Introduction
वयस्क स्टेम कोशिकाओं (एससी) मर कोशिकाओं की जगह से ऊतक homeostasis को बनाए रखने और चोट पर क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत के लिए आवश्यक हैं। ये अनुसूचित जाति नित्य आत्म नवीकरण गुजरना करने के लिए और विभिन्न सेल प्रजातियों 1-3 में अंतर करने की उनकी क्षमता से परिभाषित कर रहे हैं। सबसे अच्छा अध्ययन प्रणाली है, जो उनकी आपूर्ति के लिए वयस्क अनुसूचित जाति पर निर्भर हैं, hematopoietic प्रणाली, आंत और त्वचा 1,2,4 शामिल हैं।
embryogenesis दौरान, त्वचा एपिडर्मल कोशिकाओं की एक परत के रूप में शुरू होता है। बाल कूप (एचएफ) के Morphogenesis शुरू होता है जब mesenchymal कोशिकाओं त्वचा आबाद और एक अंतर्निहित श्लेषजनउत्पादी डर्मिस 5 के रूप में। Mesenchymal कोशिकाओं, जो बाद में चमड़े का papilla (डीपी) का गठन, एपिडर्मल परत के नीचे सीधे संगठित करने और उपकला को प्रोत्साहित बाल placodes कि नीचे की तरफ बढ़ने लगते 6 फार्म के लिए विशेष। अति मैट्रिक्स कोशिकाओं, एचएफ के तल पर स्थित proliferating,इन mesenchymal कोशिकाओं लिफाफा और बाल बल्ब के रूप में है, जबकि भीतरी परत गाढ़ा सिलेंडरों में अंतर करने के लिए बाल शाफ्ट (एचएस) और आसपास के भीतरी जड़ म्यान (आईआरएस) 2,3 आकार लेती है।
interfollicular एपिडर्मिस (IFE), वसामय ग्रंथि (एसजी) और एचएफ: प्रसव के बाद जीवन में त्वचा एपिडर्मिस तीन डिब्बों के शामिल है। IFE और एसजी जो homeostasis की एक निरंतर राज्य में हैं के विपरीत, एचएफ एक गतिशील मिनी अंग है जो विकास की सतत चक्र (ऐनाजेन), विनाश (केटाजन) और बाकी (टेलोजन) 4,7 आए। बाल कूप स्टेम सेल (HFSCs) है कि ईंधन की इस सतत चक्र, एचएफ के भीतर एक विशेष आला उभार के रूप में जाना जाता 4 में रहते हैं। डीपी से, ऐनाजेन HFSCs उभार के बाहर निकलने के सक्रियण संकेतों निम्नलिखित के दौरान, proliferating शुरू हो और नीचे की ओर इस प्रकार बाहरी जड़ म्यान के रूप में जाना जाता कोशिकाओं की एक लंबी रैखिक निशान बनाने उतर (ओआरएस) 8-10। मैट्रिक्स कोशिकाओं, किएचएफ, तेजी से चक्र के आधार पर डी पी के चारों ओर और ऊपर की ओर पलायन इस प्रकार एच एस और आईआरएस 10 (चित्रा 1) पैदा टर्मिनल भेदभाव के दौर से गुजर। ऐनाजेन की अवधि के बालों की लंबाई निर्धारित करता है और मैट्रिक्स कोशिकाओं 6 के proliferative और भेदभाव क्षमता पर निर्भर है। जब एचएफ केटाजन में प्रवेश करती है, पारगमन amplifying बल्ब संघर्ष में मैट्रिक्स कोशिकाओं पैदा करना, apoptosis से गुजरना और पूरी तरह से निकासी ऊपर की ओर खींच जबकि डीपी जब तक यह एचएफ 8,11 के गैर-साइकल चलाना हिस्सा तक पहुँचता है। इस त्याग के दौरान एचएफ एक अस्थायी उपकला किनारा, जो केटाजन की विशेषता है के रूप में जाना जाता संरचना रूपों, और कई apoptotic सेल शामिल हैं। चूहों में, केटाजन 3-4 के बीच दिनों तक रहता है और अत्यधिक पहले बाल चक्र में सिंक्रनाइज़ है। जब एचएफ टेलोजन पहुंचता है सब HFSCs मौन हो जाते हैं। एचएफ चक्र के अलग चरणों भी मीटर के कारण माउस की त्वचा के रंग में परिवर्तन की विशेषता हैelanin उत्पादन। केटाजन दौरान गहरे भूरे रंग के लिए ऐनाजेन दौरान काले रंग से त्वचा परिवर्तन टेलोजन 6,7,12,13 दौरान गुलाबी।
चित्रा 1: बाल कूप साइकिल। एचएफ एक स्थायी ऊपरी भाग से बना है और एक लगातार कम remodeling, साइकिल चलाना भाग है कि तेजी से विकास (ऐनाजेन), विनाश (केटाजन) और एक रिश्तेदार निष्क्रियता चरण या बाकी (टेलोजन) के सतत चक्र से होकर गुजरती है। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का संस्करण।
