Injeção Artéria Intra-ilíaca para eficiente e seletiva Modelagem de microscópico metástase óssea

Resumo

Este manuscrito fornece o procedimento detalhado de injeção de artéria intra-ilíaca (IIA), uma técnica para entregar células cancerígenas especificamente aos tecidos dos membros posteriores, incluindo ossos, para estabelecer metástases ósseas experimentais. Embora inicialmente estabelecido com modelos de tumor de mama, esse protocolo pode ser facilmente estendido a outros tipos de câncer.

Resumo

A injeção de artéria intra-ilíaca (AII) é uma abordagem eficiente para introduzir lesões metastáticas de várias células cancerígenas em animais. Em comparação com as injeções intracardíacas e intratibiais amplamente utilizadas, a injeção de AII traz várias vantagens. Primeiro, ele pode fornecer uma grande quantidade de células cancerígenas especificamente para os ossos dos membros posteriores, fornecendo assim eventos de colonização em estágio inicial espacialmente sincronizados e permitindo quantificação robusta e detecção rápida de células tumorais disseminadas. Em segundo lugar, injeta células cancerígenas na circulação sem danificar os tecidos locais, evitando assim processos inflamatórios e de cicatrização de feridas que confundem o processo de colonização óssea. Em terceiro lugar, a injeção de IIA causa muito pouco crescimento metastático em órgãos não ósseos, evitando assim que os animais sucumbam a outras metástases vitais e permitindo o monitoramento contínuo de lesões ósseas indolentes. Essas vantagens são especialmente úteis para a inspeção da progressão de células cancerígenas únicas para micrometástases multicelulares, que foram amplamente evasivas no passado. Quando combinada com abordagens de ponta de imagens biológicas e histologia óssea, a injeção de IIA pode ser aplicada a vários fins de pesquisa relacionados a metástases ósseas.

Introdução

Metástases representam mais de 90% das mortes causadas por tumores sólidos. O osso é o órgão mais comum afectado por metástases de vários tipos de cancro, especialmente cancros da mama e da próstata. Quando diagnosticado na clínica, metástases ósseas geralmente já entraram estágios avançados com qualquer osteolíticas ou osteoblásticas alterações nos ossos, muitas vezes acompanhados com sintomas neurológicos.

Estudos anteriores predominantemente focado nas metástases ósseas osteolíticas evidentes ^1-3, no entanto atualmente temos a compreensão de micrometástases em ossos limitado antes do início do processo de osteolítico. Isto é, pelo menos em parte devido à falta de modelos e abordagens experimentais adequadas. Modelos de ratos geneticamente modificada de cancro da mama frequentemente metastizar para os pulmões, mas muito menos eficientemente aos ossos ^4. Da mesma forma, os tumores ortotopicamente transplantados raramente desenvolvem metástases ósseas espontâneas, com alguma 4T1 carcinom mamária osso-tropicaluma sub-clones e MSP overexpressed modelo de rato transgénico PyMT como exceções ^5-7. Perfuração intra-tibial pode entregar células cancerosas para o osso ^8-10, mas também incorre danos e inflamação de tecidos locais. Atualmente injecção intra-cardíaca de linhas celulares de cancro da mama tem sido a principal abordagem para investigar a colonização óssea ^11-13. No entanto, depois de as células cancerosas são introduzidos no ventrículo esquerdo apenas uma proporção limitada vai finalmente chegar osso e medula óssea, o que torna difícil controlar metástases microscópicas de um modo quantificável.

Neste estudo, nós estabelecemos uma técnica, ou seja, intra-arterial ilíaca (IIA) de injecção ^14, para entregar seletivamente as células cancerosas nos tecidos dos membros posteriores, enriquecendo assim a célula de câncer nos ossos e medula óssea, sem causar danos aos tecidos locais. Por causa da especificidade do osso, esta abordagem também permite tempo suficiente para que as células cancerosas indolentes para eventualmente colonizar antes a umsucumbir a animais produtores de tumores primários ou metástases em outros órgãos vitais. Quando combinado com uma variedade de outras técnicas, tais como a imagiologia bioluminescente, imunofluorescência e a histomorfometria óssea, AII injecção é potencialmente útil para uma ampla gama de efeitos de pesquisa relacionadas com metástases ósseas, especialmente para controlar a progressão de células cancerígenas único de multi-célula micrometástases. Em particular, foi demonstrado que AII injecção permite visualizar as interacções entre as células cancerosas e vários tipos de células circundante no microambiente do osso.

