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TAPE: Uma biodegradável Hemostática Glue Inspirado por um Composto Ubiquitous em plantas para aplicação cirúrgica

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DOI:

10.3791/53930

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8 de junho de 2016

 ,  , 
1The Graduate School of Nanoscience and Technology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Department of Chemistry, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 3Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos o protocolo simples de preparar cola médica biodegradável que tem uma capacidade hemostática eficaz. A fita é um agregado supramolecular imiscível em água, preparado através da mistura de ácido tânico, um composto ubíquo encontrado em plantas, e poli (etileno) glicol, dando origem a 2,5 vezes maior aderência resistente à água em comparação com a cola de fibrina comerciais.

Resumo

Este vídeo descreve o protocolo simples para a preparação de cola cirúrgica biodegradável que tem uma capacidade hemostático eficaz e uma maior força de aderência resistente à água do que os adesivos de tecidos comerciais. adesivos médicos têm atraído grande atenção como potenciais ferramentas alternativas para suturas e grampos devido à sua conveniência em uso com capacidade de invasão mínima. Embora existam vários protocolos para o desenvolvimento de adesivos de tecido incluindo aqueles comercialmente disponíveis, tais como colas de fibrina e materiais à base de cianoacrilato, em geral eles requerem uma série de sínteses químicas de moléculas orgânicas, ou métodos de proteína de purificação complicadas, em caso de materiais impulsionado-bio (ie, cola de fibrina). Além disso, o desenvolvimento de colas cirúrgicas apresentem altos propriedades adesivas, mantendo biodegradabilidade ainda é um desafio devido a dificuldades na obtenção de um bom desempenho no ambiente molhado do corpo. Nós ilustramos um novo método para preparar umcola médica, conhecida como fita, por a separação à base de peso de um agregado supramolecular imiscível em água formada depois de uma mistura física de uma molécula adesiva resistente a húmido derivado de plantas, t Annic Um cid (TA), e um bem conhecido biopolímero, poli (etileno) glicol (PEG). Com a abordagem, fita mostra a força de aderência elevada, o que é 2,5 vezes mais do que a cola de fibrina comerciais, na presença de água. Além disso, a fita é biodegradável em condições fisiológicas e pode ser utilizado como uma cola hemostático potente contra sangramento tecido. Esperamos que o uso generalizado de fita em uma variedade de ambientes médicos e aplicações de entrega de medicamentos, tais como polímeros de muco-adesão, depósitos de drogas, entre outros.

Introdução

Em uma década passado, foram feitos esforços para substituir as suturas e grampos cirúrgicos atuais para fechar feridas com adesivos biodegradáveis ​​/ bioabsorvíveis devido à sua conveniência no uso e baixa capacidade de invasão de tecidos durante os tratamentos cirúrgicos. Comercialmente disponíveis Tissue-adesivos são classificadas em quatro tipos: (1) derivados de cianoacrilato 1, (2) colas de fibrina formados por conversão enzimática de fibrinogénio em fibrina pela trombina polímeros 2,3, (3) materiais à base de proteínas, tais como quimicamente ou fisicamente albumina de ligação cruzada e / ou gelatina 4,5, e aqueles (4) à base de polímero sintético 6. Apesar de terem sido utilizados em muitas aplicações clínicas, todos os adesivos têm as suas próprias desvantagens intrínsecas e os inconvenientes que podem ser obstáculos à sua utilização generalizada. colas à base de cianoacrilato mostram elevada força de adesão para os tecidos, mas a sua sub-produtos tóxicos tais como o cianoacetato e o formaldeído formado durante a degradação, muitas vezes causar sinalgraus ificant de respostas inflamatórias 7. As colas de fibrina e albumina ou materiais à base de gelatina têm problemas de segurança no que respeita à transmissão de componentes infecciosos, tais como vírus de origem animal: plasma de sangue humano para colas de fibrina e animais, incluindo bovinos, frangos, porcos e peixes para colas à base de gelatina 8. Embora alguns adesivos à base de polímeros sintéticos foram aprovadas pela Federal Drug Administration (FDA), a maioria dos adesivos feitos de polímeros sintéticos continuam a ter dificuldade em minimizar as etapas do processo de fabrico e obtenção de biocompatibilidade 9. Mais importante, todas as colas sofrem de fraca resistência mecânica e adesão a tecidos molhados 10. Recentemente, adesivos de tecido biomiméticos inspirados por mexilhões marinhos 11-13, lagartixas 14, gecko com mexilhão 15 e worms endoparasitas 16 foram surgindo como alternativas promissoras para colas médicas atuais, devido à sua sintonizável mecânica epropriedades adesivas com biocompatibilidade. No entanto, até hoje, ainda existem questões a serem abordadas antes de se tornarem produtos comerciais 17.

