Segmentação de biofilme Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando resazurina Baseado Ensaio Drogas susceptibilidade

Resumo

A maioria das infecções bacterianas produz um biofilme. Em virtude de seu ambiente, as bactérias associadas ao biofilme são frequentemente fenotipicamente resistentes a medicamentos. Novas moléculas antibacterianas que matam bactérias em biofilmes são, portanto, uma alta prioridade. Estabelecemos um ensaio para rastrear rapidamente compostos antimicrobianos que são eficazes na erradicação de biofilmes.

Resumo

A maioria das bactérias patogênicas é capaz de formar biofilmes durante a infecção, mas devido à dificuldade de manipular e avaliar biofilmes, a grande maioria dos trabalhos de laboratório é realizada com células planctônicas. Aqui, descrevemos um ensaio de biofilme de placa de pino realizado com Staphylococcus aureus. Os biofilmes bacterianos são cultivados em pinos presos a uma tampa de placa de microtitulação de 96 poços, lavados por submersão suave em tampão e colocados em uma placa de provocação de drogas. Após a incubação subsequente, eles são novamente lavados e movidos para uma placa de recuperação final, na qual o corante fluorescente resazurina serve como indicador de viabilidade. Este ensaio oferece maior facilidade de uso, confiabilidade e reprodutibilidade, bem como uma riqueza de dados quando conduzido como uma leitura cinética. Além disso, este ensaio pode ser adaptado para uma abordagem de triagem de medicamentos de médio rendimento, pela qual uma leitura fluorescente final é feita, oferecendo um caminho para os esforços de descoberta de medicamentos.

Introdução

Micróbios patogênicos podem formar biofilmes in vivo que levam a infecções crónicas não agudos ^1. Infecções associadas aos biofilmes é um fator de risco grave de procedimentos médicos que envolvem a implantação de objetos estranhos (por exemplo, substitutos ósseos artificiais, implantes de mama) ou a instalação de tubos traqueais ou cateteres urinários ^2. Nestes contextos, a terapia anti-infecciosa é quase sempre necessário, como infecções baseados em biofilme raramente são apuradas por conta própria, mesmo em indivíduos imunocompetentes. Staphylococcus aureus é um dos patógenos mais frequentemente observadas implicados em complicações relacionadas com o biofilme que ocorrem durante o uso de dispositivos médicos invasivos ^3.

Infelizmente, a própria natureza do biofilme como uma barreira de protecção torna-as mais resistentes ao tratamento do que as células planctônicas ^{de 1,4,} e a avaliação da eficácia clínica predito é uma parte crítica de ambos inicialdesenvolvimento de medicamentos, bem como a vigilância da resistência de droga. Há um crescente reconhecimento de que condições de laboratório, com foco em culturas planctônicas, podem não representar fielmente a doença no mundo real ^5. Para agravar ainda mais o problema, a replicação de fenótipos de biofilme é difícil, e os modelos de biofilmes existentes são tediosos e sofrem de elevada variabilidade inter- e intra-ensaio de ^seis. Assim, muitos pesquisadores, por necessidade, o padrão para ensaios de células planctônicas de sensibilidade às drogas, assim potencialmente negligenciar um aspecto importante da virulência bacteriana e doenças.