Protocolo

Todo o trabalho animal foi feito de acordo com as orientações de cuidados de animais da Baylor College of Medicine.

1. Preparação de células

NOTA: As linhas de células de cancro diferentes podem ser usadas para injecção AII dependendo fins de investigação. Temos usado linhas celulares de cancro da mama MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 e linha de células de cancro da próstata C4-2 em nossa pesquisa. Normalmente usamos tanto vaga-lume células cancerosas marcadas com GFP luciferase e para o nosso estudo e mostrar alguns dados aqui a partir da linha de células MCF7 GFP-luciferase marcado.

1. Manter as células em DMEM contendo 10% de FBS e 0,1 mg / ml de penicilina-estreptomicina a 37 ° C em 5% de CO _2.
2. Antes da injecção AII, trypsinize células a 80 - 90% de confluência com uma solução / EDTA a 0,25% de tripsina. Use PBS frio para lavar as células duas vezes, e re-suspender as células em 10 ml de PBS para contagem das células. Para remover o PBS, as células de centrifugação a 800 xg durante 5 min.
3. células re-suspensãoa uma concentração de 5 X 10 ⁶ células / ml em PBS arrefecido em gelo.
4. Utilize 100 mL GFP e células cancerosas marcado com a luciferase de pirilampo para IIA injeção de um mouse.
   Nota:. Portanto, o número de células recebidas por cada animal é de 5 x 10 ⁵ Este número pode precisar de ser alterada com base na agressividade de linhas celulares.
5. Manter as suspensões de células em gelo.
   Nota: As vibrações podem ser necessários para evitar a agregação de células a cada poucos minutos até que esteja pronto para a injecção. Para algumas linhas de células (tais como MDA-MB-231), procedimentos mais rigorosas (por exemplo, passando através de 45 um filtro de células) podem ser necessários para evitar a agregação. Por favor note que a obstrução dos vasos pode causar necrose do tecido e, portanto, confundindo os experimentos.

2. Preparação de animais

1. Para dor de animais de gestão, dar origem a 5 mg / kg / dia carprofeno (ou outro analgésico) com suplemento dietético para os ratinhos não menos do que 24 horas antes da cirurgia. Administradoruma dose de 0,1 mg / ml de buprenorfina por via subcutânea 60 minutos antes da cirurgia. Nota: um procedimento opcional é implantar estradiol pallet na parte traseira de animais para fornecer estradiol extra. Isto irá acelerar a crescer de células ER + de cancro (por exemplo, células MCF-7) ^9.
2. Anestesiar de 4 - 6 semanas de idade rato (aproximadamente 20 g) com cetamina (80-100 mg / kg) e xilazina (10 -12,5 mg / ml) por injecção intraperitoneal.
3. Confirme o nível adequado de sedação de um rato 20 g por pitada dedo do pé e da observação de uma redução de 50% na taxa respiratória e rosa membranas mucosas (por exemplo, pele de orelha de rato e pele pata). Continuar a acompanhar estes sinais vitais a cada 15 minutos durante a cirurgia. Nota: Nenhum movimento do animal indica que o animal é anestesiado e suficientemente pronta para a cirurgia.
4. Use vet pomada nos olhos para evitar a secura.
5. Raspar o mouse na parte inferior do abdômen, especialmente a área da virilha direita onde a cirurgia e injeção vaitomar lugar.
   Nota: Isto não é necessário se forem utilizados ratos nus atímicos.
6. Coloque o mouse sobre as suas costas, espalhar as pernas na sua posição natural e ficar ao pé, papelão dissecção móvel com fita adesiva.
7. Limpe a área da virilha direita com etanol 70% isopropílico embebido cotonetes estéreis, seguiu com betadine paramentação várias vezes.