एचएफ बनाए रखने में अनुसूचित जाति के शुरू में चेस प्रयोगों, tritiated thymidine के साथ, कि धीमी गति से साइकिल चालन के लेबल को बनाए रखना कोशिकाओं (LRC) कि सिर्फ एसजी 14 से नीचे एचएफ की स्थायी क्षेत्र में बसता की आबादी का पता चला का उपयोग कर पहचान की गई। HFSC के क्षेत्र में अग्रिमलक्षण वर्णन मार्करों कि एचएफ आला 15 से पहचान करने और विशिष्ट अनुसूचित जाति को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक छोटी संख्या का पता चला। शायद HFSCs के संवर्धन के लिए सबसे अच्छा मार्कर CD34, एक कोशिका की सतह मार्कर मनुष्यों 16 में एक hematopoietic अनुसूचित जाति मार्कर के रूप में भी पहचाना जाता है। इस CD34 + आबादी के भीतर दो अलग आबादी भी दिया पृथक α6 इंटीग्रिन अभिव्यक्ति 2 पर आधारित है। एक और मार्कर केरातिन 15 (K15) जो अत्यधिक उभार के क्षेत्र में व्यक्त किया जाता है, CD34 अभिव्यक्ति के साथ सह-localizes और एक K15 प्रमोटर को निशाना बनाने और ट्रांसजेनिक जानवरों 15,17-19 में HFSCs अलग-थलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। पिछले दशक में HFSCs और पूर्वज कोशिकाओं के कई अन्य अलग आबादी भी एचएफ 17,20-27 भीतर निवास करने के लिए सूचित किया गया है।
HFSCs का एक अतिरिक्त रोमांचक सुविधा त्वचा की मरम्मत के लिए उनके योगदान है। सामान्य परिस्थितियों के अंतर्गत HFSCs एचएफ की भरपाई और IFE homeostasis में हिस्सा नहीं लेते। होवेदेखें, लोग घायल हो गए के जवाब में, इन कोशिकाओं को अपनी अनुसूचित जाति आला और सहायता IFE 9 repopulating में से बाहर निकलें। हमने हाल ही में दिखा दिया है कि चूहों समर्थक apoptotic Sept4 / कला जीन प्रदर्शन के लिए नष्ट कर दिया CD34, K15 और Sox9 + HFSCs, जो apoptosis के लिए एक प्रतिरोध प्रदर्शित की संख्या में वृद्धि। HFSCs Sept4 / कला से अलग थे - / - पृष्ठीय खाल प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के उपयोग और CD34 + और K15 + HFSCs की संख्या में दो गुना से भी अधिक वृद्धि हुई थी। ये Sept4 / कला - / - HFSCs इन विट्रो में विस्तार किया है और नहीं थे केवल अधिक कालोनियों को जन्म दिया लेकिन नियंत्रण 28 की तुलना में भी कठोर परिस्थितियों का सामना करने में सक्षम थे।
HFSCs की संख्या में वृद्धि होने का एक परिणाम के रूप में, Sept4 / कला - / - चूहों काफी तेजी से त्वचा छांटना चोटों के जवाब में चंगा किया। आश्चर्यजनक, Sept4 / कला - / - चूहों displayeघाव बिस्तर से पुनर्जीवित HFS, और काफी छोटे निशान के दा बड़ी संख्या में। इसके अलावा, XIAP (apoptosis के एक्स से जुड़े अवरोध), कला के जैव रासायनिक लक्ष्य के लिए हटाए गए चूहों बिगड़ा चिकित्सा 28 का प्रदर्शन किया।
हमारे परिणाम और काम अन्य प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन से पता चला है कि HFSCs जीव विज्ञान और वयस्क अनुसूचित जाति के समारोह के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल के रूप में सेवा करते हैं। यहाँ, हम संवर्धन और HFSCs और चार मार्करों की अभिव्यक्ति के आधार पर एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं के अलगाव के लिए पद्धति का वर्णन: इंटीग्रिन α6; इंटीग्रिन β1; एससीए -1 (एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं के लिए एक मार्कर) और CD34। K15 + HFSCs के इसी तरह के अलगाव भी K15-GFP संवाददाता माउस 19 का उपयोग किया जा सकता है।
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Protocol