Aqui descrevemos o protocolo para o ensaio de bactérias, especificamente S. aureus, em biofilmes pré-cultivadas utilizando uma base ^7,8 sistema biofilme de 96 poços. Enquanto o protocolo para a formação de biofilme e desafio segue essencialmente a recomendação do fabricante, apresentamos uma metodologia alternativa rico em informações para quantificar a viabilidade do BIOFilm após o desafio. Em resumo, as bactérias são cultivadas na placa de PEG, onde formam biofilmes sobre as cavilhas salientes ligados a tampa da placa. Após a formação do biofilme, os pinos são suavemente mergulhado em poços de uma placa fresca cheio com PBS para remover as células planctônicas. O PEG-tampa, com biofilmes em anexo, é transferido para uma nova placa de desafio, contendo várias concentrações de antibiótico a ser ensaiado. Após uma segunda incubação, as tampas são novamente removidos, lavados e transferidos para uma placa de recuperação de corante contendo resazurina, onde são submetidos a uma incubação final. conversão resazurina pode ser gravado cineticamente ou tomado como uma leitura nó de extremidade após um período de recuperação definido. Este método à base de corantes de quantificação da viabilidade do biofilme difere consideravelmente de CFU (unidades formadoras de colónias) tediosas metodologia baseada em contar descrito no protocolo original ^7. OD ₆₀₀ medições da placa desafio de drogas e resazurina cinética de conversão servir como leitura viabilidadeouts de células planctônicas e biofilme, respectivamente, oferecendo um ensaio rápido, confiável e tecnicamente simples rico em informações para a sobrevivência do biofilme.

Protocolo

1. biofilme Iniciação

1. Crescer uma cultura de biofilme organismo produtor num meio rico em nutrientes. Inocular Staphylococcus aureus estirpe Newman, em 10 ml de meio de Mueller-Hinton a partir de um stock de glicerol. Realizar todos os trabalhos envolvendo a manipulação de S. aureus com luvas e dentro de um gabinete de biossegurança.
2. Incubar durante 16 horas a 37 ° C num agitador rotativo (100-200 rpm).
3. Determinar _DO600 da cultura utilizando um espectrofotómetro e uma cuvete padrão (comprimento do caminho: 1 centímetro).
4. Calcular o volume (V) de cultura necessário para preparar 20 ml de inoculo com a _{DO600 (inoculo)} de 0,1 em chelexed meios de Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) ⁹ utilizando a fórmula: [V = 20 ml * 0,1 / OD _{600 (cultura )]}
   Nota: Referência 9 fornece detalhes sobre a preparação cRPMI.
   1. Adicionar o volume calculado de cultura (de acima) a um tubo de centrífuga e as células de pelotas por centrifugação durante 1 min a 10.000 x g. para prepare inoculo biofilme, aspirar o sedimento de células e meio de crescimento gasto ressuspender em 20 ml de cRPMI.
5. Pour inoculo para um reservatório de 25 ml.
6. Remova cuidadosamente a tampa de uma placa de peg 96 poços estéril, puxando-o para cima.
   Nota: É preciso ter cuidado para não contaminar os pinos de suspensão para baixo da tampa. A tampa pode ser colocado de cabeça para baixo em uma superfície limpa dentro de uma cabine de segurança biológica.
7. Usando uma pipeta de 200 uL de multi-canal, adicionar 125 uL de inoculo em cada cavidade de filas A a G da placa de fundo.
8. Encha meio cRPMI 125 ul estéril em cada poço de uma fila H como o controle de esterilidade.
9. Leve o peg-tampa e mantenha-o acima da parte inferior da placa com os pinos voltados para baixo. Alinhe cuidadosamente os pinos individuais com seus respectivos poços. Evitar o contacto físico entre a placa e as estacas. Uma vez alinhadas, abaixe a tampa com cuidado para baixo. Evitar distorções como reajustes realizados após as estacas ter tocado a placa de fundo pode contcontroles de esterilidade aminar em H. linha
10. Selar a tampa para a placa com película de parafina para evitar a evaporação e coloque em um saco plástico lacrado, selando firmemente. Manter o volume de ar dentro do saco o mais baixo possível para minimizar a evaporação.
11. Incubar sem agitação a 37 ° C durante 48 horas numa incubadora de _CO2 a 5%.
    Nota: 48 horas de crescimento tem sido óptimo para S. aureus, mas irá variar com base no organismo utilizado.
    Nota: Embora incubação estática é um bom ponto de partida para optimizar o ensaio, agitando a 150 rpm num agitador de microplacas é uma variação possível que pode aumentar a formação de biofilme de alguns S. aureus.

