Administração intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; No mouse modelos para o Estudo de inflamação das vias aéreas

Resumo

Demonstramos o procedimento para inoculação intratraqueal de Haemophilus influenzae no trato respiratório inferior de camundongos. Esta é uma ferramenta muito útil para estudar as vias de sinalização que regulam a inflamação das vias aéreas em modelos de camundongos.

Resumo

Aqui, descrevemos um procedimento detalhado de forma eficiente e entregar diretamente Haemophilus influenzae pelas vias respiratórias inferiores de ratos. Nós demonstramos o procedimento para a preparação H. influenzae inóculo, instilação intra-traqueal de H. influenzae para o pulmão, acúmulo de líquido bronco-alveolar lavagem (LBA), análise de células imunes no LBA, e isolamento de RNA para análise de expressão diferencial de genes. Este procedimento pode ser utilizado para estudar a resposta inflamatória do pulmão para qualquer bactérias, vírus ou fungos. A instilação traqueal directa é mais preferido mais de procedimentos de inalação de aerossóis intranasais ou porque mais eficiente proporciona o inoculo bacteriano para o tracto respiratório inferior com menos ambiguidade.

Introdução

A inflamação é um mecanismo de defesa imunitário fundamental da contra agentes infecciosos. Ela promove a erradicação do patógeno e reparação de tecidos danificados. Além disso, facilita a recuperação para um estado normal e saudável ^1. No entanto, a inflamação desregulado muitas vezes leva a doenças inflamatórias crónicas ^2. Inflamação das vias respiratórias é um gatilho inicial para diferentes doenças pulmonares tais como doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), asma e fibrose pulmonar ^3.

A influenzae não tipificável (não encapsulado) Haemophilus (NTHi) é associada com doenças inflamatórias superiores e inferiores do pulmão crónicas ^4,5. É a espécie dominante isolados das vias aéreas inferiores de crianças e adultos com ^4,6,7 doença pulmonar obstrutiva crónica. A resposta inflamatória após a infecção NTHi é caracterizado pela regulação positiva de citocinas pró-inflamatórias (tais como TNF e IL-1β), e é mediada by mitogen activated protein kinase (MAPK) e fator nuclear-kB (NF-kB) através de receptores toll-like (TLR) ^8.

modelos de rato são ferramentas muito úteis para analisar a patologia subjacente de doença inflamatória do pulmão, devido à disponibilidade de linhas diferentes de genes deficientes. Vários métodos têm sido utilizados para inocular / bactérias vivas atenuadas e produtos bacterianos, incluindo a instilação intranasal e ^9,10 inalação na forma de aerossol. Aqui, nós demonstramos a instilação intra-traqueal. Embora seja utilizada menos frequentemente, esta abordagem é mais eficiente e altamente reprodutível devido à entrega directa do inoculo para o tracto respiratório inferior.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes da Comissão Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) do Instituto de Pesquisa Baylor.

1. A cultura não tipificável de Haemophilus influenzae (NTHi) e preparar o inóculo

1. Placa de NTHi numa placa de agar de chocolate e manter a placa invertida numa atmosfera humidificada de CO ₂ incubadora durante a noite a 37 ° C e 5% de CO _2. No dia seguinte, a cultura das bactérias em caldo de infusão cérebro coração. Em seguida, adicionar 1 ml de caldo num tubo esterilizado de 1,5 mL.
2. Centrifugar a 4.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de solução estéril de PBS 1x. Repita este passo uma vez.
3. Transferir 100 ul da solução de re-suspensa em 900 ul de 1x PBS e medir a absorvência da cultura diluída a 600 nm comprimento de onda num espectrofotómetro.
4. Determinar a unidade de viabilidade e de formação de colóniass (CFUs) do inoculo de cultura de diluições em série 1:10 em placas de agar de chocolate e incubando durante a noite a 37 ° C e 5% de CO _2.
5. Com base na viabilidade e CFU determinada a partir da etapa anterior, ajustar o inóculo até uma concentração final de 20 x 10 ⁶ CFU / mL.

2. Intra-traqueal (IT) A instilação

1. Injetar o mouse por via intraperitoneal (ip) com 0,1 ml / 10 g de peso corporal do rato com um + 20 mg solução de 150 mg / ml de cetamina / ml de xilazina. O procedimento deve ser feito na capa com uma fonte de luz para manter o animal aquecido.
2. Comprima o espaço interdigital do mouse para verificar se o mouse está devidamente anestesiados.
3. Posicione o mouse sobre as suas costas. Raspar a área ventral do pescoço e desinfectar com clorexidina e álcool etílico a 70%.
4. Levantar a pele da parte ventral superior do pescoço de ratos usando uma pinça dente. Fazer uma pequena incisão (0,5-1,0 cm) acima do timo utilizando um bisturie dissecar cuidadosamente o músculo para expor a traqueia.
   1. Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 27 G, injectar lentamente 0,05 ml de ar, seguido por 0,05 ml de NTHi obtidos a partir de uma secção ou solução salina como controlo, seguida por outra de ar de 0,05 ml. Manter animais vertical por cerca de 1 min.
5. Fechar a incisão com cola cirúrgica. Mantenha o mouse lateralmente reclinada e quente por cerca de 10 min.

