Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

Summary

O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de desenvolvimento de órgãos em embriões de peixe-zebra, usando um microscópio de dissecação de fluorescência capazes de realizar seccionamento óptico e estratégias simples de reajuste para corrigir desvio focal e planar.

Abstract

A fim de compreender a organogénese, as alterações espaciais e temporais que ocorrem durante o desenvolvimento de tecidos necessitam de ser gravado. O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de desenvolvimento normal e deficiente renal em embriões de peixe-zebra, utilizando um microscópio de fluorescência de dissecação equipado para iluminação estruturada e aquisição de z-stack. Para visualizar nefrogênese, peixes-zebra transgénicos (Tg (wt1b: GFP)) foram utilizadas estruturas renais com fluorescente etiquetado. Defeitos renais foram provocados por injecção de um oligonucleótido anti-sentido morfolino contra o wt1a gene de tumor de Wilms, um factor conhecido por ser crucial para o desenvolvimento do rim.

A vantagem da configuração experimental é a combinação de um microscópio de zoom com estratégias simples para os movimentos de ajuste re-em x, y ou z direção sem equipamento adicional. Para contornar deriva focal que é induzido por variações de temperatura e vibrações mecânicas, Uma estratégia de focagem automática foi aplicado em vez de utilizar uma câmara ambiental normalmente exigido. A fim de voltar a ajustar as mudanças de posição devido a um xy-drift, foram empregados câmaras de imagem com grades de realocação estampado.

Em comparação com configurações mais complexas para a gravação de lapso de tempo com seccionamento óptico, tais como varredura a laser confocal ou microscópios folha de luz, um microscópio zoom é fácil de manusear. Além disso, oferece dissecando benefícios específicos do microscópio, como alta profundidade de campo e uma distância de trabalho estendida.

O método para estudar a organogénese aqui apresentada também pode ser usado com microscópios de fluorescência estéreo não capazes de seccionamento óptico. Embora limitado para high-throughput, esta técnica oferece uma alternativa aos equipamentos mais complexa, que é normalmente utilizado para a gravação de lapso de tempo de tecidos em desenvolvimento e dinâmica de órgãos.

Introduction

Seguindo a gastrulação, organogênese é o próximo estágio do ciclo de vida de um indivíduo. Trata-se o rearranjo, interacção e, muitas vezes, a migração de células para a produção de tecidos e órgãos. Imprecisão nos processos subjacentes ao desenvolvimento de órgãos, muitas vezes leva a doenças que podem se manifestar imediatamente ou também mais tarde na vida. Assim, a compreensão organogênese tem sido um grande esforço na biologia do desenvolvimento e investigação biomédica. A fim de poder investigar o desenvolvimento de um órgão em particular, tem que ser visível até mesmo através da parede do corpo do embrião. Isto permite a gravação das alterações espaciais e temporais que ocorrem durante o desenvolvimento. Além disso, a fim de analisar a importância de fatores envolvidos na organogênese, ele precisa ser suscetíveis à manipulação.

Um organismo que é extremamente adequado para a investigação de organogênese in vivo é peixe-zebra. sua transparrência durante o desenvolvimento embrionário, em combinação com a utilização de linhas transgénicas fluorescentes permite a observação da localização da proteína de expressão e dinâmica, bem como a visualização dos órgãos internos ^1. Isto proporciona uma vantagem única sobre a investigação do desenvolvimento dos órgãos em tempo real, em comparação com modelos de mamíferos cujos órgãos são inacessíveis para análise microscópica. Além disso, diferentes ferramentas estão disponíveis para manipular o desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Para além da geração de linhas mutantes, os oligonucleótidos anti-sentido de morfolino (MO) pode ser usada para knockdown da actividade de genes particulares que estão envolvidas no desenvolvimento de certos órgãos. MOs segmentar um local de união ou a translação códon de iniciação (AUG) e, assim, interferir com splicing de pré-mRNA ou a tradução.

O rim de embrião de peixe-zebra, os pronephros, é um modelo anatomicamente simples, mas valiosa para estudar o desenvolvimento renal ea função do genes relacionadas com doenças renais ^2. É composto por apenas duas unidades funcionais chamadas néfrons. Cada néfron consiste de um glomérulo, onde filtração do sangue tem lugar ^3. Outros componentes são a região pescoço curto, bem como do túbulo segmentada para a secreção e reabsorção dos solutos e a conduta, que termina na cloaca ^4. Independentemente da sua composição simples, a organização e os diferentes tipos de células do pronephros de peixe-zebra são muito semelhante a um rim de mamífero ^5,6.