2. Preparação da placa de biofilme Desafio

1. No dia do desafio biofilme tomar uma placa de 96 poços frescas e adicionar 100 ul de cRPMI, equilibrada à temperatura ambiente, a cada poço de linhas B de H. A fim de evitar resultados inconsistentes, utilizar uma placa de 96 poços que pode conter 200 uldos meios de comunicação, quando as cavilhas são para dentro, e apresenta cavidades com dimensões idênticas às da placa de iniciação biofilme.
2. Diluir até 4 compostos de teste separadamente em 1,0 ml de cRPMI para 2x a concentração final desejada, de modo a representar uma diluição final no passo 2.7.
   Nota: Um bom ponto de partida é de 8 vezes acima da concentração inibitória das células planctônicas.
3. Adicionar 200 mL de composto 1 em poços A1 para A3, composto 2 em poços A4 a A6, composto 3 em poços A7 a A9 e composto 4 em poços A10 a A12.
4. Diluir em série os compostos de teste, utilizando uma pipeta de canais múltiplos e transferir 100 ul da linha A para a linha B e misturar.
5. Desse modo, continuam a transferir 100 ul poço a poço. Misturar após cada transferência e parar na linha F.
6. Após a mistura, expulsar 100 ul de linha F em um recipiente de resíduos. Não transferir qualquer líquido linhas G e H.
7. Adicionar 100 ul de cRPMI a cada poço da placa utilizando uma pipeta de canais múltiplos paraperfazer o volume de 200 uL. Veja a Figura 1 para o layout final da placa.

3. biofilme Desafio

1. Adicionar 200 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma placa de 96 poços estéril fresco que apresenta cavidades com dimensões idênticas às da placa de iniciação biofilme.
2. Retire o saco de plástico e filme de parafina a partir de chapa de iniciação biofilme incubadas.
3. Levante a tampa para cima. Evitar o contacto entre as estacas e parte inferior da placa, pois isso pode danificar o biofilme. Manter parte inferior para posterior análise de OD ₆₀₀ (ver 3.8).
4. Enxaguar as células planctônicas, colocando o PEG-tampa sobre a placa contendo PBS (do passo 3.1). Submergir estacas por 5 segundos, levante fora da PBS, e submergir mais uma vez, tomando cuidado para não bater as estacas contra os lados também.
5. Coloque a tampa peg-lavado na placa de desafio. Evite contato desnecessário entre pinos e placa de fundo, pois isso irá danificar o biofilme levando aresultados inconsistentes.
6. placa de vedação com filme de parafina e coloque em um saco plástico lacrado como descrito no passo 1.10.
7. Incubar a placa sem agitação durante 24 h a 37 ° C numa incubadora de _CO2 a 5%.
8. Tome parte inferior da placa de iniciação biofilme de 3,3. Ressuspender as bactérias em cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos e medir a OD ₆₀₀ com um leitor de microplacas adequado para confirmar o crescimento ocorre em todos os poços mas os controlos de esterilidade em linha H.

