expressa na linha de células pró-B dependentes de factor de Ba / F3, em que a estimulação com um ligando capaz de se ligar e de ligação cruzada do domínio extracelular do receptor provoca a activação da região efectora citoplasmático, que é capaz de transduzir um sinal de sobrevivência através de Janus quinases (JAK) para promover a célulaa sobrevivência e / ou proliferação. Em contraste, a expressão de comprimento completo de VEGFR-2 no mesmo tipo de célula, e a estimulação com o ligando, não promover a sobrevivência e proliferação das células, indicando que os efectores de sinalização proximal da via o VEGFR-2 não estão disponíveis para este tipo de células.

Temos usado o ensaio em uma variedade de contextos para explorar ligação de novos VEGFR-2 ligantes 10,19,20,24-29. Em combinação com um ensaio / F3 VEGFR-3-EpoR-Ba, que compararam as actividades relativas de VEGF-C e os factores de crescimento VEGF-D para a ligação e ligação cruzada do VEGFR-2 e VEGFR-3 30. O ensaio tem sido utilizado para caracterizar a actividade inibidora dos anticorpos monoclonais neutralizantes para o VEGFR-2 ou VEGF-D, VEGFR-2 solúvel armadilha e peptidomiméticos de segmentação da família VEGF 31. O ensaio também foi utilizado para mostrar a capacidade de VEGF a partir de diferentes estirpes de vírus ORF para ligar e reticular o VEGFR-2, antes do teste em células endoteliais primárias 10,26. O ensaio é particularmente útil para a pesquisa rápida de mutantes de VEGF, que pode ser rapidamente avaliada para a actividade antes de serem introduzidas para os ensaios de células endoteliais mais trabalhoso 25 ou no momento da avaliação para os protocolos de purificação de crescimento Factores de 27.

O ensaio descrevemos é fácil de realizar, e na versão semi-quantitativa permite determinações rápidas que são por vezes necessários ao monitorar a produção ou purificação de factores de crescimento, anticorpos ou domínios de receptores solúveis para outras experiências. A facilidade de utilização do ensaio torna um complemento ideal para estudos mais e mais completas realizados com células endoteliais primárias derivadas do sangue ou vasos linfáticos a partir de tecidos específicos ou de sistemas de órgãos.

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Protocolo

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Meio Fonte de IL-3 e Preparação de WEHI-3D ​​condicionado

Nota: A linha celular de leucemia granulocítica ratinho WEHI-3D ​​é cultivado para gerar um meio condicionado contendo IL-3.

  1. Cultura WEHI-3D ​​em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal de bovino 10% (FBS), 1% de suplemento de glutamina-vida longa, 50 ug / ml de gentamicina. Inocular 5 x 10 6 células em fase logarítmica de crescimento em 50 ml de meio de cultura fresco num T175 cm balão de cultura de 3 tecidos e crescer durante cerca de 7 dias ou até as células passaram a sua fase logarítmica de crescimento por cerca de 24 - 48 h (evitar a morte celular excessiva na cultura). O meio condicionado é capaz de ser armazenada durante vários anos a -20 ° C, de modo que lotes de 200 - 500 ml podem ser produzidas de uma só vez.
  2. Decantar o fluido e as células dos frascos e centrifugação a 1000 x g durante 15 min para remover as células e os restos celulares. Remover a parte superior de 90% dos supernatant. Filtrar através de uma unidade de filtro de 0,22 um.
  3. aliquota meio condicionado WEHI-3D ​​(CM) em 1 ml, 50 ml e 200 ml de volume, para armazenamento a -20 ° C ou -70 ° C. alíquotas mais pequenas são úteis para a preparação do ensaio, os volumes intermédios para fazer o meio de cultura para a passagem de linhas celulares dependentes de factores, e volumes maiores para armazenamento a longo prazo. IL-3 é relativamente estável a 4 ° C de modo descongelado forma podem ser armazenadas durante algumas semanas, se utilizado em condições estéreis.
  4. Em alternativa, usar ratinho recombinante de IL-3 em níveis de 50 ng / ml diluído em meio de cultura, depois de ter sido filtrada através de uma unidade de filtro de 0,22 um.