इस अध्ययन की सिफारिशों की देखभाल और स्वास्थ्य के इजरायल के मंत्रालय की प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड में उल्लिखित के साथ सख्त अनुसार प्रदर्शन किया गया था। जानवरों के सभी अनुमोदित संस्थागत पशु की देखभाल प्रोटोकॉल प्रौद्योगिकी प्रणालियों इसराइल संस्थान के आईएल 02302-2015 के अनुसार संभाल रहे थे।
1. प्रायोगिक तैयारी
- chelated भ्रूण गोजातीय सीरम की तैयारी
नोट: उपकला कोशिकाओं कैल्शियम करने के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कैल्शियम के लिए इन कोशिकाओं के जोखिम को नियंत्रित करने के लिए। आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं अलगाव की प्रक्रिया केलेशन दौरान कैल्शियम को उजागर नहीं कर रहे हैं से भ्रूण गोजातीय सीरम धुंधला बफर 29 की तैयारी के लिए इस्तेमाल किसी भी अवशिष्ट कैल्शियम दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल कैल्शियम मुक्त भ्रूण गोजातीय सीरम के लगभग 1 एल तैयारी FACS धुंधला बफर के लिए आवश्यक तैयार करता है।- सूखी chelating सामग्री, जैसे की 400 ग्राम जोड़ें।, Chelex, एक 4 एल बीकर में और आसुत जोड़ने एच 2 ओ कुल मात्रा 4 एल कवर और लगातार एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर हलचल।
- 10 एन एचसीएल समाधान का उपयोग करते समय सरगर्मी 7.4 पीएच को समायोजित करें। 20 मिनट के लिए सरगर्मी जारी है और जब तक पीएच अधिक से अधिक 20 मिनट के लिए स्थिर बनी हुई है जरूरत के रूप में पीएच फिर से समायोजित।
- 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते बीकर chelating सामग्री एक कॉम्पैक्ट गोली के रूप में करने की अनुमति है। ध्यान से महाप्राण एच 2 हे और जोड़ने के ताजा आसुत एच 2 ओ 4 एल की कुल मात्रा को
- कदम 1.1.2 के रूप में पीएच समायोजन दोहराएँ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर बीकर 1 घंटे के लिए जगह chelating सामग्री एक कॉम्पैक्ट गोली के रूप में करने की अनुमति है। ध्यान से महाप्राण एच 2 ओ
- धीरे-धीरे chelating सामग्री के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम के दो 500 मिलीलीटर की बोतल जोड़ें। यह सुनिश्चित करना कि गति सेटिंग बुलबुले का उत्पादन नहीं करता 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धीरे-धीरे हिलाओ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर बीकर 1 घंटे के लिए जगह chelating सामग्री एक कंप्यूटर अनुप्रयोग के लिए फार्म करने की अनुमतिगोली काम करते हैं।
- ध्यान से 1 एल कांच की बोतल में सीरम हस्तांतरण और बाँझ शर्तों के तहत एक बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से फिल्टर। -20 डिग्री सेल्सियस पर chelated सीरम स्टोर या तुरंत का उपयोग करें।
- बफर धुंधला की तैयारी
- सीए 2 और मिलीग्राम के बिना 2 + 3% पीबीएस में FBS chelated की 100 मिलीलीटर की तैयारी और बर्फ पर रहते हैं।
2. वयस्क एपिडर्मिस से बालों के रोम के अलगाव
- एक प्रेरण बॉक्स का उपयोग कर 5% isoflurane का उपयोग चूहों anesthetize। यहां वर्णित प्रोटोकॉल 50-80 दिन पुराने चूहों कि एचएफ चक्र के टेलोजन चरण में हैं का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था।
- मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के अनुसार चूहों euthanize। इधर, एक इच्छामृत्यु कक्ष में सीओ 2 की अधिक मात्रा का प्रयोग चूहों euthanize।
- बिजली क़ैंची का उपयोग पृष्ठीय त्वचा से सभी बाल दाढ़ी। सिर और हाथ-पैर से बचें। कतरनी संभव के रूप में करीब त्वचा के लिए रखें। त्वचा और चमड़े के नीचे की परत को नुकसान पहुंचाने से बचें। जब सभी बाल हटा दिया जाता है, 70% इथेनॉल का उपयोग किसी भी बाल अवशेषों को हटाने के लिए और पृष्ठीय त्वचा कीटाणुरहित।