Aqui, descrevemos um tipo inteiramente novo de cola médica chamada fita que é preparado pela ligação de hidrogénio intermolecular entre uma molécula de adesivo derivado de planta, o ácido tânico (TA), e um polímero bio-inerte de poli (etileno glicol) (PEG), como o próprio nome indica. TA é um tanino hidrolisável representante ubiquitously encontrados durante o metabolismo secundário de plantas. Ele tem atraído muita atenção devido às suas propriedades anti-oxidantes, anti-mutagénicas, e propriedades anti-cancerígenas e tem sido demonstrado que participam em interacções supramoleculares com muitos polímeros, tais como poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) e poli (N - vinilpirrolidona) (PVPON), para formar a camada por camada (LbL) filmes 18-20 e drogas de libertação de microcápsulas 21-23. No presente estudo, nós descobrimos que o TA pode actuar como uma eficientefragmento funcional adesiva resistente à água para formar um adesivo médico, TAPE. Por simples mistura com TA, uma incrustação não-PEG polímero torna-se uma cola supramolecular com 2,5 vezes maior força de adesão em comparação com a cola de fibrina comerciais, e esta adesão foi mantido durante até 20 ciclos de fixação e distanciamento, mesmo na presença de água . A sua capacidade hemostática foi testado num modelo de hemorragia fígado in vivo e mostrou boa capacidade hemostático para parar o sangramento dentro de poucos segundos. TAPE tem o seu significado importante em um campo relacionado como o primeiro adesivo derivado de plantas que podem revelar uma nova visão sobre a resolução dos inconvenientes de problemas atuais com abordagens bio-inspirados. Esperamos também que o uso generalizado de fita em uma variedade de aplicações médicas e farmacêuticas, tais como muco-adesivos, adesivos de liberação de drogas, molhos de cuidados de feridas, e outras devido ao seu método de preparação simples, escalabilidade, a taxa de biodegradação sintonizável, bem como ADHES resistentes wet-altamentepropriedades de íons.

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Protocolo

Todos os cuidados com os animais e as experiências sejam realizadas em conformidade com o protocolo ético fornecido pelo KAIST (Korea Instituto Avançado de Ciência e Tecnologia) IRB (Institutional Review Board).

Formação 1. TAPE

  1. Para a preparação de uma solução de AT, colocar um tubo de ensaio de vidro de 4 ml de tamanho sobre um agitador magnético, e adicionar 1 ml de água destilada com uma barra de agitação. Adicionar 1 g de ácido tânico para o frasco, e dissolvê-lo em água por agitação suave a 200 rpm, durante mais de 1 h. Quando a TA está completamente dissolvido, a mistura torna-se transparente com uma cor castanha.
  2. Prepara-se uma solução de PEG pela adição de 1 g de PEG em pó (4-braços, de 10 kDa, e linear, 4.6 kDa) a 1 ml de água destilada seguida por misturando-as em vortex durante alguns segundos para formar uma suspensão branca. Manter esta pasta na incubadora a 60 ° C durante 10 min. até que o branco se torna completamente claro.
    NOTA: O ponto de fusão do PEG com 10 kDa de peso molecular é de cerca de 55- 60 ° C, e a 4 kDa um é de 53 - 58 ° C. Derretido PEG se torna miscivel com a água de modo a que uma elevada concentração de PEG em água até 1 g / ml pode ser conseguido como uma solução límpida. Uma vez que uma solução clara PEG é formada a uma temperatura elevada, a solução ainda é estável à temperatura ambiente após o arrefecimento.
  3. Adicionar 329 ul do PEG (4-braços, 10 kDa) solução preparada no passo 1.2 a 671 ul da solução de TA, preparado no passo 1.1 (No caso de um PEG linear com 4,6 kDa, adicionar 311 ul de uma solução PEG a 689 ul de uma solução de TA) num tubo de micro-centrifugação. Delicadamente misturar as duas soluções viscosas e mel-like com uma espátula estreita para misturá-los de forma homogénea.
    CUIDADO: Ambas as soluções são bastante viscoso, de modo que o cientista deve lentamente mas suficientemente puxar para cima e transferir as soluções com uma micropipeta.
  4. Girar a mistura preparada no passo 1.3 a 12.300 xg durante 3 minutos numa centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo.
  5. cuidadosamente remove tanto do sobrenadante quanto possível, utilizando uma micropipeta, e recolher o produto que já se estabeleceram: Este é o TAPE totalmente formado. Após a formação TAPE, armazená-lo no frigorífico (4-8 ° C) por até várias semanas. NOTA: TAPE podem ser esterilizados por radiação gama ou elétrons tratamento feixe antes do uso em aplicações cirúrgicas.