3. O Iliac Vein Comum e Artéria Localização e Separação

1. Faça uma incisão na pele de 1,0 - 1,2 cm de comprimento entre o ^4º e ^5º mamilos no abdômen inferior direito usando estéreis, # 10 carbono lâminas de bisturi de aço realizada em uma alça No. 3. Em seguida, usar uma cobertura cirúrgica estéril para cobrir o corpo do animal, excepto no local da incisão.
2. Mova o animal a bancada padrão superior dissecção microscópio. Utilize uma ampliação de 4X para injecção.
3. De acordo com uma ampliação de 4X do microscópio de dissecção, inserir uma pinça de separação sem corte entre o tecido gordo e o peritoneum, e empurrar os tecidos para fora de ambos os lados para expor os vasos ilíacos e nervos (ver Figura 1).
   Nota: A artéria aorta entre a partir da linha média e a parte inferior do ramos das artérias é chamado de artéria ilíaca comum. Este é o local onde a injeção ocorre.
4. Utilizar um par de fórceps finos rectas para romper o tecido conjuntivo (como uma membrana) entre os vasos e o nervo, mais perto dos vasos.
5. Alternar as pinça fina direto para a mão esquerda. Pegue um par de fórceps finos angulares usando a mão direita. Inserir a pinça mão direita na mesma posição em que os tecidos conjuntivos foram quebrados. E depois ficar a pinça da mão direita através de, por baixo das embarcações.
6. Ao mesmo tempo, inserir a pinça da mão esquerda para dentro dos tecidos conjuntivos no lado esquerdo dos vasos para orientar a pinça da mão direita passando.
7. Uma vez que a pinça da mão direita fica abaixo dos vasos, tentar separar os vasos do ti circundantessue um pouco mais, em seguida, mantê-los no topo da pinça da mão direita.
8. Use uma pinça da mão esquerda para entregar a ponta de uma sutura de seda 4-0 para a pinça mão direita, e em seguida, puxe o fio de sutura suave e lentamente através debaixo dos vasos. Nota: Agora ambos os navios veia e artéria comuns são levantadas para cima pela sutura (ver Figura 2).

4. Injeção e Pós-injeção de Cuidados

1. Preparar as células para injectável em seringa de insulina 31 G. Utilizar 100 ul de suspensão de células em PBS por injecção. Certifique-se de pipetar para cima e para baixo várias vezes para separar as células e evitar a agregação de modo a que as células injectadas não vai entupir e bloquear o fluxo de sangue.
2. Com a pinça em ângulo na mão esquerda, coloque a pinça debaixo dos vasos ao longo da orientação da sutura, e abra os dois braços da pinça, tendo as embarcações detidas suavemente sobre a pinça.
   Nota: O intervalo entre os dois braços de pinça será o ilocal njection.
3. Segure a 31 G agulha com 100 suspensões de células ul na mão direita, com o bisel da agulha para cima, pronto para a injecção.
4. Inserir a agulha para o lúmen da artéria (sangue vai entrar na ponta da agulha). Em seguida, empurrar lentamente suspensão de células em injectar as células. A suspensão de células vai empurrar o sangue vermelho no vaso. Tente não quebrar os vasos ou vazar a suspensão de células para fora.
5. Quando a injecção está terminada, puxe de volta a agulha e continue segurando os vasos em cima a pinça da mão esquerda para parar o sangramento. Em seguida, afastar a sutura.
6. Afaste os fórceps da mão esquerda e, rapidamente, use um cotonete para pressionar área da incisão da artéria para parar o sangramento.
   Nota: Geralmente 5-10 min pressão contínua é suficiente para parar o sangramento.
7. Quando o sangramento parar, use cola de pele para fechar as bordas da pele da área da cirurgia. Faça uma marca auricular, e verificar se há bioluminescência sinalização para examinar a distribuição de células injetadas.
   Nota: Uma injecção bem sucedido resultará numa imagem semelhante à da Figura 3.
   1. Verificar sinalização bioluminescência por injecção de 100 ul de 15 mg / ml de luciferina em PBS a 75 mg / kg de concentração de rato através do seio intra-orbital.
      1. Para injecção intra-orbital, colocar os dedos em ambos os lados do olho do rato, utilize pressão para fazer olho bola pop ligeiramente fora da moldura dos olhos, coloque 28 g de agulhas de insulina seringa entre bola de olho e nariz, e depois empurrar lentamente a seringa para injetar luciferina .
         Nota: Na posição correcta, a agulha deve ser capaz de chegar a uma profundidade de 2 - 3 mm, antes de bater de tecido duro (osso).
      2. Coloque o mouse no sistema de imagem para in vivo de imagens animal inteiro por 10-60 seg dentro de 5 min (ver Figura 3).
         Nota: Um procedimento opcional é implantar estradiol sedimento na parte traseira de animais para fornecer estradiol extra. Isto irá acelerar o crescimento de células cancerosas ER + (por exemplo, MCF-7células) ^15.
8. Deixe o mouse sobre uma almofada de aquecimento morna até que acorda. Monitorar o sangramento, inchaço, sinais de deiscência e dor no período pós-cirúrgico. Coloque os ratos de volta para a gaiola com cobertura analgésica (suplemento dietético carprofin sugerido) dada para o manejo da dor até que não haja sinais de dor. Preste muita atenção e cuidado para os animais durante 7 dias após a cirurgia.