- एक विदारक पैड पर माउस जगह है, और संदंश का उपयोग पूंछ के पास की त्वचा को खींच और कैंची का उपयोग कर एक छोटा सा निक बनाते हैं। ध्यान से दूर त्वचा को काटने और प्रावरणी से अलग से एक पीछे-पूर्वकाल दिशा में पूरे पृष्ठीय त्वचा कट। चमड़े के नीचे की परत को नुकसान पहुंचाने से बचें।
- एक विदारक चटाई पर त्वचा, बाल नीचे की ओर का सामना करना पड़ प्लेस, और जगह में ठीक करने के लिए त्वचा की दो आसन्न किनारों नीचे पिन। धीरे वसा परिमार्जन, एक कुंद छुरी का उपयोग कर जब तक डर्मिस स्पष्ट और साफ है।
नोट: जब वसा बंद scraping, घुमावदार संदंश का उपयोग त्वचा पर कोमल दबाव लागू करने के लिए। त्वचा संदंश की घुमावदार पक्ष के प्रयोग पर दबाव लागू करें। इस फाड़ से त्वचा को रोकने जाएगा। - त्वचा की जगह, डर्मिस, नीचे की ओर 100 मिमी बाँझ संस्कृति डिश में, और त्वचा सीधा सुनिश्चित करने के लिए कोई परतों देखते हैं कि। सीए के बिना पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें 2 + - sup> और 2 मिलीग्राम + (पीबीएस)।
- पीबीएस Aspirate और 0.25% trypsin के 10 मिलीलीटर जोड़ें। सुनिश्चित करें कि त्वचा सामने आया है और स्वतंत्र रूप से चल रहा है। 0.25% trypsin के 10 मिलीलीटर प्रति त्वचा का एक टुकड़ा सेते हैं।
- 30-120 मिनट के लिए या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
3. बालों के रोम से एकल कक्ष निलंबन की तैयारी
- त्वचा से सभी बाल घुमावदार संदंश और एक छुरी का उपयोग कर, पीछे दिशा के लिए एक पूर्वकाल में परिमार्जन। संदंश की घुमावदार पक्ष का उपयोग जगह में त्वचा पकड़ो और बाल नोच लिए छुरी का उपयोग करें।
नोट: trypsin समाधान 2.8 चरण में जोड़ा में बाल बंद परिमार्जन। पूंछ में शुरू करो और बाल विकास की दिशा का पालन करें। बाल विकास की दिशा के खिलाफ Scraping सेल उपज में HFS की पर्याप्त नुकसान और कमी का परिणाम देगा। HFS एक साथ प्रत्येक का पालन करना और छोटे गुच्छों रूप में करते हैं; आदेश वें कम करने के लिएएचएफ झुरमुटों के ई आकार एक समय में एक छोटे से क्षेत्र परिमार्जन करने के लिए प्रयास करें। - नई संस्कृति डिश के लिए गंजा त्वचा स्थानांतरण और जोड़ने पीबीएस के 10 मिलीलीटर - यह सूखने से रोकने के लिए। त्वचा का निरीक्षण किया और किसी भी शेष बाल नोच।
- एक छुरी और संदंश का उपयोग जब तक एक भी एचएफ निलंबन प्राप्त की है HFS टूट। सख्ती कुछ मिनट के लिए 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग सभी बाल गुच्छों को तोड़ने के लिए एचएफ निलंबन triturate।
नोट: बर्फ पर निम्नलिखित कदम के सभी प्रदर्शन करना। - पूर्व लेबल 50 मिलीलीटर ट्यूब में एचएफ निलंबन स्थानांतरण।
- पीबीएस Aspirate - त्वचा से है और इसका इस्तेमाल कि एचएफ निलंबन निहित सेल संस्कृति डिश कुल्ला करने के लिए; 50 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
- धुलाई
- एक 70 माइक्रोन सेल एक 50 मिलीलीटर ट्यूब पर फिट झरनी के माध्यम से गुजर द्वारा निलंबन फ़िल्टर। प्रारंभिक 50 मिलीलीटर ट्यूब और धुंधला बफर के 10 मिलीलीटर के साथ झरनी धो (पीबीएस - 3% chelated FBS के साथ)।