2. Cultura e Avaliação de VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 e / F3 Linhas de Células de Controle Ba

  1. Culturas de controlo de células Ba / F3 em DMEM, FBS a 10%, 50 ug / ml de gentamicina ou penicilina / estreptomicina suplemento, 1% estabilizado L-glutamina e 10% de WEHI-CM-3D. células de passagem em 1:15 diluições a cada três dias a partir de célulascrescendo em fase logarítmica.
  2. Culturas de células de VEGFR2-EpoR-Ba / F3 em DMEM, FBS a 10%, 50 ug / ml de gentamicina, 1% de L-glutamina estabilizado e 10% de WEHI-CM-3D e 1 mg / ml de G418. células de passagem em 1:15 diluições de células que crescem em fase log. Veja 24 para mais detalhes sobre a construção e expressão do receptor quimérico.
  3. controlo da exploração Ba / F3 ou células / F3 VEGFR2-EpoR-BA a partir de culturas meados de fase log. Pipeta suavemente para remover as células não aderentes a partir do fundo do balão. Lavar três vezes no rato tonicidade solução salina tamponada com fosfato, pH 7,3 (PBS), (10 mL, centrifugar a 750 x g durante 5 min para recuperar sedimento celular) para remover o meio contendo IL-3.
  4. Lavar as células uma vez com DMEM e aditivos, sem a WEHI-3D-CM ou IL-3 recombinante e, em seguida ressuspender neste meio a uma concentração de 7,4 x 10 4 culas / ml (ou seja, 1.000 células por 13,5 ul; 10000 células por 135 ul, tal como determinado por contagem utilizando um hemocitómetro) parausar nas versões semi-quantitativos ou quantitativos do ensaio, respectivamente.
  5. Avaliar células de viabilidade por exclusão Trypan Blue (CUIDADO). Misturar com azul de tripano em PBS (0,4%) 1: 1, com a população de células e contagem de um mínimo de 100 células em um hemocitómetro. As células que ocupam o corante são considerados mortos ou moribundos. Viabilidade maior do que 98% é necessário para efectuar o ensaio.

3. Ensaio semi-quantitativa

  1. Adicionar células lavadas (1.000 células) contidos em 13,5 mL de meio de IL-3 deficiente para os poços de uma placa de 72 poços de micropoços à temperatura ambiente. Tome cuidado para misturar a suspensão de células durante aliquotting para garantir assentamento celular por gravidade não concentração de células viés. Use um P20 automatizado pipeta bem calibrado e dicas autoclavados.
  2. Adicionar amostras de teste e controlos aos poços num volume de 10% (1,5 mL, perfazendo um volume final de 15 ul contendo 1.000 células por cavidade) utilizando uma pipeta calibrada P20 ou, de preferência, P2 pipeta. tome caRE para assegurar que as amostras são compatíveis com as condições de cultura para as células de Ba / F3 que em termos de pH, sal e outras substâncias potencialmente citotóxicos / citostáticos. Sempre que possível, use um meio compatível ou tampão (por exemplo, DMEM ou PBS, respectivamente) ou diluir em tal meio ou tampão. A trituração com a mesma ponta vai assegurar a mistura.
  3. Para as amostras de controlo, incluem (i) só com meio contendo sem IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM adicionado ao meio sozinho ao volume final de 10%; e / ou (iii) VEGF-A diluída a 100 ng / ml em meio sozinho, não contendo a IL-3.
  4. Preencha quaisquer poços não utilizadas da microplaca com água estéril, PBS ou meio e coloque a placa dentro de um recipiente humidificado (com água embebido papel tissue) a troca gasosa permitindo. Incubar as células no interior dos recipientes, numa atmosfera humidificada de 10% de CO 2. Este ensaio pode ser confortavelmente configurado em 3 horas por uma pessoa, se as amostras de ensaio e componentes de meios disponíveis.
  5. Avaliar placas geralmente após 16 horas dede incubação na qual a discriminação de tempo entre amostras positivas e negativas, é evidente. Veja a Figura 3 para os exemplos de como as células aparecem na cultura. Analisar placas utilizando um microscópio invertido de contraste de fase padrão a 40-100 × ampliação.
    Nota: Os poços contendo factores de crescimento de suporte, tais como IL-3 ou VEGF-A conterá células que parecem redondos e translúcidos. Os poços sem factores de crescimento ou de suporte com meio sozinho terão reduzido número de células redondas, bem como células mortas ou a morrer e dos detritos celulares (por exemplo, Figura 3C). Avaliando a ensaio em 24-48 horas após a incubação, é a óptima para a sensibilidade.