2. Medição da força de aderência da fita adesiva

  1. Preparar dois pedaços de tecido da pele porcina com um diâmetro de 6 mm por corte com um perfurador de biópsia após a remoção de toda a gordura no tecido da pele.
    NOTA: O tecido da pele porcina foi obtida a partir de uma pele saudável flanco porcine e foi comprado de um mercado local de carne localizado em Daejeon na Coreia do Sul.
  2. Aplicar cola de cianoacrilato comercial para o lado exterior de cada tecido, e anexar o tecido para a haste metálica.
    NOTA: A haste metálica é utilizado como um identificador de modo complementar um tecidosnão está directamente agarrada pela máquina. Por conseguinte, ele pode ser substituído por outros materiais de acordo com a configuração da máquina de tracção.
  3. Aplicar uma gota de fita (A gota de fita é aproximadamente 3-6 mg) de um lado do tecido. Em seguida, o espalhar uniformemente FITA utilizando outro tecido entre os dois tecidos sobre os seus lados interiores, de modo que estão ligados como mostrado na Figura 2A.
  4. Em seguida, anexar manualmente e separe os dois lados dos tecidos várias vezes para misturar de forma homogénea e maximizar a interface entre cada tecido e TAPE.
  5. Com o UTM, cuidadosamente aperto de cada lado da haste. A força de adesão será determinada pela força necessária para separar dois tecidos ligados com fita. Em primeiro lugar, aplica uma força de 20 N durante 1 min. Em seguida, com a máquina, cada haste de puxar numa direcção oposta a uma velocidade de 1 mm / min. até que os tecidos são completamente separada.
    NOTA: Os dados vai ser dada como uma força de distância (FD) curva detectado pelo movimentode cada haste.
  6. Calcula-se a resistência de adesão de fita adesiva dividindo a força máxima (kN) mostrado na curva FD conseguida no passo 2.5 pela área da superfície da amostra, isto é, de 3,14 x 0,003 (m) 2.
  7. Para monitorar a força de adesão na presença de água, adicionar 20 l de água sobre a área destacada entre dois tecidos, e anexá-los imediatamente. Com a máquina, realizar o teste de descolamento novamente.

3. Teste in vitro Degradação

  1. Corte uma tampa (d = 8 mm) de tubo de micro-centrífuga, e pesar a tampa para defini-lo como W c.
  2. Encha a tampa com 150 mg de TAPE, e pesar todos juntos novamente para defini-lo como um peso total inicial W 0.
    CUIDADO: Não sobrecarregue TAPE na tampa. A altura da fita deve ser menor do que a parte superior da tampa, uma vez que pode ser uma barreira física a um fluxo de tampão PBS gerado pelo processo de agitação durante a incubação no passo 3.4.
  3. A colocar o tampão contendo fita em um frasco de cultura celular (75 cm 2), e adicionar 50 ml de tampão PBS (1x, pH 7,4) para o frasco de cultura de células de modo a fita na tampa está completamente imerso no tampão PBS, como mostrado na Figura 3A (n = 5).
  4. Incubar o balão de cultura de células, preparado no passo 3.3, em um incubador com agitação orbital a 37 ° C, semelhante às condições fisiológicas, com agitação suave (50 rpm).
    CUIDADO: Mantenha a condição de agitação a 50 rpm. rpm mais alto pode causar um colapso da FITA.
  5. Em cada momento, tomar a tampa com fita do frasco de cultura de células e, em seguida, seque-as, soprando gás nitrogênio. Pesar o tampão contendo fita restante. Definir o peso em cada ponto de tempo para W t. Substituir o PBS fresco de novo, e agitá-lo novamente depois de medir W t em cada ponto de tempo.
  6. Calcule o peso restante relativa (%) a seguinte equação.
    Peso relativo remanescente (%) = (W t - W C) / (W 0 - W C) x 100%

4. Hemostática Capacidade de TAPE

NOTA: Todas as experiências com animais deve ser realizada de acordo com as orientações e protocolo de ética fornecidos pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar coreano.