- गुजर द्वारा निलंबन फ़िल्टर40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से एक 50 मिलीलीटर ट्यूब पर लगाया। धुंधला बफर के 5-10 मिलीलीटर के साथ ट्यूब धो सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को नया ट्यूब के लिए स्थानांतरित कर दिया गया है। जब तक सभी जानवरों को संसाधित किया गया है बर्फ पर निलंबन रखें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 XG पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। धुंधला बफर के 5 मिलीलीटर में गोली और resuspend गोली परेशान बिना ध्यान महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG अपकेंद्रित्र। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate और धुंधला बफर के 800 μl में सेल गोली resuspend।
नोट: मात्रा में ऊपर निर्दिष्ट दो वयस्क चूहों से ली गई कोशिकाओं धुंधला करने के लिए पर्याप्त है।
- पूर्व लेबल FACS ट्यूबों में स्थानांतरण सस्पेंशन।
- नियंत्रण ट्यूबों के लिए, सेल निलंबन (या सेल निलंबन से किसी भी अवशिष्ट बाएं) के 25-50 μl ले और धुंधला बफर के साथ 300 μl की कुल मात्रा पर निर्भर करते हैं।
नोट: बेदाग के लिए नियंत्रण ट्यूब (कुल मात्रा 300 μl) तैयार (कोई एंटीबॉडीऔर कोई DAPI); केवल DAPI; β1 इंटीग्रिन; α6 इंटीग्रिन; एससीए-1; CD34।
- नियंत्रण ट्यूबों के लिए, सेल निलंबन (या सेल निलंबन से किसी भी अवशिष्ट बाएं) के 25-50 μl ले और धुंधला बफर के साथ 300 μl की कुल मात्रा पर निर्भर करते हैं।
- उचित ट्यूब करने के लिए वांछित सांद्रता में प्राथमिक एंटीबॉडी और DAPI (उचित dilutions के लिए सामग्री तालिका देखें) जोड़ें। धीरे सेल निलंबन मिश्रण करने के लिए नलियों झटका। बर्फ पर लौटें और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर प्रकाश से बचाने के लिए।
- बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और धीरे से झटका नलियों हर 10 मिनट सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं निलंबन में रखा जाता है।
- धुंधला बफर (ट्यूब के अनुसार लगभग 4 एमएल) के साथ प्रत्येक FACS ट्यूब भरकर कोशिकाओं को धो लें; 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate और धुंधला बफर के 800 μl में सेल गोली resuspend।
- सेल झरनी टोपी के साथ FACS ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण एकल कक्ष निलंबन सुनिश्चित करने के लिए।
4. फ्लो का विश्लेषण
- Signa के लिए उपयुक्त फिल्टर के साथ कोशिकामापी तुरंत छँटाई एक प्रवाह का उपयोग सेल आगे बढ़ेंएल पता लगाने। 405 एनएम वायलेट (DAPI की माप के लिए), 488 एनएम नीले और 633 एनएम लाल लेजर (एपीसी की उत्तेजना के लिए) (एफएससी, एसएससी, पे, पे-Cy7 और FITC की माप के लिए) का उपयोग करें
नोट: यह सुनिश्चित करें कि साधन सभी तीन फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए डिटेक्टरों से रिकॉर्डिंग है। - वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए बेदाग नमूने और मुआवजा एकल दाग नियंत्रण के प्रयोग पर आधारित प्रतिदीप्ति सेट द्वार।
नोट: फ्लोरोसेंट संकेतों में किसी भी ओवरलैप को खत्म करने में चैनलों के बीच मुआवजे को एडजस्ट करने के लिए एकल दाग नियंत्रण का प्रयोग करें। मुआवजा समायोजन के लिए इस्तेमाल किया FACS सॉर्टर पर निर्भर करेगा। - प्राथमिक DAPI के आधार पर फाटक सेट अप मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए।
- तितर बितर साजिश (एसएससी-ए बनाम FSC-ए) स्वेटर घटनाओं के लिए चयन करने के लिए समायोजित करें।
- दोहरी के लिए खत्म करने और स्वेटर की घटनाओं के लिए भेदभाव करने FSC और एसएससी ऊंचाई और चौड़ाई के मानकों को निर्धारित करें।
- या तो सीडी के साथ गेट कोशिकाओं उच्च α6 और β1 अभिव्यक्ति के साथ है और इस आबादी से गेट कोशिकाओं34 उच्च अभिव्यक्ति या Sca1 उच्च अभिव्यक्ति।
