Imobilização de Multi-biocatalisadores em alginato Beads para Cofator Regeneração e melhorada Reutilização

Resumo

Apresentado é o protocolo para biocatalisadores de célula inteira co-imobilização para a regeneração de cofactor e melhorada a capacidade de reutilização, utilizando a produção de L-xilulose como um exemplo. A regeneração cofator é conseguido acoplando duas estirpes de Escherichia coli que expressam enzimas funcionalmente complementares; a imobilização de células inteiras biocatalisador é conseguido por encapsulação de células em esferas de alginato de cálcio.

Resumo

Nós desenvolvemos recentemente um sistema de célula inteira biocatalítica simples, reutilizável e acoplado com a capacidade de regeneração do cofactor e imobilização biocatalisador para melhorar o rendimento de produção e a síntese sustentada. Aqui descrita é o procedimento experimental para o desenvolvimento de um tal sistema constituído por dois E. estirpes de E. coli que expressam enzimas funcionalmente complementares. Em conjunto, estas duas enzimas podem funcionar co-operacionalmente para mediar a regeneração de cofactores caros para melhorar o rendimento do produto do bio-reacção. Além disso, o método de síntese de uma forma imobilizada do sistema biocatalítica acoplado por encapsulação de células inteiras em esferas de alginato de cálcio é relatado. Como um exemplo, apresenta-se a melhoria da biossintese da L-xilulose a partir de L-arabinitol por acoplamento E. células de E. coli que expressam as enzimas desidrogenase L-arabinitol ou NADH oxidase. Sob condições ideais e usando uma concentração inicial de 150mM de L-arabinitol, o rendimento máximo de L-xilulose atingiu 96%, o que é mais elevado do que os relatados na literatura. A forma imobilizada dos biocatalisadores de célula inteira acoplados demonstrou boa estabilidade operacional, mantendo 65% do rendimento obtido no primeiro ciclo após 7 ciclos sucessivos de re-utilização, enquanto que o sistema de célula livre perdeu quase completamente a actividade catalítica. Portanto, os métodos descritos aqui fornece duas estratégias que podem ajudar a melhorar a produção industrial da L-xilulose, bem como outros compostos de valor acrescentado que requerem o uso de co-factores em geral.

Introdução

Biotransformação de célula inteira redutora usando microorganismos tornou-se um método generalizado para a síntese quimio-enzimática de biomoléculas comercialmente e terapeuticamente importantes ^{1 - 3.} Ele apresenta várias vantagens sobre a utilização de enzimas isoladas, particularmente, a eliminação dos processos de purificação a jusante custo intensivo e a demonstração de um tempo de vida prolongado ^4-7. Para vias biocatalíticas onde são necessários co-factores para a formação do produto, os sistemas de célula inteira tem o potencial para proporcionar a regeneração in situ de cofactor atrav....

Protocolo

1. Whole-cell Biocatalisadores Preparação

NOTA: O E. recombinante coli que abrigam pET28a- SpNox ³¹ ou pET28a- HjLAD ²⁸ são doravante referida como E. coli e E. _SpNox coli _HjLAD, respectivamente.

1. Inocular uma única colônia de E. coli _HjLAD em 3 ml de meio suplementado com canamicina (50 ug / ml) de Luria-Bertani (LB) e incubar num incubador agitador de O / N a 37 ^° C, 250 rpm.
2. Dilui-se a cultura de 1: 100 em 200 mL de LB fresco contendo 50 ug / ml de canamicina e incubar a 37 ^°

Resultados

Para permitir a co-factor de regeneração, a síntese de L-xilulose foi realizada num sistema de célula inteira biocatalítica acoplado contendo E. coli e E. _HjLAD coli _SpNox. Após a optimização de vários parâmetros, a capacidade de reutilização do sistema foi melhorada por meio da imobilização que em pérolas de alginato de cálcio (Figura 2).

Discussão

Recentes avanços tecnológicos têm permitido um aumento na comercialização de biotherapeutics recombinantes, resultando em um aumento gradual no seu valor de mercado na indústria de biotecnologia. Um tal avanço é o advento da engenharia metabólica em microorganismos recombinantes, que tem mostrado uma grande promessa no estabelecimento de sistemas industriais escaláveis ^​​38. Tal como acontece com a maioria dos processos, o sucesso na comercialização de biomoléculas recombinantes produzidas por microorganismos.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
LB caldo	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamicina	Fisher	BP906-5
Isopropil β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamida adenina dinucleotídeo hidrato Sigma	Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cisteína	Sigma Aldrich	168149
Ácido sulfúrico	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazol	Sigma Aldrich	C5132
Etanol	Fisher	BP2818-4
Alginato de sódio	Sigma Aldrich	W201502
Cloreto de cálcio di-hidratado	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 incubadora shaker	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Béqueres	Seringa Fisher
	Agulha Fisher
Balança Analítica e de Precisão	Fisher

Pioneer Ohaus