Um factor, que é criticamente envolvido no desenvolvimento do rim, é codificada pelo gene supressor do tumor de Wilms WT1 ^7. Zebrafish possuem dois paralogs chamados wt1a e wt1b ser expresso em um padrão idêntico de sobreposição, mas não durante o desenvolvimento dos pronephros ^8. Usando peixes-zebra transgénicos com estruturas pronephros marcado com GFP, foi demonstrado que knock-down completa de wt1a </ em> ou de uma forma de emenda específica leva a malformações graves ou leves de rim embrionário, respectivamente ^9,10.

O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de nefrogênese normal e deficiente em embriões de peixe-zebra, empregando um microscópio de fluorescência de dissecação equipado para corte óptico através de iluminação estruturada. secções ópticas em geral permitem a aquisição de imagens que só contêm informações em foco. Fora de foco informação pode ser evitado por várias abordagens, tais como algoritmos matemáticos (eg.) De desconvolução, desenho óptico (por exemplo, de microscopia confocal de varrimento laser) ou uma combinação de ambos (por exemplo, a iluminação estruturada).

Para induzir defeitos no desenvolvimento do rim foi utilizado um anti-sentido contra MO wt1a que foi injectado em uma linha de peixes-zebra transgénicos (Tg (wt1b: GFP)). Esta linha mostra GFP-fluorescência no glomérulo, pescoço e o anteriorparte do túbulo ^9,10. Em comparação com configurações mais complexas para as gravações time-lapse com seccionamento óptico, como a digitalização a laser ou microscópios folha de luz, um microscópio zoom é fácil de manusear e menos dispendioso. Além disso, Equipamento de iluminação estruturada pode ser facilmente combinado com equipamento convencional de fluorescência (por exemplo, a fluorescência da lâmpada, filtros) e ofertas de dissecação vantagens específicas do microscópio, como uma distância de trabalho prolongada e grande campo de visão. Problemas com tração foram resolvidos sem o uso de equipamento adicional (câmara ambiental, mesa de anti-vibração) geralmente necessária para obter resultados estáveis. Para corrigir o desvio de foco uma estratégia de foco automático foi estabelecido e câmaras de imagem com grades de realocação impressos foram utilizados para reajustar o posicionamento seguindo um desvio na direção x ou y.

O método apresentado pode também ser aplicado para microscópios ópticos sem opções de seccionamento, tais como fluorescência estéreo microscopes e oferece uma alternativa aos equipamentos mais complexa, que é normalmente utilizado para a gravação de lapso de tempo de tecidos em desenvolvimento e dinâmica de órgãos.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os "Princípios de cuidados com animais de laboratório", bem como para a versão atual da lei alemã sobre a Protecção dos Animais.

1. Preparação de anti-sentido-morfolino (MO)

1. Para preparar uma solução-mãe 3 mM MO, adicionar 100 ul de água estéril, ultrapura ao MO liofilizado (300 nmol em frasco de vidro). Para a dissolução completa, aquecer a solução de reserva a 65 ° C durante 5 min. Fecha-se o frasco com Parafilm e armazenar a solução estoque MO à temperatura ambiente (TA). Não refrigerar a solução estoque de MO porque isso poderia causar uma associação da MO com as paredes do frasco.
2. Preparar uma solução de trabalho MO 1 mM por diluição da solução de reserva com MO estéril, água ultrapura e adicionar uma solução a 0,5% de vermelho de fenol para uma concentração final de 0,05%.
   1. Para obter 10 ul de uma solução de trabalho MO, adicionar 3,3 mL da solução de MO e 1 ul de solução de vermelho de fenol 0,5% para 5,7 ul de água. Estartona preparação de um novo lote de solução de trabalho de aquecer a solução de MO a 65 ° C durante 5 min.
3. Antes de usar, centrifugar a solução de trabalho de MO para evitar o entupimento da agulha. Por exemplo, girar 10 ul da solução de MO a 15.000 xg durante 5 min (RT) e remover 8 ul de sobrenadante para injecção.
   NOTA: Perda de atividade pode ocorrer em soluções morfolino ao longo do tempo ^11. Para excluir esta, pode-se testar as soluções por espectrometria de UV, seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. No caso dos wt1a utilizados morfolino uma eficácia reduzida não foi observada ao longo de um longo período de armazenamento (solução de trabalho 3 mM foi armazenado por mais de um ano).