  1. Para avaliar a capacidade hemostática in vivo, rever o modelo de fígado de rato hemorragia, tal como descrito na ref 24.
  2. Anestesiar quinze murganhos (ICR ratinho normal, 6 semanas, 30 - 35 g, macho) com uma injecção intraperitoneal de tiletamina-zolazepam (33,333 mg / kg) e xilazina (7,773 mg / kg) (n = 5 por grupo). Para confirmar anesthetization adequada, aperte pata do animal com cuidado e observar os movimentos tais como a retirada da pata, etc. Nenhum movimento indica que o animal é suficientemente anestesiado para fazer a cirurgia.
  3. Para prevenir o ressecamento dos olhos de animais, aplicar vet pomada para os olhos suficientemente enquanto sob umanestesia. Expor o fígado através de uma incisão abdominal linha média, e picar o fígado com uma agulha de 18 G para induzir o sangramento.
  4. Remover o sangue flui com uma gaze estéril e colocar 100 ul de fita adesiva ou cola de fibrina (controlo positivo) imediatamente sobre o local da hemorragia.
    NOTA: Não existe mais nenhuma sutura é necessária após a aplicação TAPE devido às suas propriedades adesivas altamente resistentes sangue nos tecidos da ferida. Para o controlo negativo, nenhum tratamento ocorre no local da hemorragia.
  5. Em cada caso, colocar um filtro de papel com massa conhecida sob o fígado para recolher o sangue a partir do local danificado. Substitua o papel por uma nova a cada 30 seg para 4 vezes (ie., 2 min).
  6. Medir a massa de sangue absorvido em cada papel de filtro recolhidos a cada 30 seg. Após o experimento animal, sacrificar os ratos através de CO 2 a eutanásia asfixia.

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Resultados

A fita é um agregado supramolecular que estabelece-se após a centrifugação da mistura das duas soluções aquosas que contêm ácido tartárico (1 g / ml em água destilada) e PEG (1 g / ml em água destilada) com 2: 1 razão em volume (Figura 1A). A proporção de mistura é o fator chave para atingir alta força de adesão; Quando a fita é formado por uma proporção de 2: 1 de mistura, 20 unidades de o grupo hidroxilo (-OH) em 25 unidades de AT interagem com cada grupo de éter (-O-)...

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Discussão

Nós desenvolvemos uma classe inteiramente nova de fita adesiva chamada hemostática inspirado pela interação molecular resistente à água de um composto polifenólicos de origem vegetal, TA. TA é um tanino hidrolisável representante que tem atraído significativa atenção devido ao seu anti-oxidantes propriedades anti-bacterianas, anti-mutagénicos e anti-cancerígenas.

O processo de fazer TAPE é extremamente simples, escalável e ambientalmente amigável, pois é apenas a mistura de uma etapa de duas...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia do Sul: Bolsa de cientistas em meio de carreira (2014002855) e Ministério da Indústria, Comércio e Recursos Naturais: Programa de Desenvolvimento de Materiais de Primeira Linha. Este trabalho também é apoiado em parte pelo Centro de Tecnologia Inspirada na Natureza (CNiT) no Instituto KAIST para NanoCentury (KINC).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido tânicoSigma-aldrich403040
Poli (óxido de etileno), 4 braços, terminado hidroxiAldrich565709Averge Mn ~ 10.000
Poli (etilenoglicol)Aldrich373001Média Mn 4.600
Punção de biópsiaMiltex33-36Diâmetro = 6 mm
Aron AlphaToagosei Co., Ltd.Máquina
de teste universal de cola instantânea (UTM)Instron5583
Tubos de microcentrífugaSPL ciências da vida600151,5 ml
Placa de PetriSPL ciências da vida1009090 x 15 mm
Fosfato de sódio monobásicoSigmaS50111x Ingrediente PBS
Fosfato de sódio dibásicoSigmaS51361x Ingrediente PBS
Cloreto de sódioDuchefa biochemieS0520.50001x Ingrediente PBS
Agitador de incubaçãoCompanheiro de laboratórioSIF6000R
camundongos ICROrient bioCamundongo ICR normal6 semanas, 30 - 35 g, macho
Tiletamina-zolazepam (Zoletil 50)Virbac
Zylazine (Rompun)Bayer
Agulha PrecisionGlideTM (18 G)BD30203218 G
Papel de filtroWhatman1001 125Diâmetro = 125 mm
ParafilmeBemis Flexible PakagingPM996

Referências

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