4. Quantitative Bioensaio

  1. Adicionar células lavadas (10.000 células em 135 uL) em IL-3 deficiente em meio aos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços padrão à TA. Tome cuidado para misturar a suspensão de células durante aliquotting para garantir a sedimentação de células por gravidade não afeta ceconcentração ll.
  2. Adicionar amostras de teste e controlos aos poços num volume de 10% (15 mL) utilizando uma pipeta calibrada (P20). Ter o cuidado de assegurar que as amostras são compatíveis com as condições de cultura para as células de Ba / F3 que em termos de pH, sal ou outras substâncias potencialmente citotóxicos / citostáticos. Sempre que possível, use um meio compatível ou tampão (por exemplo., DMEM ou PBS) ou diluir em tal meio ou tampão. Filtrar esterilizar pequenos volumes usando uma unidade de filtro de centrífuga de tubo de acetato de celulose de 0,22 um de poro.
  3. Incubar a mistura de células, factores de crescimento e / ou agentes de inibidor em uma atmosfera humidificada de 10% de CO 2 durante 48 horas. Realizar o ensaio dentro de um recipiente umidificado que tem o papel de tecido embebido em água e permite que o gás de troca. Na conclusão do período de incubação, avalia o ensaio utilizando um dos métodos alternativos listados abaixo, que são marcadores substitutos do número de células viáveis ​​no poço.
  4. Alternativa 1: 3 H-thymidine Incorporação
    Nota: Esta quantificação é concebido para o formato de placa de 96 poços.
    1. Após incubação das placas de ensaio durante 48 horas a 37 ° C (volume de 150 ul por poço), adicionar 3 H-timidina num volume de 50 ul de meio de ensaio (Ba / meio de cultura F3 sem IL-3 / WEHI-3D ​​CM) por poço numa concentração de 20 uCi / ml, dando uma dose final de 1 uCi por cavidade.
    2. Incubar as placas durante mais 4 h a 37 ° C antes de colher as células, utilizando um colector de células. Extrair amostras individuais, colocando os filtros em cintilante e quantificar com um Contador de Cintilações Líquidas.
  5. # Alternativa 2: Detecção de bioluminescência de ATP celular
    Nota: Esta abordagem utiliza um reagente de monitorização de ATP que quando combinado com lisado celular pode gerar um sinal que reflecte a bioluminescência as células viáveis ​​da população.
    1. Lisar as células para extrair o ATP e utilizam um reagente de Monitorização de ATP para gerar umsinal luminescente de acordo com as instruções do fabricante. Leia luminescência usando um luminómetro compatível com um formato de placa de 96 poços.
  6. # Alternativa 3: redução enzimática de um corante indicador por células viáveis
    Nota: ensaios baseados resazurina mostram boa correlação com a viabilidade celular.
    1. Combinar as células cultivadas com o corante baseado resazurina e quantificar os ensaios utilizando um leitor de placas de fluorescência de acordo com as instruções do fabricante.

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Resultados

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Nesta secção, que mostram os resultados de uma experiência que demonstra as características essenciais de um bioensaio de VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (ver Figura 1 para os princípios do ensaio). Outros estudos publicados demonstram aplicações mais amplas do ensaio para VEGFR-2 ligantes alternativos, moléculas VEGF mutantes e anticorpos monoclonais inibidores 8,10,19,24-30.

Os dados aqui apresentados repres...

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Discussão

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O ensaio aqui descrito baseia-se na utilização de células de alta viabilidade, que são dependentes de factores de crescimento. portanto, as células devem ser cuidadosamente cultivadas para garantir que eles são dependentes do fator, e manter a expressão do receptor quimérico. Garantir que o meio é frescos e não armazenados por um período excessivamente longo e que WEHI-3D ​​CM é altamente ativo é importante. As células têm de ser cuidadosamente lavadas de IL-3 contendo o meio para o meio de ensaio para garantir que não ...

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Divulgações

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Steven A. Stacker e Marc M. Achen são acionistas Circadian Technologies Ltd., uma empresa de desenvolvimento de terapêuticas, visando a família VEGF de fatores de crescimento.

Agradecimentos

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SAS e MGA são apoiados por Subsídios de Projetos, Subsídios de Programa e Bolsas de Pesquisa do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália (NHMRC) e por fundos do Programa de Apoio à Infraestrutura Operacional fornecido pelo Governo de Victoria, Austrália. O MMH tem o apoio de uma bolsa da Fundação Peter MacCallum.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
A solução de Trypan BlueSigma-AldrichT8154 a0,4% em PBS é usada 1:1 com suspensões celulares para medir células viáveis. Perigo - pode causar câncer
Sulfato G418 (Geneticina)Invivogenant-gn-5Agente para selecionar células eucarióticas transfectadas. Perigo - pode causar sintomas de alergia ou asma ou dificuldades respiratórias.
3H-TimidinaPerkinElmerNET-027Este nucleosídeo radioativo é incorporado ao DNA cromossômico durante a mitose. Kit Vialight Plus de radiação perigosa
LonzaLT07-221Detecção bioluminescente de ATP celular para quantificar a viabilidade, usando o reagente de monitoramento de ATP
Reagente de viabilidade celular PrestoblueInvitrogenA13261Indicador de viabilidade celular baseado em resazurina. Fica vermelho no ambiente redutor da célula
Nunc Minitray com Nunclon Delta Surface (72 poços)Thermo Scientific136528Placa de microtitulação pequena
96 poços Placa de cultura de tecidosFalcon, Corning Inc.
DMEM (1X)Gibco11965-92
GlutaMAX (100X)Gibco35050-061
Soro Fetal BovinoGibco  10099-141
Coletor de CélulasTomtec Life SciencesTomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Contador de Cintilação LíquidaLKB Wallac1205LKB Wallac 1205 Contador de Cintilação Betaplate
UniFilter-96 GF/BPerkin Elmer6005177Branco 96-well Barex Microplate com filtro GF/B de 1 µ m poro
GentamicinaGibco, Life Technologies15750-060
Penicilina / EstreptomicinaGibco, Life Technologies15140-122
0,22 unidade de filtro de tubo de centrífuga de acetato de celulose de poroCostar, Corning Inc.8160filtros de tubo de centrífuga têm um 0.22 µ m poro CA unidade de filtro contendo membrana dentro de um 500 µ l tubo de microcentrífuga de polipropileno de capacidade.
Leitor de FluorescênciaBioTek BioTekSynergy 4 Hybrid Microplate Reader 
353072

Referências

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