- पूर्व लेबल FACS ट्यूब में क्रमबद्ध कोशिकाओं।
नोट: कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है दो सामान्य आबादी; α6 + / β1 + / CD34 + / SCA-1 - और α6 + / β1 + / SCA-1 + / CD34 -। हल कोशिकाओं को हर समय बर्फ पर रखा जाना चाहिए जब तक वे इस तरह के सेल संस्कृति या आरएनए अलगाव के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं बहाव के अनुप्रयोगों
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल संवर्धन और आबादी के दो प्रकार के अलगाव के बारे में विस्तार से वर्णन है। उभार के अनुसूचित जाति और एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं चित्रा 2 दिखाता प्रोटोकॉल के प्रमुख कदम। पृष्ठीय 8 सप्ताह पुरानी चूहों की पीठ से हटा त्वचा का उपयोग, हम CD34 मार्कर, जो केवल HFSCs में व्यक्त किया जाता है का उपयोग कर के उभार अनुसूचित जाति समृद्ध; और SCA-1, जो एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं लेबल। चित्रा 3 α6 + / β1 + त्वचा उपकला कोशिकाओं की आबादी के भीतर CD34 और SCA-1 अभिव्यक्ति के विभिन्न पैटर्न से पता चलता है। कोशिकाओं को पहले इंटीग्रिन-α6 की अभिव्यक्ति के अनुसार gated थे और इंटीग्रिन-β1, जो चित्रा 3 में पी 1 के रूप में नामित किया गया है। α6 के लिए सकारात्मक के साथ कोशिकाओं की आबादी / β1expression तो CD34 और SCA-1 कोशिकाओं की अभिव्यक्ति के अनुसार गेटेड था। कोशिकाओं के दो अलग आबादी CD34 बनाम Sca -1 साजिश में देखा जाता है। α6 + / β1
चित्रा 2:। HFSC और केरेटिनकोशिका अलगाव पृष्ठीय त्वचा चूहों से हटा दिया गया था। वसा बंद scraped किया गया था और त्वचा trypsin में incubated था। HFS त्वचा से बंद खत्म कर दिया गया और निलंबन 70 माइक्रोन और 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। सतह एंटीबॉडी कोशिकाओं के साथ के बाद लेबलिंग प्रवाह cytometry का उपयोग हल किया गया और कोशिकाओं के दो आबादी रिश्तेदार अभिव्यक्ति के आधार पर एकत्र किए गए थे: CD34 + - और CD34 - / SCA-1 +। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
चित्रा 3: हल कोशिकाओं की रूपरेखा चूहों से अलग HFSCs के प्रतिशत का आकलन पृष्ठीय खाल के FACS विश्लेषण।। FACS शुद्ध α6 + β1 + कोशिकाओं के लिए हल किया गया CD34 + Sca-1 - (गुलाबी, α6 + β1 + CD34 + Sca-1 -, नीले, α6 + β1 + CD34 - SCA-1 +; नारंगी, α6 + β1 + CD34 - SCA-1 -)। दिखाया गया डेटा संयुक्त और एक साथ हल किया चार चूहों से है। जंगली प्रकार चूहों में α6 + β1 + पूल के लगभग 4-6% (नामित P1) CD34 हैं + / SCA-1 -। HFSCs (P2) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल अच्छी तरह से वयस्क चूहों के पृष्ठीय त्वचा से HFSCs अलग-थलग करने के लिए स्थापित किया गया है, लेकिन उतना ही मार्कर 2,16,23,28,29 के चयन के आधार पर, एचएफ ढांचे के भीतर अन्य आबादी के अलगाव के लिए लागू किया जा सकता है। इस विधि में इस तरह के ऊतक हदबंदी के रूप में सेल अलगाव के अन्य तरीकों, पर विशेष रूप से लाभप्रद है, उस में एक विशेष सेल प्रकार का चयन किया और विषम सेल आबादी का एक मिश्रण से काटा जा सकता है। इसके अलावा, विधि यहाँ वर्णित तेज और विश्वसनीय है और इस्तेमाल किया मार्करों के अंतर अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर चार अलग-अलग HFSC आबादी अप करने के लिए अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह संवर्धन और इस तरह के शाही सेना Seq या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में आगे आणविक विश्लेषण के लिए HFSCs, के अलगाव के लिए, लेकिन यह भी बाद में सेल संस्कृति और विस्तार के लिए और इन विवो कलम बांधने का काम में इस्तेमाल किया जा सकता है।