3. Coleção LBA

1. Sacrificar o mouse por cervical deslocamento de 24 horas após a infecção.
2. Abrir a cavidade abdominal do rato com uma tesoura anatômicas e cortou a aorta ventral a sangrar. Expor a parte ventral do pulmão.
3. Expor a traquéia e entubar com um cateter de calibre 20. Instilar 0,8 ml de tampão LBA (1x PBS, 0,1% de dextrose, 10 U / ml de heparina) e recolher a lavagem por aspiração suave. Repita este procedimento três vezes.
4. Contar o número total de células em 100 ul de suspensão de LBA utilizando um hemocytometros em 10x com Trypan Blue coloração.
5. Preparar lâminas para coloração Giemsa modificado. Alíquota de 100 uL de BALF nos poços apropriados da Cytospin e centrifugar a 500 xg durante 5 min. Secam-se as lâminas durante 10 minutos e corar as células com corante de Giemsa modificado de acordo com os protocolos do fabricante.
6. Use as restantes células para posterior análise, tal como células de fluorescência activada (FACS), microscopia confocal, a expressão do gene e western blot ^11-13.

4. Preparação Histopatologia

1. Para análise histopatológica, infectar ratos com NTHi como descrito no passo 2.4. Após 24 horas de infecção, sacrificar os animais por deslocação cervical. Cortar abrir a cavidade torácica, com uma tesoura anatômicas para expor os pulmões e a traqueia, como mencionado antes. Em seguida, insira o cateter calibre 20 na traqueia.
2. Encha os pulmões com 2% de solução de agarose quente preparado em formalina a 4%. Uma vez opulmões são totalmente inflado, gelo lugar no topo dos pulmões para solidificar a solução de agarose.
3. Em seguida, retire cuidadosamente a ficha torácica e colocá-lo em uma solução de 50 ml de formalina a 4% em 1x PBS até que seja processada para (H & E) seções hematoxilina e eosina.

5. FACS coloração de células no LBA

1. Colocar 1 x 10 ⁵ células do fluido de LBA numa placa de micro titulação de fundo em V de 96 poços.
2. Lavar as células com 300 uL de PBS frio 1x e centrifugação a 4000 xg durante 3 minutos a 4 ° C.
3. Corar as células com solução de coloração de células em 100 ul de PBS 1x (1: 1000 de diluição) e manter à temperatura ambiente durante 15 min.
4. Lavar as células com 300 uL de frio 1x PBS a 4000 xg durante 3 minutos a 4 ° C.
5. Manter as células em 100 ul de tampão de lavagem de FACS [tampão de lavagem (1x PBS, 2% de FBS, 1 mM de EDTA, 0,1% de azida de sódio] contendo 1: 100 diluído Fc-bloco durante 15 min a 4 ° C.
6. células centrifugar a 4000 xg por 3 min e descartar supernatant.
7. As células são coradas com 100 ul de coquetel de coloração da superfície (diluição 1: 100) em tampão de lavagem de FACS durante 30 min a 4 ° C.
8. Lave as células três vezes com 300 ul de tampão de lavagem FACS a 4000 xg durante 3 minutos a 4 ° C.
9. Fixar as células em 100 uL de paraformaldeído a 4% durante 15 min à temperatura ambiente.
10. Lavar as células duas vezes com 300 ul de 1x PBS a 400 xg durante 3 min a 4 ° C e re-suspensão em 300 ul de tampão de lavagem de FACS.
11. Tornar os controlos de coloração de cor única, utilizando citometria de fluxo esferas.
    1. Adicionar uma gota de grânulos para a placa de microlitro de 96 poços de fundo em V e lava-se com 200 ul de PBS 1x.
    2. Adicionar 1 ml de anticorpo de coloração a 100 ul de PBS 1x e grânulos e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    3. Lavar as pérolas duas vezes com 300 ul de PBS 1x.
12. Analisar controles e células isoladas coradas por citometria de fluxo ^14.

6. A homogeneização de tecido pulmonar para isolar RNA

1. Após a infecção, recolhe um pequeno pedaço de pulmão (20-40 mg) e mantê-lo em RNA estabilizador reagente a 4 ° C durante a noite. Em seguida, armazená-lo a -80 ° C até ao passo seguinte.
2. Lavar os tecidos do pulmão em frio 1x PBS para se livrar do reagente de estabilização RNA.
3. Colocar o tecido em um tubo de 1,5 ml de centrífuga contendo tampão de lise (1 mL de tampão de lise + 10 ul β-mercaptoetanol).
4. Pique o tecido em pequenos pedaços com uma tesoura de pontas e homogeneizar utilizando um pilão pelota do motor sem fio para 20-40 seg.
5. Manter o lisado em gelo durante 5 minutos e continue com a etapa 7.1.

