Segmentação de biofilme Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando resazurina Baseado Ensaio Drogas susceptibilidade

Resumo

A maioria das infecções bacterianas produz um biofilme. Em virtude de seu ambiente, as bactérias associadas ao biofilme são frequentemente fenotipicamente resistentes a medicamentos. Novas moléculas antibacterianas que matam bactérias em biofilmes são, portanto, uma alta prioridade. Estabelecemos um ensaio para rastrear rapidamente compostos antimicrobianos que são eficazes na erradicação de biofilmes.

Resumo

A maioria das bactérias patogênicas é capaz de formar biofilmes durante a infecção, mas devido à dificuldade de manipular e avaliar biofilmes, a grande maioria dos trabalhos de laboratório é realizada com células planctônicas. Aqui, descrevemos um ensaio de biofilme de placa de pino realizado com Staphylococcus aureus. Os biofilmes bacterianos são cultivados em pinos presos a uma tampa de placa de microtitulação de 96 poços, lavados por submersão suave em tampão e colocados em uma placa de provocação de drogas. Após a incubação subsequente, eles são novamente lavados e movidos para uma placa de recuperação final, na qual o corante fluorescente resazurina serve como indicador de viabilidade. Este ensaio oferece maior facilidade de uso, confiabilidade e reprodutibilidade, bem como uma riqueza de dados quando conduzido como uma leitura cinética. Além disso, este ensaio pode ser adaptado para uma abordagem de triagem de medicamentos de médio rendimento, pela qual uma leitura fluorescente final é feita, oferecendo um caminho para os esforços de descoberta de medicamentos.

Introdução

Micróbios patogênicos podem formar biofilmes in vivo que levam a infecções crónicas não agudos ^1. Infecções associadas aos biofilmes é um fator de risco grave de procedimentos médicos que envolvem a implantação de objetos estranhos (por exemplo, substitutos ósseos artificiais, implantes de mama) ou a instalação de tubos traqueais ou cateteres urinários ^2. Nestes contextos, a terapia anti-infecciosa é quase sempre necessário, como infecções baseados em biofilme raramente são apuradas por conta própria, mesmo em indivíduos imunocompetentes. Staphylococcus aureus é um dos patógenos mais frequentemente observadas implicado....

Protocolo

1. biofilme Iniciação

1. Crescer uma cultura de biofilme organismo produtor num meio rico em nutrientes. Inocular Staphylococcus aureus estirpe Newman, em 10 ml de meio de Mueller-Hinton a partir de um stock de glicerol. Realizar todos os trabalhos envolvendo a manipulação de S. aureus com luvas e dentro de um gabinete de biossegurança.
2. Incubar durante 16 horas a 37 ° C num agitador rotativo (100-200 rpm).
3. Determinar _DO600 da cultura utilizando um espectrofotómetro e uma cuvete padrão (comprimento do caminho: 1 centímetro).
4. Calcular o volume (V) de cultura necessário para preparar 20 ml de inoculo com....

Resultados

O ensaio resazurina é sensível o suficiente para detectar com segurança muito poucas células viáveis, capazes de se replicar em meio livre de drogas após o desafio. Nesta metodologia, define-se a concentração mínima de biofilme erradicação como a concentração mais baixa à qual nenhuma conversão resazurina é observada após 24 h. O ensaio baseia-se resazurina em moléculas oxidativos encontrados em células metabolicamente activas, que convertem a cor do corante de azul para rosa. conversão .......

Discussão

Aqui, nós descrevemos um ensaio de biofilme modificado para determinar a actividade de inibidores testados em S. biofilmes aureus com foco no estado metabólico das células do biofilme associado. Enquanto a iniciação biofilme descritos e procedimentos de desafio recomendações do fabricante principalmente imitava, a utilização de resazurina corante para detectar e quantificar células associada-biofilme que sobrevivem a um desafio inibidor 24 h simplifica significativamente o procedimento recomendado de r.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Siga as recomendações do fabricante
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 médio quelexo por 1 hora com resina Chelex 100 e depois suplementado com 10% não chelado RPMI-1640
Chelex 100 Resina	Bio Rad	142-2822
MBEC-placas	Innovotech	19111
Sal de Sódio Resazurin	Sigma	R7017	800 µ g/ml em água DI        Plataforma de
Agitação de Micro Placas	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Software Biotek
Gen5	Biotek		Gravação e análise da conversão de resazurina
Neocuproine		Sigma N1501	prepare o estoque de 10 mM em 100% de etanol, armazene a -80 º C
Sulfato de cobre	Acros Organics	7758-99-8	prepara uma solução estoque de 100 mM em água, armazena a 4 º C
-Neocuproine	Self-Made		Gerado pela mistura de molaridades iguais de neocuproína e sulfato de cobre. A mistura foi diluída em meio CRPMI até a concentração desejada.
Gentamicina	Sigma	G3632-1G

Estéril de Filtro