2. Configurar Pairs acasalamento e Recolha de ovos fertilizados

1. A tarde antes de microinjeção, criou cinco pares de Tg (wt1b: GFP) de linha, cada um em um recipiente de reprodução equipado com uma peneira removível para separarmachos e fêmeas durante a noite.
   NOTA: Para garantir que os ovos suficientes estão disponíveis para um experimento de injeção de sucesso, peixes utilizados como pares de acasalamento deve ter sido pré-selecionados e avaliados como bons "produtores".
2. Na manhã seguinte, depois de as luzes se acendem, colocar o macho ea fêmea juntos acima da peneira que impede o peixe de comer os seus ovos.
3. Assista a desova. Uma vez que uma quantidade de ovos são postos que podem ser injectados antes da fase de 4-célula é atingido (aproximadamente 50), separado do macho fêmea novamente. Transferir os ovos com uma pipeta de Pasteur numa placa de Petri cheia de água embrião para um primeiro ciclo de injecção. Para obter rodadas adicionais de ovos, coloque um par de acoplamento juntos e em separado várias vezes.

3. Trabalhos preparatórios para microinjeção

NOTA: Execute os passos 3.1 e 3.2 com antecedência.

1. Para preparar um prato que mantém os embriões em posição durante a injecção (prato microinjeção) inserir um glslides ass em um ângulo de 40-45 ° em um prato de 94 milímetros Petri preenchido com líquido transparente puro, silício, de qualidade alimentar. Remover a corrediça quando o silício está endurecido. Isso produz uma ranhura na camada de silício.
   NOTA: Como alternativa, utilizar 1,5-3% de agarose em vez de silício e armazenar o prato a 4 ° C.
2. Gerar agulhas de injecção de capilares de vidro com um extrator de agulhas.
   1. Use capilares que contêm filamentos internos.
      NOTA: O filamento irá contribuir para transportar a solução de MO na direcção da ponta da agulha após enchimento (ver 3.3).
   2. Estabelecer as configurações apropriadas no extrator de agulhas. Bons agulhas para injeção em peixes-zebra deve ter longas e finas dicas ^12. Gerar pontas com um comprimento de aproximadamente 10 mm e um diâmetro de 1,5-2 uM no seu fim. Por exemplo, usar um extrator de agulhas horizontal com as seguintes configurações: Calor = 330, Pull = 0, Velocidade = 40, Time = 100.
   3. Examinar a qualidade das agulhas sobdissecando microscópio e resolver aqueles com dicas curtas ou muito longas.
      NOTA: Agulhas com pontas curtas tendem a danificar o embrião enquanto tal, com muito longas e finas dicas curva ao tocar o córion e não penetrar.
3. Aterrar a agulha com 2 mL de solução de trabalho MO usando uma ponta microloader e inseri-lo no suporte da agulha do aparelho de microinjeção.
4. Como as agulhas estão fechados na extremidade da ponta, gerar uma abertura por beliscar para trás o fim da agulha com uma pinça afiada sob o microscópio de dissecação. Como alternativa, use o aparelho de microinjeção para empurrar delicadamente a ponta de uma superfície rígida (ex. Bloco pequeno de metal ou de trás de uma pinça).
5. Calibra-se o volume de injecção, injectando a solução de trabalho de MO em uma gota de óleo mineral colocado sobre uma retícula. Ajustar a duração da injecção para produzir um diâmetro de gota de 75 um até se obter um volume de injecção de cerca de 200 pl.

4. microinjeção Procedimento

1. Dispor os embriões em fase 1 de células ao longo do sulco do prato de microinjecção com o pólo vegetal para a direcção de onde vem a agulha (para o ângulo de 45 ° da ranhura).
2. Perfurar a córion e a gema com a agulha e injectar 200 ul da solução de trabalho 1 MO mM (0,2 pmol) na gema de 1- embriões de duas células.
3. Usando uma pipeta de Pasteur com uma abertura larga, recolher todos os embriões injectados numa placa de Petri cheia de água embrião e incubar a 28,5 ° C.
4. Na parte da tarde, remover embriões mortos usando uma pipeta Pasteur com uma grande abertura e substituir a água embrião.