7. RNA isolamento do pulmão

1. Centrifuga-se o lisado a 18.000 xg durante 3 min. Remover o sobrenadante por pipetagem e transferir cuidadosamente para um novo tubo de 1,5 mL.
2. Adicionar 1 volume de etanol a 70% ao lisado. Misturar imediatamente por pipetagem e esperar por 2-4 min.
3. Transferir para 700 ul de lisado a uma coluna de rotação colocadoem um tubo de recolha de 2 ml.
4. Centrifugar a 9.600 xg durante 15 seg e descartar o fluxo de passagem.
5. Adicionar 350 ul de tampão de lavagem rigorosa e centrifugar a 9600 xg por 15 s. Descartar o fluxo de passagem.
6. Adicionar 80 ul de ADNase I directamente para a membrana da coluna de spin e mantê-lo à temperatura ambiente durante 15 min.
7. Adicionar 350 mL de buffer rigorosas de lavagem para a coluna de centrifugação e centrifugar a 9600 xg por 15 s. Descartar o fluxo de passagem.
8. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem de ARN e centrifugar a 9600 xg durante 15 seg. Descartar o fluxo de passagem.
9. Adicionar 500 mL de tampão de lavagem RNA e girar a 9.600 g durante 2 min. Descartar o fluxo de passagem.
10. Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml e centrifugar a 9600 x g durante 1 min. Descartar o fluxo de passagem.
11. Adicionar 30-50 mL água livre de ARNase directamente para a coluna de centrifugação e centrifugar a 9600 x g durante 1 min. ARN armazenar a -80 ° C.
12. Realizar a análise de RNA-Seq ^14.

Resultados

Instilação intra-traqueal resultou num marcadamente aumentada número de leucócitos no LBA (Figura 1A, painel esquerdo) do que a instalação com solução salina. A análise da contagem diferencial dos leucócitos mostrou claramente aumentou a infiltração de neutrófilos (Figura 1, painel da direita). A análise FACS das células no LBA confirmou ainda mais o aumento do número de neutrófilos (Figura 1B). A análise histológica de secções de H @ E-...

Discussão

Aqui, nós descrevemos um procedimento único e minimamente invasivo para inocular os pulmões de ratinhos com um agente patogénico bacteriano pulmão. Nós demonstramos que este procedimento pode ser utilizado para estudar a função de genes diferentes que utilizam ratinhos que são deficientes em genes de vias de sinalização inflamatórias. Este procedimento também pode ser usado para estudar as respostas inflamatória a infecções pulmonares virais e fúngicas. As vantagens deste processo em relação aos outros métodos, tais com...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Prato de ágar chocolate	Fisher Scientific	CAS50-99-7
Dextrose Anidra	Themo Scientific	R01300
Heparina	Hospira,Inc	RL-3010
Solução rápida e hábil	Sigma	GS500-500ML
Agulha de seringa 20/26G	Seringa BD(	REF305115/175)
Iml	BD	REF 309602
Cateter 20GA	BD	REF
Tesoura de dissecação, reta, 10 cm de comprimento	kentscientific	INS600393
, serrilhada, 10 cm de comprimento	kentscientific	INS650915
pinça #5 aço inoxidável, 11 cm de comprimento	kentscientific
Formalina 10%	Fisher Scientific	CAS 67-56-1
Agarose	peqlab	35-1020
Tubos de poliestireno de 5ml com fundo redondo	BD	REF 352058
1,5 ml Tubos de microcentrífuga	Light Labs	A-7001-R
Reasy Mini  kit	Qiagen	74104
Motor de pellets pestile (Homoginizador de tecido)	poços Sigma	Z359971-1EA
V bottom Thermo		2605
1X PBS	Gibco	10010-023
OneComp eBeads eBioscience		01-1111-42
CD45.2-APC	eBioscience	17-0454-81	Diluição de trabalho 1:100
Ly-6G-eFlor 450	eBioscience	48-5931-82	Diluição de trabalho 1:100
BSA	HyClone	SH30574.03
RBC Lysis Buffer (10X)	Biolegend	420301
Live/Dead fixable aqua kit de coloração de células mortas	Invitrogen	L-34957
EDTA (0.5M)	lifetechnologies	15575-020
CD16/ CD32 FcBlock	BD	553142
Facs tubos de poliestireno tubo inferior redondo	BD	352052
Formaldeído	Polyscience	4018

381433 pinça de íris INS600095Placas de microtitulação de 96