Aqui apresentamos um protocolo para o rastreio de uma biblioteca sgRNA tipo heptâmero para os potenciais drogas terapêuticas contra o câncer no sangue.
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Artigo de método
VERDADEIRO silenciamento gênico: Triagem de um heptâmero tipo Guia de pequeno RNA Biblioteca de agentes terapêuticos potenciais Câncer
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Silenciamento do gene VERDADEIRO (denominado após tR Nase Z L - L tilizing e fficacious silenciamento do gene) é um do gene dirigida por ARN de silenciamento tecnologias, que utiliza uma pequena guia de ARN artificial (sgRNA) para guiar endorribonuclease processamento ARNt 3 ', tRNase Z L , para reconhecer um alvo de ARN. sgRNAs podem ser absorvidos pelas células sem quaisquer reagentes de transfecção e pode regular negativamente os seus níveis de RNA alvo e / ou induzir a apoptose em células cancerosas humanas. Temos rastreada uma biblioteca sgRNA contendo 156 sgRNAs do tipo heptâmero para o efeito sobre a viabilidade de células de mieloma e de leucemia humana, e descobriram que 20 deles pode eficientemente induzir a apoptose em pelo menos uma das linhas celulares de cancro. Aqui apresentamos um protocolo para o rastreio de uma biblioteca sgRNA tipo heptâmero para os potenciais drogas terapêuticas contra o câncer no sangue. O protocolo inclui a forma de construir a biblioteca sgRNA, a forma de avaliar o efeito de cada sgRNA sobre a viabilidade celular, e a forma de further avaliar os sgRNAs eficazes por citometria de fluxo. Cerca de 2000 acessos seria esperado para ser obtido por rastreio da biblioteca em grande escala sgRNA composto de 16.384 heptamers.
Introdução
Silenciamento do gene VERDADEIRO (denominado após tR Nase Z L - L e tilizing fficacious silenciamento do gene) é uma das tecnologias de silenciamento do gene dirigida por RNA 1. Esta tecnologia foi desenvolvida com base nas propriedades de tRNase Z L (ou 3 'tRNase), ARNt 3' endorribonuclease processamento: ela pode clivar qualquer ARN alvo em qualquer sítio esperado sob a direcção de um pequeno ARN guias artificiais (sgRNA) através do reconhecimento de uma pré-ARNt ou de tipo micro-pré-ARNt-como a estrutura formada entre o RNA alvo e a sgRNA 2-9. sgRNA, que normalmente é 7-....
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Protocolo
1. Construção de um tipo de heptâmero sgRNA Biblioteca
- Selecionar um subconjunto dos 16.384 (4 7) sequências de 7 nt a menos que a biblioteca em grande escala deve ser construída.
NOTA: As sequências podem ser aleatórios e / ou projetados para atingir RNAs celulares específicos. Para este último, encontrar estruturas em gancho de cabelo que se assemelha à do t-braço de ARNt num ARN alvo com o auxílio de um programa adequado de computador e / ou visualmente, e seleccione sequências complementares a sequências 7-nt imediatamente a jusante das estruturas em gancho de cabelo 4,10, 17,18. - Sintetizar cada um dos heptamers s....
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Resultados
Os seis tipo heptâmero sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), e 5'-CACCAGC-3' (H13260) foram sintetizados quimicamente como 2'-O-metil ARN contendo 5'- e 3'-fosfatos.
Estes sgRNAs foram examinados quanto aos efeitos sobre a viabilidade de uma linha celular de leucemia humana.......
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Discussão
Na maioria dos casos, os sgRNAs do tipo heptâmero totalmente 2'-O-metilados, 5' e 3'-fosforilados dissolvidos em água para injeção (na concentração de 100 μM) parecem ser estáveis abaixo de -20 ° C por pelo menos um ano, a julgar por sua atividade para induzir apoptose em células cancerígenas. No entanto, sua estabilidade mudaria dependendo de sua sequência, qualidade e pureza. Em alguns casos, o fosfato 5 'ou 3' de uma parte das moléculas de sgRNA parece ser removido espontaneamente durante o armazenamento, a j.......
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Divulgações
A Universidade de Farmácia e Ciências da Vida Aplicadas de Niigata tem um pedido de patente pendente em um subconjunto dos sgRNAs do tipo heptamer.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Transferência adaptável e Seamless Tecnologia através de I & D, o Japão Agência de Ciência e Tecnologia, Fundo de Promoção de pesquisa da ciência da Corporação de Promoção e Ajuda Mútua para Escolas Particulares do Japão Target-driven, e os números JSPS KAKENHI Grant 24300342 e 15H04313 .
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cartucho de Preparação HC OligoSep | Nippon Bioservice Nippon Bioservice | ||
| personalizado | 99-3860 | ||
| Água para injeção grau Água | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 médio | Wako | 189-02025 | |
| Soro bovino fetal | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Solução mista de penicilina-estreptomicina | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| Placa de 96 poços | Greiner Bio-one | 655 Kit de contagem de 180 | |
| células-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solução |
| Leitor de microplacas, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Tubo de fundo redondo | BD Falcon | 60819-820 | |
| Solução salina tamponada com fosfato | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Anexina V Tampão de ligação | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Anexina V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| Citômetro de fluxo 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| , FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
Referências
- Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversi....
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Reimpressões e permissões
