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Artigo de método

VERDADEIRO silenciamento gênico: Triagem de um heptâmero tipo Guia de pequeno RNA Biblioteca de agentes terapêuticos potenciais Câncer

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DOI:

10.3791/53879

⸱

2 de junho de 2016

 ,  ,  , 
1Research Institute for Healthy Living, Niigata University of Pharmacy and Applied Life Sciences

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para o rastreio de uma biblioteca sgRNA tipo heptâmero para os potenciais drogas terapêuticas contra o câncer no sangue.

Resumo

Silenciamento do gene VERDADEIRO (denominado após tR Nase Z L - L tilizing e fficacious silenciamento do gene) é um do gene dirigida por ARN de silenciamento tecnologias, que utiliza uma pequena guia de ARN artificial (sgRNA) para guiar endorribonuclease processamento ARNt 3 ', tRNase Z L , para reconhecer um alvo de ARN. sgRNAs podem ser absorvidos pelas células sem quaisquer reagentes de transfecção e pode regular negativamente os seus níveis de RNA alvo e / ou induzir a apoptose em células cancerosas humanas. Temos rastreada uma biblioteca sgRNA contendo 156 sgRNAs do tipo heptâmero para o efeito sobre a viabilidade de células de mieloma e de leucemia humana, e descobriram que 20 deles pode eficientemente induzir a apoptose em pelo menos uma das linhas celulares de cancro. Aqui apresentamos um protocolo para o rastreio de uma biblioteca sgRNA tipo heptâmero para os potenciais drogas terapêuticas contra o câncer no sangue. O protocolo inclui a forma de construir a biblioteca sgRNA, a forma de avaliar o efeito de cada sgRNA sobre a viabilidade celular, e a forma de further avaliar os sgRNAs eficazes por citometria de fluxo. Cerca de 2000 acessos seria esperado para ser obtido por rastreio da biblioteca em grande escala sgRNA composto de 16.384 heptamers.

Introdução

Silenciamento do gene VERDADEIRO (denominado após tR Nase Z L - L e tilizing fficacious silenciamento do gene) é uma das tecnologias de silenciamento do gene dirigida por RNA 1. Esta tecnologia foi desenvolvida com base nas propriedades de tRNase Z L (ou 3 'tRNase), ARNt 3' endorribonuclease processamento: ela pode clivar qualquer ARN alvo em qualquer sítio esperado sob a direcção de um pequeno ARN guias artificiais (sgRNA) através do reconhecimento de uma pré-ARNt ou de tipo micro-pré-ARNt-como a estrutura formada entre o RNA alvo e a sgRNA 2-9. sgRNA, que normalmente é 7-31 nt de comprimento, é categorizada em quatro grupos, 5'-meia-ARNt, ARN heptâmero, ARN linear de 14 nt, e de ARN de gancho.

Temos demonstrado a eficácia de silenciamento de genes VERDADEIRO através da introdução de vários sgRNAs artificialmente projetados em células vivas 10-15. Também mostrámos que sgRNAs pode ser absorvida pelas células Without quaisquer reagentes de transfecção e pode regular negativamente os seus níveis de RNA alvo e / ou induzir a apoptose em células cancerosas humanas 16 - 18. Silenciamento de genes VERDADEIRO aparece para trabalhar no intracelular e sistema de rede de transcrição intercelular via tRNase Z L e sgRNAs naturais 19 - 21.

Construímos uma biblioteca sgRNA contendo 156 do tipo heptâmero sgRNAs para procurar potenciais sgRNAs do tipo heptâmero terapêuticas para cancros do sangue 22. Temos rastreados para que o efeito sobre a viabilidade de células de mieloma e de leucemia humana, e descobriram que 20 deles pode eficientemente induzir a apoptose em pelo menos uma das linhas celulares de cancro. E quatro deles foram mostrados para reduzir as taxas de crescimento de tumor em experiências de xenoenxerto de ratinho.

Aqui apresentamos um protocolo para o rastreio de uma biblioteca sgRNA tipo heptâmero para os potenciais drogas terapêuticas contra o câncer no sangue. O protocolo inclui comopara construir a biblioteca sgRNA, a forma de avaliar o efeito de cada sgRNA sobre a viabilidade celular, e a forma de avaliar ainda mais os sgRNAs eficazes por citometria de fluxo. Análise para ARN alvo celular da sgRNA e avaliação de sgRNAs eficazes em modelos de xenoenxerto de ratinho pode ser realizada de acordo com métodos convencionais 17,22, embora estes não estão incluídas no presente protocolo.