5. Monitorização do Crescimento metastático

1. histomorfometria:
   1. Tumor colheita rolamento tecidos ósseos, fixar os ossos em paraformaldeído a 4% durante 24 h, em seguida, decalcify-los em pH 7,0 solução de EDTA 14% para 3 - 5 dias e submetê-las a inclusão em parafina, como descrito anteriormente ^14.
   2. Secção os tecidos ósseos incorporar em parafina com a espessura de 3 micrómetros e executar método histológico convencional da coloração de hematoxilina / eosina como previamente descrito ^14.
2. Immunohistochemisexperimentar:
   1. Óssea rolamento tumor embebido em parafina Assunto desliza à imuno-histoquímica coloração para diversos fins, como descrito anteriormente ^14. Resumidamente, as células cancerosas imunocoloração MCF7 por anticorpos anti-GFP, e células osteogénicas imunocoloração (pré-osteoblastos e osteoblastos) por anticorpos anti-Osterix e anticorpos anti-fosfatase alcalina (ALP), respectivamente.

Resultados

A figura 1 ilustra a localização anatômica e relação de artéria ilíaca comum (vermelho) e veia (azul).

A Figura 2 mostra a posição relativa dos vasos ilíacos e nervos sob microscopia de dissecção. Como representado na Figura 2A, os vasos e nervos estão bem abaixo da parede peritoneal e pode ser revelado após a incisão na pele é feita e o peritônio é empurrado. A veia ilíaca co...

Discussão

Embora apenas a artéria ilíaca é alvo de injeção de células cancerosas, recomendamos a separação de ambos veia ilíaca e artéria dos tecidos circundantes, e para levantá-los juntos como um pacote. Isto é porque a veia e a artéria extensivamente contactar uns com os outros, e a parede do vaso venoso é fina e é fácil de quebrar. Portanto, para uma injeção de sucesso, ele economiza tempo e esforço para segurar os dois navios juntos, embora as células cancerosas são injectados apenas para a artéria. Uma sutura de seda 4-0 é ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materials
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Anfotericina B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Solução de tripsina/EDTA	HyClone	SH30042.01
45 μ Filtro de células M	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF com carprofeno	Item controlado de cuidados veterinários em BCM		Para controle da dor
Buprenorfina	Item controlado de cuidados veterinários em BCM		Para controle da dor
Pellet de estradiol	Innovative Research of America	SE-121
Cetamina e xilazina	Item controlado de cuidados veterinários em BCM
Pomada veterinária	Item controlado de cuidados veterinários em BCM		Evite a secura dos olhos
Barbeador	Oster	78005-050	Para camundongos peludos
Etanol isopropílico	ACROS	67-63-0
Esfoliante cirúrgico Betadine	Item controlado de cuidados veterinários em lâminas de
# 10	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	Alça
múltipla nº 3	Ted Pella, Inc	541-31	Precisa ser autoclavado
Campo cirúrgico estéril	Tecnologia de infusão Sai	PSS-SD1
Pinça Reta	Roboz Instrumento Cirúrgico	RS-5132	Precisa ser autoclavado
Pinça fina reta	Ferramentas de Fine Science	11253-20	Precisa ser autoclavado
Pinça fina afiada	Ferramentas de Fine Science	11253-25	Precisa ser autoclavada
4-0 Sutura de seda Vicryl	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31 G seringas de insulina	BD	328418	Múltiplos
cotonetes Q-tips (Estéril)	VWR International Laboratory	89031-272
Cola para a pele	Henry Schein Animal Health	31477	Para fechamento da pele no local da cirurgia
Aplicador de Brincos	Fine Science Tools	24220-00
Brincos	Ferramentas de Ciência Fina	24220-50
D-luciferina	Ouro Biotecnologia	SORTE	Evite a luz e coloque no gelo
Seringas de insulina de 28 G	BD	329410	Para injeção intra-orbital
Paraformadeído	Alfa Aesar	30525-89-4	Para fixação de tecido
EDTA	OmniPur	4050	Para decalficicação de tecido ósseo
< strong>Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
EquipamentoMicroscópio de
dissecação	Leica	Leica S6E estéreo
IVIS Lumina II imaging system	Advanced Molecular Vision
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpos
Anticorpos anti-GFP (JL-8)	Clontech	632381
Anticorpos anti-ALP	Abcam	ab108337
Anti-Osterix anticorpos	Abcam	ab22552