5. Preparação de embriões para In vivo Imaging

1. Na manhã seguinte, substituir a água embrião embrião com água contendo 0,003% de N-feniltioureia (PTU) para inibir a melanização. Não aplicar PTU antes do final da gastrulação porque interferes com o desenvolvimento embrionário precoce.
   CUIDADO: PTU é tóxico e teratogênico. Usar luvas em todos os momentos e evitar inalação e contato com a pele.
2. Dechorionate os embriões com pinças cortantes sob um microscópio de dissecção no estádio de desenvolvimento desejado. Agarrar o cório com um par de pinças e tentar agarrar do outro lado do cório com um segundo par de pinças. Retire cuidadosamente as pinças em direções opostas sem interromper o embrião.
3. Anestesiar o embrião, substituindo a água que contém o PTU embrião (0,003%) com água contendo embrião PTU (0,003%) e 0,02% Acetato de metanossulfonato de 3-aminobenzoato de metilo (tricaina).
4. Incorporar o embrião em baixa temperatura de fusão agarose em um μ-prato de fundo lamela com uma grade de deslocalização 50 mm. incorporação adequada requer alguma prática.
   1. Preparar alíquotas de 1 ml de 0,7% de agarose em 1,5 ml tubos de reacção e colocá-los em um bloco de ajuste de calor a 36 ° C. Usar uma pipeta Pasteur com ampla abertura em Transfer do embrião para o μ-prato. Retire a água de embriões em excesso, utilizando uma pipeta Pasteur com ponta ultra-fino e sobrepor o embrião com agarose temperado.
   2. Enquanto a agarose ainda é líquida, orientar o embrião com duas pontas de carregadora gel na posição desejada, no que diz respeito à estrutura de interesse, bem como a distância à rede relocalização. Coloque a estrutura de interesse (aqui os pronephros) o mais próximo possível para o fundo de vidro (aqui: dorsal para baixo), e em proximidade à rede.
   3. Para uma qualidade de imagem óptima minimizar a camada de agarose entre o embrião e o fundo de vidro através da colocação da estrutura de interesse do embrião tão próximo quanto possível do fundo. Além disso, localize o embrião em estreita proximidade com a grade, mas tome cuidado para que a grade não irá se sobrepor com a estrutura de interesse. Incorporar 3-4 embriões em diferentes u-pratos cada e utilize aquele que está posicionado melhor.
   4. Quando a agarose é difícil o suficiente para manter a espera de embriões para 2-3 Min e sobrepor o embrião incorporado com água embrião contendo 0,003% PTU e 0,02% tricaina. Decantar a água embrião excesso ou removê-lo usando uma pipeta Pasteur com ponta ultra-fina. Fechar a tampa do μ-prato na posição de bloqueio para evitar a evaporação.
      NOTA: Evite a ocorrência de bolhas de ar na μ-prato, como eles poderiam prejudicar a gravação de imagem.

6. Microscopia

NOTA: Use um microscópio equipado para corte óptico através de iluminação estruturada. gravar imagens com um software que contém os seguintes módulos: Multicanal, Z-stack, Série Time, Software autofoco e Extensão Foco.