4. Determinação de biofilme

1. Usar um leitor de placa equipado com uma câmara de incubação e capaz de tomar leituras de fluorescência para a detecção de resazurina cinéticas de conversão. Defina-se uma medição da fluorescência cinética 24 h usando uma excitação de 530 nm e 590 nm de emissão.
2. Definir a temperatura da câmara para 37 ° C e tem a placa lida a cada 20 min. Definir o leitor de placas para medir a partir do fundo da placa de acordo com as instruções de fabricanteções.
3. Prepare a placa de lavagem através da adição de 200 ul de PBS com uma pipeta de canais múltiplos para uma placa de 96 cavidades estéreis.
4. Preparar o meio de recuperação de biofilme pela adição de 400 ul de 0,8 mg / ml de solução stock de resazurina para 20 ml de meio cRPMI a uma concentração final de 16 ug / mL de resazurina.
   Nota: resazurina é um irritante da pele conhecido. Use uma bata de laboratório, óculos contra respingos e luvas durante o manuseio. CRPMI como os meios de recuperação de biofilme foi usado porque ele proporciona o menor sinal de fundo, mas pode ser substituído por meios de Mueller Hinton se for caso disso.
5. Adicionar 150 ul de meio de recuperação de biofilme com uma pipeta de canais múltiplos para cada poço de uma placa de 96 poços frescas.
6. Transferir a placa desafio da incubadora em uma cabine de segurança biológica e remova cuidadosamente saco de plástico e filme de vedação.
7. Remover o peg-tampa da placa de desafio e enxaguar células planctônicas em PBS, conforme descrito no ponto 3.4. Manter a parte inferior da placa de desafio subsequente por OD ₆₀₀ analise (ver 4.10).
8. Após a lavagem, coloque o peg-tampa na parte inferior da placa contendo o meio de recuperação do biofilme.
9. Enrole a lado da placa com película de parafina, tendo o cuidado de não obstruir o fundo dos poços de perímetro. Imediatamente após o término do prato, coloque-o no leitor de placas e começar uma leitura cinética durante um período de 24 horas iniciando a feita anteriormente resazurina protocolo cinética a partir do passo 4.1.
10. Para quantificar o crescimento das células planctônicas que podem ou não podem ocorrer durante o desafio, ler a OD ₆₀₀ de toda a parte inferior da placa desafio usando um leitor de microplacas. Siga as instruções dadas no passo 3.8.
    Nota: ressuspender cuidadosamente o conteúdo de cada poço como células derramamento fora do biofilme tendem a crescer em aglomerados na parte inferior do poço. Quaisquer bolhas dentro do bem irá interferir fortemente com leituras OD ₆₀₀ e deve ser evitado ou removidos antes da leitura.

Resultados

O ensaio resazurina é sensível o suficiente para detectar com segurança muito poucas células viáveis, capazes de se replicar em meio livre de drogas após o desafio. Nesta metodologia, define-se a concentração mínima de biofilme erradicação como a concentração mais baixa à qual nenhuma conversão resazurina é observada após 24 h. O ensaio baseia-se resazurina em moléculas oxidativos encontrados em células metabolicamente activas, que convertem a cor do corante de azul para rosa. conversão ...

Discussão

Aqui, nós descrevemos um ensaio de biofilme modificado para determinar a actividade de inibidores testados em S. biofilmes aureus com foco no estado metabólico das células do biofilme associado. Enquanto a iniciação biofilme descritos e procedimentos de desafio recomendações do fabricante principalmente imitava, a utilização de resazurina corante para detectar e quantificar células associada-biofilme que sobrevivem a um desafio inibidor 24 h simplifica significativamente o procedimento recomendado de r...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Siga as recomendações do fabricante
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 médio quelexo por 1 hora com resina Chelex 100 e depois suplementado com 10% não chelado RPMI-1640
Chelex 100 Resina	Bio Rad	142-2822
MBEC-placas	Innovotech	19111
Sal de Sódio Resazurin	Sigma	R7017	800 µ g/ml em água DI        Plataforma de
Agitação de Micro Placas	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Software Biotek
Gen5	Biotek		Gravação e análise da conversão de resazurina
Neocuproine		Sigma N1501	prepare o estoque de 10 mM em 100% de etanol, armazene a -80 º C
Sulfato de cobre	Acros Organics	7758-99-8	prepara uma solução estoque de 100 mM em água, armazena a 4 º C
-Neocuproine	Self-Made		Gerado pela mistura de molaridades iguais de neocuproína e sulfato de cobre. A mistura foi diluída em meio CRPMI até a concentração desejada.
Gentamicina	Sigma	G3632-1G

Estéril de Filtro