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Protocolo

1. Construção de um tipo de heptâmero sgRNA Biblioteca

  1. Selecionar um subconjunto dos 16.384 (4 7) sequências de 7 nt a menos que a biblioteca em grande escala deve ser construída.
    NOTA: As sequências podem ser aleatórios e / ou projetados para atingir RNAs celulares específicos. Para este último, encontrar estruturas em gancho de cabelo que se assemelha à do t-braço de ARNt num ARN alvo com o auxílio de um programa adequado de computador e / ou visualmente, e seleccione sequências complementares a sequências 7-nt imediatamente a jusante das estruturas em gancho de cabelo 4,10, 17,18.
  2. Sintetizar cada um dos heptamers seleccionados como um 2'-O totalmente -methylated, 5'- e 3'-ARN fosforilada com um sintetizador de ADN / ARN. Usar o método de fosforamidite sobre o vidro de poro controlado (CPG) de suporte, e deixar o 5'-terminal de 4,4'-dimetoxitritilo (DMT) no grupo protector no último ciclo (a adição de fosfato de 5 ') da síntese 23.
    NOTA: sy personalizadonthetic ARN pode também ser obtido a partir de fornecedores de oligonucleótidos.
  3. Após a conclusão do último ciclo de síntese, transferir a CPG com o oligonucleótido sintetizado a partir da coluna para um frasco de vidro com tampa de rosca-revestimento de Teflon, adiciona-se hidróxido de amónio a 1 ml de 29%, e incuba-se que a 55 ° C durante 8 h para clivar o oligonucleótido do CPG e remover os grupos protectores das bases e fosfatos.
  4. Evapora-se hidróxido de amónio com um evaporador centrífugo a 40 ° C e re-dissolve-se o oligonucleótido em 0,2 ml de 0,1 M de n-hexilamónio de etilo.
  5. Purifica-se o oligonucleótido sintético por meio de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa utilizando uma coluna de poliestireno-divinilbenzeno com um tampão contendo 10-50% de acetonitrilo / M de acetato de n-hexilamónio 0,1. Executar a coluna a 2,0 ml / min durante 25 min a 80 ° C.
  6. Adicionar 0,25-0,5 ml de ácido acético concentrado até a amostra fraccionado (1-2 mL) para fazer uma solução de ácido acético a 20%, e incubate esta solução durante 1 hora à temperatura ambiente para remover o grupo DMT.
  7. Seca-se a amostra com um evaporador centrífugo a 40 ° C, re-dissolve-lo em hidróxido de amónio a 1 ml de 29%, e incubar a solução durante 15 minutos à temperatura ambiente para remover a cadeia lateral de fosfato 5 '.
  8. Reduzir o volume (1 ml) da amostra de cerca de 0,3 ml com um evaporador centrífugo a 40 ° C.
  9. Dialisar toda a amostra concentrada contra água destilada (500 ml), utilizando um tubo de diálise com um peso molecular de corte de 1000 a 4 ° C durante a noite.
  10. Transfira a amostra dialisada a partir do tubo de diálise para um tubo de 1,5 ml com uma pipeta, secá-lo com um evaporador centrífugo a 40 ° C, e, subsequentemente, re-dissolvê-lo em água-para-injecção de nível de água, o volume da qual deve ser pequena o suficiente para fazer uma solução maior do que 100 uM.
  11. Medir uma densidade óptica da amostra de ARN a 260 nm com um espectrofotómetro e ajustar a sua concentração para 100uM por adição de água-para-injecção de nível de água. Guardar a solução de ARN a abaixo de -20 ° C antes da utilização.

2. Rastreio da Biblioteca sgRNA para a viabilidade celular

  1. Preparar 10 3 células / 99 ul / poço (por exemplo, HL60 e meio RPMI-8226) em um prato de 96 poços em meio RPMI-1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10% e solução de penicilina-estreptomicina a 1%. Prepare poços contendo os meios de comunicação apenas para a subtracção de fundo. Para eliminar os efeitos de borda, adicione água estéril para esvaziar poços que cercam os poços de amostra.
  2. Adicionar 1 ml de tipo heptâmero sgRNA (100 uM) dissolvido em água-para-injecção de nível de água a cada poço. Ensaiar cada sgRNA em triplicado. Incubar a placa a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 3 dias.
  3. Adicionar um volume apropriado de uma solução de WST-8 disponível comercialmente a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C no mesmo incubador durante 1-4 horas.
  4. Medir a absorvância at 450 nm com um leitor de microplacas.
    NOTA: Na maior parte dos casos, a linearidade entre a absorvância e o número de células viáveis ​​parece ser mantida a menos que o valor da absorvância superior a 1,0.