1. Aquisição de Z-stacks
   1. Inverter o μ-prato. O fundo de vidro agora está voltada para o objetivo e o μ-prato serve como uma câmara de imagem.
   2. Alternar o controle deslizante para a posição de rede e activar o modo de iluminação estruturada nos controles de software.
   3. Calibraro foco da grade para o canal (s) de escolha com a amostra a ser analisada (embrião incorporado), seguindo as instruções do assistente de calibração Focus.
   4. Ative o modo de aquisição z-Stack e configurá-lo para o modo de centro. Concentre-se no meio da amostra e defini-la como plano central da pilha z- clicando Center. Definir a dimensão do Z-pilha, definindo o intervalo em torno da posição central.
      NOTA: estruturas de objetos não deve ser visto nitidamente fora o primeiro eo último plano do z-stack.
   5. Ajustar o espaçamento entre as secções ópticas. Para melhor resolução z clique no botão Optimal. Com base na profundidade de campo objectivos do software irá definir uma distância recomendada seguindo o critério de Nyquist (50% de sobreposição).
      NOTA: Se apontando para tamanhos de arquivo menores e as licenças estrutura, definir um tamanho maior espaçamento manualmente. Definir etapas menores do que o recomendado apenas irá resultar em tamanhos de arquivos maiores sem aumentar mais tardeinformações ai.
2. Imagem de lapso de tempo
   1. Abra a ferramenta Time Series e defina o intervalo do experimento de séries temporais. Por exemplo gravar imagens Z-stack a cada 30 minutos ao longo de um período de 5 horas.
   2. Para corrigir o desvio de foco ao longo do tempo, criou uma estratégia de focagem automática. Verifique a caixa de diálogo estratégia de foco, selecione Software focagem automática a partir da lista drop-down e escolha o canal TL-Brightfield como canal de referência.
   3. Comece cada ponto de tempo com a focagem automática. A fim de assegurar uma gama de pesquisa confiável dentro de um prazo otimizado, definir um 200 um intervalo de procura fixa relativa. Esta gama está totalmente digitalizado (parâmetro Faixa de cobertura) com (parâmetro de qualidade) qualidade básica em um (parâmetro de amostragem) tamanho máximo etapa.
   4. Para aumentar a precisão do autofoco, ativar a medição dentro de uma região foco de interesse (foco ROI) ea posição disse ROI foco na janela de visualização ao vivo em torno da estrutura de interesse.
      NOTA: Seo sistema não tem o módulo de software de focagem automática que atualiza o centro z-position automaticamente durante a gravação de lapso de tempo, pausar o experimento em um determinado momento e ajustar o foco manualmente e continuar o experimento.
   5. Para compensar um potencial xy-drift durante a gravação de séries temporais, posicionar um ponto específico da grelha impressa (da câmara de imagem) na mira do software e salvar o posicionamento, fazendo uma captura de tela.
   6. Iniciar a experiência séries temporais. Antes de o intervalo de tempo de série é longo, fazer uma pausa na experiência e, se necessário, re-ajustar o posicionamento de acordo com a imagem. Continue com o experimento.

Processamento 7. Imagem

1. Alterne para a guia de processamento e selecione o Maior profundidade do foco (EDF) na caixa de diálogo Método. Desde secções ópticas são adquiridos, aplicar o algoritmo de máxima projeção para a série de imagem.
   NOTA: Aqui, o algoritmo irá projetar a brightest ou o pixel mais escuro da pilha para uma imagem 2D composto numa primeira fase e, eventualmente, usar aquele com a maior variância como uma imagem de resultado para cada ponto de tempo.
2. Use o método Filme Exportar para criar um lapso de tempo de filme (por exemplo avi ou mover arquivos) para fora da série de imagens EDF.

Results

microscopia de lapso de tempo é uma técnica poderosa para assistir processos biológicos dinâmicos durante um longo período de tempo. Um problema que ocorre frequentemente durante o lapso de tempo de imagem é um movimento na direcção X, Y ou Z, chamado de deriva, que é induzido por variações de temperatura e vibrações mecânicas. O método aqui apresentado permite a gravação de estruturas de fluorescente etiquetado em embriões de peixe-zebra ou larvas em um microscópio de dissecação, sem câmara ambiental e mesa de anti-vibração de lapso de tempo.

Para a compensação de xy-drift, o espécime foi incorporado em uma câmara de imagem com uma grade de deslocalização impressa (Figura 1). A localização de um ponto específico da grelha relacionadas com a mira da ferramenta de software foi utilizado para devolver o espécime para a posição pré-ajustada (Figura 2A). Os resultados apresentados foram obtidos usando um microscópio de zoomcom um controle deslizante integrado para seccionamento óptico através de iluminação estruturada (Figura 2B). Para a correção focal contínua, uma estratégia de foco automático foi estabelecido. Nesta estratégia, o foco automático software é usado para localizar o foco baseado em contraste máximo antes de cada ponto de tempo. Este plano focal assim definido é posteriormente definido como plano de centro para a aquisição z-stack. A fim de minimizar a fototoxicidade na amostra, o canal de luz transmitida de campo claro é utilizado como canal de refercia, uma vez que permite que os tempos de exposição suficientemente curtos durante o passo de focagem automática (Figura 2C).

O método foi aplicado para a análise comparativa do desenvolvimento renal em embriões morphant Control e wt1a de uma linha de peixes-zebra transgénicos (Tg (wt1b: GFP)). Durante nefrogênese no início desta linha mostra fluorescência verde na mesoderme intermediária, foram os progenitores renais surgem de ^9,10 e mais tardenos túbulos que formam e primórdios nefrónio (Figura 3).

