Demonstramos o procedimento para inoculação intratraqueal de Haemophilus influenzae no trato respiratório inferior de camundongos. Esta é uma ferramenta muito útil para estudar as vias de sinalização que regulam a inflamação das vias aéreas em modelos de camundongos.
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Artigo de método
Administração intra-traqueal de
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aqui, descrevemos um procedimento detalhado de forma eficiente e entregar diretamente Haemophilus influenzae pelas vias respiratórias inferiores de ratos. Nós demonstramos o procedimento para a preparação H. influenzae inóculo, instilação intra-traqueal de H. influenzae para o pulmão, acúmulo de líquido bronco-alveolar lavagem (LBA), análise de células imunes no LBA, e isolamento de RNA para análise de expressão diferencial de genes. Este procedimento pode ser utilizado para estudar a resposta inflamatória do pulmão para qualquer bactérias, vírus ou fungos. A instilação traqueal directa é mais preferido mais de procedimentos de inalação de aerossóis intranasais ou porque mais eficiente proporciona o inoculo bacteriano para o tracto respiratório inferior com menos ambiguidade.
Introdução
A inflamação é um mecanismo de defesa imunitário fundamental da contra agentes infecciosos. Ela promove a erradicação do patógeno e reparação de tecidos danificados. Além disso, facilita a recuperação para um estado normal e saudável 1. No entanto, a inflamação desregulado muitas vezes leva a doenças inflamatórias crónicas 2. Inflamação das vias respiratórias é um gatilho inicial para diferentes doenças pulmonares tais como doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), asma e fibrose pulmonar 3.
A influenzae não tipificável (não encapsulado) Haemophilus (NTHi) é associada com doenças inflama....
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Protocolo
Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes da Comissão Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) do Instituto de Pesquisa Baylor.
1. A cultura não tipificável de Haemophilus influenzae (NTHi) e preparar o inóculo
- Placa de NTHi numa placa de agar de chocolate e manter a placa invertida numa atmosfera humidificada de CO 2 incubadora durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. No dia seguinte, a cultura das bactérias em caldo de infusão cérebro coração. Em seguida, adicionar 1 ml de caldo num tubo esterilizado de 1,5 mL.
- Centrifugar a 4.000 xg durante 5 min à tempe....
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Resultados
Instilação intra-traqueal resultou num marcadamente aumentada número de leucócitos no LBA (Figura 1A, painel esquerdo) do que a instalação com solução salina. A análise da contagem diferencial dos leucócitos mostrou claramente aumentou a infiltração de neutrófilos (Figura 1, painel da direita). A análise FACS das células no LBA confirmou ainda mais o aumento do número de neutrófilos (Figura 1B). A análise histológica de secções de H @ E-.......
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Discussão
Aqui, nós descrevemos um procedimento único e minimamente invasivo para inocular os pulmões de ratinhos com um agente patogénico bacteriano pulmão. Nós demonstramos que este procedimento pode ser utilizado para estudar a função de genes diferentes que utilizam ratinhos que são deficientes em genes de vias de sinalização inflamatórias. Este procedimento também pode ser usado para estudar as respostas inflamatória a infecções pulmonares virais e fúngicas. As vantagens deste processo em relação aos outros métodos, tais com.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Carson Harrod pela leitura crítica do manuscrito. Também agradecemos ao Sr. Minghui Zeng e aos Drs. Mahesh Kathania e Prashant Khare por suas contribuições. Este trabalho foi apoiado por doações da American Cancer Society (bolsa Research Scholar, 122713-RSG-12-260-01-LIB) e do Sammons Cancer Center (bolsa do Projeto Piloto) para K. Venuprasad.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Prato de ágar chocolate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anidra | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparina | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Solução rápida e hábil | Sigma | GS500-500ML | |
| Agulha de seringa 20/26G | Seringa BD( | REF305115/175) | |
| Iml | BD | REF 309602 | |
| Cateter 20GA | BD | REF | |
| Tesoura de dissecação, reta, 10 cm de comprimento | kentscientific | INS600393 | |
| , serrilhada, 10 cm de comprimento | kentscientific | INS650915 | |
| pinça #5 aço inoxidável, 11 cm de comprimento | kentscientific | ||
| Formalina 10% | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| Tubos de poliestireno de 5ml com fundo redondo | BD | REF 352058 | |
| 1,5 ml Tubos de microcentrífuga | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Motor de pellets pestile (Homoginizador de tecido) | poços Sigma | Z359971-1EA | |
| V bottom Thermo | 2605 | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads eBioscience | 01-1111-42 | ||
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Diluição de trabalho 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Diluição de trabalho 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua kit de coloração de células mortas | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/ CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubos de poliestireno tubo inferior redondo | BD | 352052 | |
| Formaldeído | Polyscience | 4018 |
Referências
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Barnes, P. J.
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Reimpressões e permissões