3. Avaliação da efectiva sgRNAs por citometria de fluxo

  1. Preparar 10 3 células / 99 ul / poço (por exemplo, HL60) em um prato de 96 poços em meio RPMI-1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10% e solução de penicilina-estreptomicina a 1%. Preparar pelo menos 10 poços para uma sgRNA a ser testado. Para eliminar os efeitos de borda, adicione água estéril para esvaziar poços que cercam os poços de amostra.
  2. Adicionar 1 ml de tipo heptâmero sgRNA (100 uM) dissolvido em água-para-injecção de nível de água a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 3 dias.
  3. Recolher as células tratadas com o mesmo sgRNA de pelo menos 10 poços para um tubo de 5 ml com uma pipeta. Girar o tubo durante 5 min numa centrífuga a 300 xg, e descartar os meios de comunicação.
  4. Adicionar 2 ml de 1x tampão fosfato salino (PBS) para o tubo, e re-suspender as células. Girar o tubo durante 5 min numa centrífuga a 300 xg, e descartar PBS. Adicionar 150 ul de 1x tampão de ligação da anexina V para o tubo, e re-suspender as células.
  5. Adicionar 2 mL de ficoeritrina (PE) -conjugated solução anexina V e 1 ul de solução de 7-aminoactinomycin D (7AAD) para o tubo, mistura-los bem, e incuba-se o tubo durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Analisar a amostra usando um citômetro de fluxo 24.

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Resultados

Os seis tipo heptâmero sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), e 5'-CACCAGC-3' (H13260) foram sintetizados quimicamente como 2'-O-metil ARN contendo 5'- e 3'-fosfatos.

Estes sgRNAs foram examinados quanto aos efeitos sobre a viabilidade de uma linha celular de leucemia humana...

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Discussão

Na maioria dos casos, os sgRNAs do tipo heptâmero totalmente 2'-O-metilados, 5' e 3'-fosforilados dissolvidos em água para injeção (na concentração de 100 μM) parecem ser estáveis abaixo de -20 ° C por pelo menos um ano, a julgar por sua atividade para induzir apoptose em células cancerígenas. No entanto, sua estabilidade mudaria dependendo de sua sequência, qualidade e pureza. Em alguns casos, o fosfato 5 'ou 3' de uma parte das moléculas de sgRNA parece ser removido espontaneamente durante o armazenamento, a j...

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Divulgações

A Universidade de Farmácia e Ciências da Vida Aplicadas de Niigata tem um pedido de patente pendente em um subconjunto dos sgRNAs do tipo heptamer.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Transferência adaptável e Seamless Tecnologia através de I & D, o Japão Agência de Ciência e Tecnologia, Fundo de Promoção de pesquisa da ciência da Corporação de Promoção e Ajuda Mútua para Escolas Particulares do Japão Target-driven, e os números JSPS KAKENHI Grant 24300342 e 15H04313 .

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cartucho de Preparação HC OligoSepNippon Bioservice Nippon Bioservice
personalizado99-3860
Água para injeção grau ÁguaOtsuka Pharmaceutical 7131400A2129
RPMI-1640 médioWako189-02025
Soro bovino fetalSIGMA-ALDRICH172012-500ML
Solução mista de penicilina-estreptomicinaNacalai Tesque26253-84
Placa de 96 poçosGreiner Bio-one655 Kit de contagem de 180
células-8DOJINDO343-07623WST-8 solução
Leitor de microplacas, Sunrise Thermo RC-RTEKAN510-82851
FACS Tubo de fundo redondoBD Falcon60819-820
Solução salina tamponada com fosfatoSIGMA-ALDRICHP7059-1L
PE Anexina V Tampão de ligaçãoBD Biosciences51-66121E
PE Anexina VBD Biosciences51-65875X
Citômetro de fluxo 7AADSIGMA-ALDRICHA9400-1MG
, FACSCaliburBD Biosciences342973

Referências

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  7. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
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  9. Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
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  23. Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
  24. FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
  25. Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729(2014).

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