Lapso de tempo de gravação de imagem revela que nefrogênese no controle de morfolino injetado embriões é inalterado em comparação com os não injectados (resultados não apresentados) e segue os passos descritos de desenvolvimento do rim zebrafish precoce ^3. Aos 20 HPF os túbulos pronephric em desenvolvimento são visíveis e nas suas extremidades anteriores, acumulações de células esféricas, que representam a formação dos primórdios nefrónio formação pode ser detectado. Durante as próximas horas, túbulos e primórdios néfrons crescer e, mais tarde, os primórdios começar a fundir-se na linha média (Figura 4, vídeo 2). Em contraste, nefrogênese é fortemente perturbado em embriões wt1a morphant. Embora as estruturas tubulares GFP positivas são visíveis em 20 hpf, eles parecem ser mais difusos e menos desenvolvida. Além disso, não há primórdios de nefrónios apropriadas foram formadas. A diferença mais marcante para tele controlar embriões neste ponto de tempo, no entanto, é o aparecimento de um grande número de células fluorescentes fora das pronephros em desenvolvimento (Figura 4, de vídeo 2). Posteriormente, estas células deixar o campo pronephric e migram ventralmente (vídeo 2).

Desenvolvimento do rim em embriões de controlo e morphants wt1a da linha transgénica wt1b foram comparadas anteriormente, tomando imagens em diferentes pontos de tempo fixos ^9,10. Em contraste com este método estático, gravação de lapso de tempo permite acompanhar a dinâmica de nefrogênese normal e misrouting de células progenitoras renais causadas pela depleção wt1a.

Figura 1: Esquema Ilustração de um embrião incorporado em uma Câmara Comercialmente Disponível com Relocation Grids. O prato temquatro redes, cada uma subdividida em uma distância de repetição de 50 mm, impresso em um fundo lamela de vidro. O embrião a ser trabalhada é incorporado cabeça para baixo, com a estrutura renal em estreita proximidade com um quadrado de observação, mas sem sobreposição com a rede. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2:. Os ajustes de Compensação de desvio na imagem Time-lapse e grade de projeção de iluminação estruturada uma posição distinta da rede de deslocalização foi trazido para o centro da imagem (marcado pela mira amarelo) e serve como um ponto de referência para mais tarde xy-alinhamento no caso de pequenos deslocamentos. O rectângulo vermelho representa a região de interesse (ROI) utilizados na estratégia de focagem automática (A). wa seccionamento ópticoss obtido por iluminação estruturada. A imagem mostra uma estrutura de grade projetada no plano focal após a calibragem correta (B). O ROI para a estratégia de foco automático (retângulo vermelho) está definido para cobrir estruturas embrionárias distintas altas em contraste (aqui somites) que permitem a focagem automática de confiança na estrutura de interesse (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: wt1b Transgénicos:. Embriões de GFP com fluorescência verde no desenvolvimento do rim sobreposições de dorsal (A) ou (B) a transmissão lateral e imagens de fluorescência são apresentados com o anterior para a esquerda. np, primórdio néfron; pt, túbulo pronephric; mais ou menosácaro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Knockdown de wt1a atrapalha o desenvolvimento de rim embrionário Representante, profundidade prolongado de imagens de foco a partir de gravações time-lapse.. No controle de morfolino embriões injetados, o desenvolvimento renal mostra o progresso normal com túbulos crescentes e primórdios nephron que começam a se fundir na linha média. Em contraste, morphants wt1a falhar para formar primórdio nefrónio adequada e uma quantidade enorme de células positivas para GFP estão fora do campo pronephric. (np, nephron primórdio; pt, túbulo pronephric). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar vídeo 1. gravação Time-lapse do desenvolvimento normal do rim no controle de morfolino embriões injetados. (Clique direito a download). O vídeo mostra como túbulos crescer e primórdios néfrons começam a se fundir. A partir de 20 hpf, imagens foram tiradas em intervalos de 30 min durante um período de 5 horas.

Suplementar Vídeo gravação 2. Time-lapse de nefrogênese perturbado em embriões wt1a morphant. (Clique direito a download). O vídeo mostra a migração de células positivas para GFP para fora da região pronephric. A partir de 20 hpf, as imagens foram tiradas em 30 min intervalos ao longo de um período de 5 horas.

