Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

Resumo

Atualmente, a maioria dos indicadores de cálcio disponíveis são usados para quantificar transientes citoplasmáticos de cálcio como medidas indiretas de cálcio liberado do retículo sarcoplasmático em células musculares lisas cultivadas. Este protocolo descreve o uso de um indicador específico baseado em FRET que permite a medição direta de sinais de cálcio dentro do lúmen do retículo sarcoplasmático.

Resumo

A manutenção dos níveis de cálcio no estado estacionário (Ca²⁺) no retículo sarcoplasmático (RS) das células musculares lisas vasculares (VSMCs) é vital para sua saúde geral. Uma porção significativa do conteúdo intracelular de Ca²⁺ é encontrada nos estoques de SR em VSMCs. Como a única organela intracelular com uma estreita associação com o espaço extracelular circundante através das junções SR da membrana plasmática, a SR pode ser considerada como constituindo a primeira linha de resposta a qualquer irregularidade nos transientes de Ca²⁺ ou estresse experimentado pela célula. Entre suas muitas funções, uma das mais importantes é seu papel na transmissão de sinais regulados por Ca²⁺ em toda a célula para induzir outras reações em toda a célula a jusante. O uso mais comum de indicadores citoplasmáticos de Ca²⁺ a esse respeito é geralmente insuficiente para a pesquisa sobre as mudanças altamente dinâmicas no armazenamento intraluminal de SR Ca²⁺ que ainda não foram totalmente caracterizadas. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a medição direta e clara do SR luminal Ca²⁺. Esta ferramenta é útil para investigar as mudanças sutis no SR Ca²⁺ que têm efeitos subsequentes significativos na função normal e na saúde da célula. Flutuações no conteúdo de SR Ca²⁺ especificamente podem nos fornecer uma quantidade significativa de informações relativas às respostas celulares a doenças ou condições de estresse experimentadas pela célula. Neste método, uma versão modificada de um indicador de Ca²⁺ direcionado a SR, D1SR, é usada para detectar flutuações de Ca²⁺ em resposta à introdução de agentes em células musculares lisas aórticas de ratos cultivadas (SMCs). Após a incubação com o indicador D1SR, a microscopia de fluorescência confocal e a imagem baseada em transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) são usadas para observar diretamente as alterações nos níveis intraluminais de Ca²⁺ sob condições de controle e com a adição de agentes agonistas que funcionam para induzir o movimento intracelular de Ca²⁺.

Introdução

^{Ca2 +} é um ião muito importante encontrada em abundância no interior de cada célula única no corpo. Ele tem papéis importantes em muitas funções celulares diferentes, incluindo o crescimento, proliferação, migração, e apoptose ^1-4. Está bem estabelecido que Ca ²⁺ pode afetar estes processos através de acções directas e indirectas, e, portanto, alterações nas concentrações intracelulares normais deste íon pode facilmente resultar em consequências negativas para as células afetadas. O SR é considerado como o maior de ^{Ca2 +} intracelular no interior da célula da loja ^5. Níveis estáveis ​​de Ca ^2+, tanto no....

Protocolo

declaração de ética: Todos os experimentos e os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes Laboratório de Biossegurança da Universidade de British Columbia, Vancouver, Canadá.

1. Preparação de 35 placas de cultura mm com fundo de vidro para sistemas baseados em FRET microscopia confocal

1. Preparar as placas utilizando o seguinte procedimento 36-48 horas antes das experiências.
2. Recuperar mistura gelatinosa proteína escolhida e 0,25% de tripsina-EDTA a partir de -20 ° C de armazenamento e mantê-los num banho de gelo até à sua utilização móvel.
   NOTA: A mistura de proteína de revestimento só deve ser exposto à temperatura....

Resultados

Esta secção fornece exemplos de resultados que podem ser obtidos usando o método descrito para capturar dados de concentração de SR Ca ²⁺ luminais, em comparação com a forma geralmente empregues de medir indirectamente a alterações organelo Ca ²⁺ concentrações armazenar observando flutuações em Ca ²⁺ citoplasmático .

A Figura 1A mostra um instantâneo de uma região de interesse .......

Discussão

Este protocolo descreve a transfecção de VSMC com o adenovírus D1SR para estudar as concentrações ^{de Ca2 +} no interior do lúmen da SR. Este método permite a medição directa do ^{Ca2 +} neste organelo, bem como o seu movimento para dentro / para fora da SR, como resultado da aplicação de diferentes agentes de movimento de cálcio. Este método tem muitas vantagens para os investigadores que trabalham no sentido de uma compreensão abrangente de como as mudanças para o SR e citoplasmáticos níveis de Ca

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (alta glicose, piruvato)	Tecnologias de vida	11995-065	Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduzido, 5 ml	Corning	356230	Mantenha a -20 ° C até logo antes do uso
Soro de bezerro recém-nascido	Sigma-Aldrich		Mantenha a -20 &graus; C até logo antes
do uso Placas com fundo de vidro de 35 mm	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μ M frasco de vedação de plugue azul ventilado	BD Falcon	353136
Solução de tripsina / EDTA	Tecnologias de vida	25200056	Mantenha a -20 ° C até logo antes do uso
Tubo cônico de polipropileno de 50 ml	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Presente
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Mantenha em -20 ° C até logo antes
do uso Tubos de microcentrífuga pretos de 1,5 ml	Argos Technologies	T7100BK
Microscópio confocal Leica TCS SP5	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (com aplicativo FRET SE Wizard)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.