एक उच्च गुणवत्ता की तैयारी, एकल कोशिका निलंबन एक सफलता की एक आवश्यक घटक हैcessful FACS 29। इस प्रोटोकॉल की क्षमता भी एचएफ अलगाव के लिए इस्तेमाल शुरू सामग्री पर निर्भर करता है। आदेश में शुरू सामग्री देखभाल के क्षेत्र में गैर-एपिडर्मल ऊतक की मात्रा को कम करने के लिए जब शेविंग और जब पृष्ठीय त्वचा विदारक लिया जाना चाहिए। यह पवित्रता और एपिडर्मल कोशिकाओं की उपज में सुधार। आदेश में एक इष्टतम एकल कक्ष निलंबन सुनिश्चित करने के लिए, HFS पूंछ दिशा के लिए एक सिर में और यह सुनिश्चित करना एक छुरी का उपयोग करते हुए कि सभी बाल झुरमुटों छोटे टुकड़ों में टूट जाते हैं एक समय में कम मात्रा में और है कि एक ही एचएफ निलंबन प्राप्त की है बंद scraped किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं देखभाल के साथ संभाल पर हर समय और निलंबन बर्फ पर रखा जाना चाहिए सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए होना चाहिए। अंत में, बाँझ तकनीक संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए विशेष रूप से यदि कोशिकाओं सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल हो रहे हैं के लिए महत्वपूर्ण हैं।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं के विभिन्न आबादी के अलगाव के चार कोशिका की सतह मार्कर का उपयोग करके हासिल की है। एसफल सेल छँटाई के लिए महत्वपूर्ण कदम FACS, उचित मुआवजा एकल दाग नियंत्रण और gating मापदंडों के पदानुक्रम का उपयोग करने का उचित प्रारंभिक सेटिंग्स है। सफल सेल छँटाई भी मलबे के उन्मूलन और प्रभावी ढंग से दोहरी / समुच्चय से स्वेटर घटनाओं भेदभाव की आवश्यकता है। Singlets FSC और एसएससी चौड़ाई और ऊंचाई मापदंडों के आधार पर दोहरी से प्रतिष्ठित किया गया। सेल छँटाई के लिए मानकों सॉर्टर टाइप करने के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन यह भी fluorochrome साधना के अनुसार समायोजित करने की जरूरत है। इधर, पीई प्रतिदीप्ति एक 585/42 फिल्टर का उपयोग कर एकत्र किया गया था, FITC और पीई Cy7 प्रतिदीप्ति एक 530/30 और 780/60 फिल्टर, क्रमशः का उपयोग कर एकत्र किए गए थे और एपीसी प्रतिदीप्ति एक 780/60 फिल्टर का उपयोग कर एकत्र किया गया था।
सेल छंटनी कम DAPI अभिव्यक्ति और आगे तितर बितर पर आधारित जीवित कोशिकाओं के लिए gating द्वारा शुरू किया जाता है। स्वेटर घटनाओं शुरू में बिखराव गेट का समायोजन करके चयन किया गया था और दोहरी एक gating द्वारा समाप्त हो गए gainst आगे singlets बिखराव singlets द्वारा पीछा किया। दो इंटीग्रिन एंटीबॉडी, α6 और β1 एपिडर्मल कोशिकाओं सभी उभार के अनुसूचित जातियों के लिए संवर्धन की गारंटी करने के लिए चयन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। Blanpain एट अल।, CD34 2 के लिए α6 लेकिन सकारात्मक इंटीग्रिन की या तो उच्च या निम्न स्तर व्यक्त उभार के HFSCs की दो आबादी की उपस्थिति देखी गई। नतीजतन, कोशिकाओं β1 उच्च / α6 कम और β1 उच्च दोनों व्यक्त / α6 उच्च CD34 के लिए gating करने से पहले चयनित किया जाना चाहिए। दो आबादी तो एक मार्कर के अनुसूचित जाति, CD34 उभार के लिए विशिष्ट है, और एक मार्कर है कि एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं का चयन करता है, SCA-1 23 की अभिव्यक्ति के आधार पर चयन किया गया था। infundibulum और IFE में इंटीग्रिन-α6 साथ एससीए -1 सह localizes लेकिन एचएफ के उभार में व्यक्त नहीं कर रहा है। इसके विपरीत, उभार के HFSCs CD34 और इंटीग्रिन-α6 23 एक्सप्रेस, दो अलग आबादी के अंतर अलगाव की अनुमति देता है; HFSCs और एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं।