Discussion

O peixe-zebra tornou-se um organismo modelo popular para estudos de desenvolvimento de vertebrados e modelagem de doenças humanas. Porque os embriões de peixe-zebra continuar a ser transparente, desenvolvimento órgãos como cérebro e do coração podem ser observados usando um microscópio preparação padrão. Aproveitando-se de linhagens transgênicas com fluorescência específica do órgão permite avaliações de organogênese em toda a diferentes estágios de desenvolvimento dentro de embriões vivos por microscopia de fluorescência. Uma limitação para a imagiologia detalhes estruturais de órgãos inteiros com microscopia de epifluorescência padrão é o impacto dos sinais de objectos acima e abaixo do plano focal. Esta luz fora de foco não só resulta em diminuição do contraste e resolução da imagem, ele também pode obscurecer estruturas importantes de interesse ^13,14. Várias técnicas como confocal- de varredura a laser, fiação confocal- disco ou microscopia multiphoton foram desenvolvidos para minimizar a informação para fora de foco e, assim increaso contraste da imagem e bem como a resolução axial. Um método alternativo para obtenção de cortes ópticos é a microscopia de iluminação laser e a digitalização sem estruturado, uma grande técnica de iluminação de campo com base que é e simples de implementar em um microscópio comum ^15. Os resultados aqui apresentados mostram que seccionamento óptico, alcançado pela iluminação estruturada, implementado em um microscópio de dissecação e combinada com a reconstrução de imagens de foco estendidos, permite a visualização de detalhes estruturais do normal e perturbado desenvolvimento renal no peixe-zebra. Em particular, as células positivas para GFP em morphants wt1a são dispersos em várias profundidades focais, e as imagens de um único plano com desfocagem do foco para fora-de- seria subestimar a complexidade tridimensional do fenótipo.

Para acompanhar a dinâmica do órgão organização, rearranjo ou interrupção, microscopia de lapso de tempo de fluorescência é um poderoso ainda que técnica complexa. Durante time-lapseimagiologia ligeiras vibrações ou oscilações de temperatura menores causar desvios na direção x, y ou z. Isto exige equipamento adicional (câmara ambiental, tabela anti-vibração), de modo a obter resultados estáveis. O método apresentado utiliza a capacidade de um microscópio de dissecação com uma unidade de foco motorizado para gravar imagens de lapso de tempo, sem dispositivos extras. Para manter um foco estável, uma estratégia de focagem automática e foi estabelecida uma grelha de deslocalização impressa na parte inferior da câmara de imagem foi usada para correcção de x, y instabilidade.

incorporação adequada do embrião é um passo crítico no âmbito do protocolo. Alguns prática é necessário para colocar a estrutura de interesse tão próximo quanto possível do fundo de vidro, e em proximidade à rede sem sobreposição com ela.

A principal vantagem do método é que ele é uma ferramenta simples e a preços acessíveis para a observação directa dos processos de desenvolvimento, tais como o crescimento e migração de estar emembriões durante várias horas. Além disso, os benefícios específicos do microscópio de dissecação, como grande campo de visão e distância de trabalho estendida facilitar o exame de amostras maiores, incluindo órgãos inteiros. No entanto, algumas limitações devem ser mantidos em mente. A pausa da experiência para verificar e reajustar o posicionamento faz com que o procedimento demorado e a ausência de um controlo de temperatura robusta altera o tempo de desenvolvimento "standard", o qual é definido como h após a fertilização a 28,5 ° C durante ¹⁶ peixes-zebra. Outro problema potencial é restrito a profundidade de processamento de imagem em que o animal, particularmente quando a estrutura de interesse está localizado dentro do embrião ou larvas. Uma tal estrutura é o glomérulo pronephric peixe-zebra, o qual está situado entre as somitos e do saco vitelino. A profundidade limitante para a imagiologia do glomérulo verificou-se ser cerca de 200 um, a uma distância que é atingido após 5 dias de desenvolvimento. Em contraste, as estruturas que são fluorescentes located mais perto da superfície do animal pode ser trabalhada durante mais tempo. Por exemplo células do fígado são acessíveis para geração de imagens, pelo menos, até 9 de dpf. Uma outra limitação é que a imobilização de longo prazo do embrião ou em larvas de agarose e tratamento tricaina induzir atraso do crescimento e do edema cardíaco, respectivamente. Uma vez que esta pode interferir com o desenvolvimento normal, recomenda-se a limitar a duração de gravação de lapso de tempo para um certo período de interesse. Para assegurar que durante a estruturas de imagiologia de interesse desenvolver-se normalmente que é útil para comparar (no final) a aparência geral com a de um animal mantido sob as mesmas condições experimentais, mas sem a incorporação e anestesiados.

