Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.
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Artigo de método
Combinando Duplo Fluorescência
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Detecção de expressão de genes em diferentes tipos de células do cérebro, por exemplo, neurónios, astrócitos, oligodendrócitos, microglia e oligodendrócitos precursores, pode ser dificultada pela falta de anticorpos primários ou secundários específicos para a imunocoloração. Descrevemos aqui um protocolo para detectar a expressão de três genes diferentes na mesma secção utilizando cérebro de fluorescência dupla de hibridação in situ com duas sondas específicas para o gene seguido de imunocoloração com um anticorpo de alta especificidade dirigida contra a proteína codificada por um terceiro gene. O gene Aspartoacyclase (ASPA), de mutações que podem conduzir a uma doença da matéria branca humana rara - doença de Canavan - é pensado para ser expresso em oligodendrócitos e a microglia, mas não em neurónios e astrócitos. No entanto, o padrão de expressão precisa de ASPA no cérebro tem ainda de ser estabelecidos. Este protocolo nos permitiu determinar que ASPA é expressa em um subconjunto de oligodendrócitos maduros umND pode ser geralmente aplicado a uma ampla gama de estudos padrão de expressão do gene.
Introdução
As células da glia, que são as células mais abundantes no sistema nervoso central (SNC), compreendem oligodendrócitos (células mielinizantes do sistema nervoso central), oligodendrócitos precursores (PO, também conhecidos como "células") NG2, astrócitos e microglia. Há um interesse crescente nas funções de células gliais e de seus papéis potenciais em doenças neurológicas 1. Por exemplo, a doença de Canavan (CD) é uma doença neurodegenerativa hereditária começando no início da infância com leucodistrofia espongiforme e uma perda progressiva de neurónios, que conduz a morte geralmente antes dos 10 anos de idade 2,3. As mutações no gene Aspart....
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Protocolo
Declaração de ética:
Rato criação e manipulação estão em conformidade com os regulamentos UK Home Office e as orientações do comitê de ética UCL, cumprindo com os Animais (procedimentos científicos) Act de 1986 do Reino Unido e dos seus regulamentos de alteração 2012.
Nota: Todas as soluções devem ser feitos com pirocarbonato de dietilo (DEPC) - água tratada para destruir qualquer RNase residual. Para o tratamento DEPC, adicione DEPC (1 ml por litro), agitar vigorosamente até que todos os glóbulos DEPC desapareceram depois autoclave para degradar o DEPC.
1. RNA Probe Synthesis
- CUIDADO: Ao man....
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Resultados
Este artigo descreve um método para a ISH dupla fluorescência seguido por imunomarcação em seções do cérebro do rato. Uma breve descrição deste protocolo é demonstrado na Figura 1. O primeiro passo foi sintetizar sondas específicas para Aspa e MBP (proteína básica da mielina). Para verificar que as sondas foram sintetizadas, uma pequena aliquota de cada reacção foi efectuada num gel de agarose. O modelo linear fraco e uma grande quantidade de ARN a sond.......
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Discussão
Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para um ARN de dupla hibridização in situ seguindo-se a imunocoloração. Temos utilizado este protocolo para confirmar que Aspa é expresso em oligodendrócitos maduros em várias áreas do cérebro.
Este processo multi-passo tem muitas armadilhas potenciais que podem afectar a sensibilidade e deve ser evitado. Em primeiro lugar, todas as soluções e tampões de armazenamento para a reacção de transcrição precisa de ser isenta de.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
O trabalho nos laboratórios dos autores foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas do Reino Unido (BB/J006602/1 e BB/L003236/1), pelo Wellcome Trust (WT100269MA) e pelo Conselho Europeu de Pesquisa (ERC, Programa "Ideias" 293544). SJ foi apoiado por uma bolsa de longo prazo da EMBO. Os autores agradecem a Stephen Grant por sua assistência técnica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Formamida deionizada | Sigma | F9037 | para tampão de bloqueio ISH |
| Cloreto de sódio | Sigma | S3014 | |
| Base Trizma Sigma | T1503 | ||
| Ácido clorídrico | VWR International | 20252.290 | |
| Fosfato de sódio monobásico anidro | Sigma | S8282 | |
| Fosfato de sódio dibásico di-hidratado | Sigma | 30435 | |
| TRNA de levedura | Roche | 10109495001 | |
| Solução de 50x Denhardt | Technologies | 750018 | |
| Sulfato de dextrano | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Fonte Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Acetato de sódio | Sigma | S2889 | |
| Fenol equilibrado | Sigma | P4557 | |
| Clorofórmio | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Álcool isoamílico | Aldrich | 496200 | |
| Etanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polimerase | Promega | P4074 | |
| Tampão de transcrição | Promega | P118B | |
| 100 mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldeído | Sigma | P6148 | |
| Papel de filtro | Fisher científico | 005479470 | |
| Sacarose | Sigma | 59378 | |
| Dietil pirocarbonato | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Tesoura de dissecação | World Precision Instruments | 15922 | |
| Agulha de calibre 25 | Terumo | 300600 | |
| Bomba peristáltica | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Tesoura de íris | Weiss | 103227 | |
| pinça No.2 Instrumentos | Precisão Mundial | 500230 | |
| Matriz Cerebral Coronal | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Lâmina de barbear | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Criostato/micrótomo | Bright | ||
| Superfrost mais slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Citrato de sódio | Sigma | S4641 | para 65 &graus; C tampão |
| de lavagem Formamida | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Lamínulas | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Reagente de bloqueio | Roche | 11096176001 | |
| Soro de ovelha inativado por calor | Sigma | S2263 | |
| Caneta hidrofóbica | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC anticorpo conjugado com POD | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Mais o sistema de fluoresceína | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1.500 |
| α-DIG AP-conjugado | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets Roche | 11496549001.22 | ||
| µ Filtro M | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugado α-rabbit anticorpo Life | technologies | A-31573 | 1:1,000 |
| bisBenzimida H 33258 | sigma | B2883 | |
| Meio de montagem | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscópio | Leica |
Referências
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res....
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Reimpressões e permissões