e_content "> मजबूत विधि यहाँ पर चर्चा बहाव के अनुप्रयोगों, जैसे, सेल संस्कृति 23,28 के लिए HFSCs के अलगाव, 23,24 ग्राफ्टिंग और आणविक विश्लेषण 17 के एक नंबर के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अतिरिक्त, विशिष्ट मार्कर का एक संयोजन का चयन करने या अलग का उपयोग कर संवाददाता चूहों अन्य अनुप्रयोगों इस विधि HFSC संख्या में परिवर्तन तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता बीच एचएफ ढांचे के भीतर उप-जनसंख्या के अलगाव की अनुमति देता है, जैसे, Lgr6 21, Lgr5 25, Lrig1 24 और इन कोशिकाओं में होने वाली आणविक परिवर्तन का सीधा तुलना अनुमति देता है। इसके अलावा, नॉकआउट जानवरों बनाम जंगली प्रकार, घाव सज़ा 28 पर अनुसूचित जाति की आबादी में परिवर्तन की जांच और इसलिए अनुसूचित जाति और त्वचा अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उपकरण है।Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Primal Critical Care | 66794-017-10 | |
| Carbon dioxide | - | - | |
| Electro Shaver | Oster | Golden A5 | Shaver from any other company could be used |
| 70% ethanol | Gadot Lab | 830000051 | 96% ehtanol diluted with distilled water |
| Dissection mat | Dissection tools from any provider can be used | ||
| Forceps | Dumont | 11251-10 | Foreceps from any other company could be used |
| Scissors | Dumont | 14094-11 | Scissors from any other company could be used |
| Needles/Pins | - | - | |
| Scalpel | Albion | 10 | Ensure that the scalpel has a blunt end |
| Tissue culture dish 60 mm x 15 mm | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| PBS | - | In house PBS without Calcium and Magnesium | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-050-1A | Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly |
| Pipettes 10 ml | Sigma-Aldrich | Corning, 4488 | |
| Ice | - | - | |
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Minplast Ein-shemer | 35050-43 | |
| 70 µm Cell strainer | Fisher | 22362548 | |
| 40 µm Cell strainer | Fisher | 22362549 | |
| Staining buffer | - | ||
| Centrifuge | Eppendorf 5804 R | 5805 000.017 | |
| FACS tubes with Cell strainer caps | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes | Falcon | 352063 | |
| Integrin β1 | eBioscience | 25-0291 | 1:400 |
| Integrin α6 | eBioscience | 15-0495 | 1:600 |
| Sca I | eBioscience | 11-5981 | 1:200 |
| CD34 | eBioscience | 9011-0349 | 1:300 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 50 ng/ml |
| Dry Chelex | BioRad | 142-2842 | |
| Beaker | Pyrex | - | |
| Distilled H2O | - | - | |
| Stir bar | - | - | |
| NHCl | BioLab | 1903059 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Beit Haemek Biological Industries | 400718 | FBS obtained from a different company can be used |
| 1 L glass bottle | Ilmabor | Boro 3.3 | |
| Bottle top filter | Autofil | 1102-RLS |
References
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