Gravação de um z-stack de cortes ópticos a cada 30 minutos durante um período de 5 horas e subsequente cálculo da profundidade de foco imagens estendida fornecida informação espacial e temporal sobre os eventos iniciais do normal e perturbado desenvolvimento rim, que foi induzida bknockdown de wt1a y morfolino-mediada. Morfolino knockdown experimentos realizados previamente já mostraram que Wt1a cumpre um papel precoce e essencial na formação pronephros A hibridação in situ com o marcador renal ^17,18 eo emprego do wt1b transgênico:. Linha de GFP para o desenvolvimento pronephros de imagem em tempo fixo aponta ^9,10 revelado que os resultados da deficiência wt1a em morfogênese glomerular interrompido e não especificação podócitos. Em contraste com estas abordagens estáticos, gravações de lapso de tempo de visualizar directamente dinâmica nefrogênese precoce nos embriões de controlo e a migração de células positivas para GFP para fora da região em pronephric morphants wt1a. A possibilidade de controlar as células misrouted ao longo do tempo permite uma análise mais detalhada fenótipo.

Em geral, o método que é aqui apresentada fornece um método barato e fácil de usar alternativa para o complexo, e menos acessíveis SEtups normalmente utilizado para geração de imagens de lapso de tempo, como microscópio de varredura a laser (equipado com uma câmara ambiental e mesa de anti-vibração) ou folha de microscópio de luz. A rotina descrita para corrigir problemas de deriva pode também ser aplicado para realizar imagens de lapso de tempo sobre as configurações sem opções de seccionamento ópticos, como microscópios de fluorescência estéreo.

A técnica não só é adequado para investigar o desenvolvimento do rim, mas também pode ser aplicado para monitorizar morfogénese normal e deficiente de outros órgãos tais como o coração ou o fígado. Além disso, o método pode ser usado para observar vários processos mais dinâmicos em organismos embrionário e adulto modelo, tais como a cicatrização de feridas ou de regeneração.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Morfolino	, LLC	Controle padrão oligo	Preparado  Controle  oligo
wt1a Morfolinos	Gene tools, LLC	personalizado	Projetado para atingir o primeiro local doador de emenda, sequência conforme publicado na Ref. 9
0.5% Solução de fenol vermelho	Sigma	P0290	Rastreador de injeção
peqGOLD universal agarose	peqlab	35-1020	Para preparar prato de microinjeção
Capilares de vidro  (GC100F-10)	Hugo Sachs Elektronik	30-0019	Para gerar agulhas de injeção
Pontas de microcarregadeira	Eppendorf	5242956003	Para carregar a agulha de microinjeção
Pinça Dumont	Ferramentas Fine Sience	91150-20	Para gerar uma abertura na ponta da agulha
Água embrionária (solução 0,3x Danieaus&aguda)			1x: 58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO4,  0,6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Não adicione azul de metileno!
Retícula 5 mm/0,05 mm	Science Services	PY68039-02	Para cálculo da quantidade de injeção
Pipeta Pasteur 137 mm, 4,8 ml	Roth	E305.1	Para coletar ovos, transferir embriões e remover embriões mortos
Pipeta Pasteur com ponta ultrafina 157 mm, 3,5 ml	Roth	E304.1	Para remover o excesso de água
N-Feniltioureia (PTU)	Sigma	P7629	Para supressão da melanização
Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato (Tricaína)	Sigma	E10521	Para anestesiar peixe-zebra
Baixo ponto de fusão Agarose	Biozym	850111	Para incorporação
µ-dish 35 mm, high Grade de fundo de vidro-50	ibidi	81148	Câmara de imagem
Pontas de carregador de gel	Hartenstein	GS05	Para orientar o embrião para uma incorporação adequada
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
< strong>Equipamento
micropipetas (modelo P-97)	Instrumento		Para gerar agulhas de injeção
Micromanipulador	Saur Laborbedarf		Para microinjeção
Thermomixer copact	Eppendorf		Thermoblock para têmpera da agarose de baixo ponto de fusão
SZ61 (Estereomicroscópio)	Olympus		Para controle de injeção
Axio Zoom. V16	Zeiss		Para incorporação e imagem
ApoTome.2 slider	Zeiss		Para seccionamento óptico
AxioCam MRm	Zeiss		imagens
Software de imagem ZEN 2012	Zeiss