The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.
香烟烟雾(CS)是心血管和肺疾病的主要危险因素。因为CS是一个包含7000多化学品1这是具有挑战性的评估个别成分其总体毒性的贡献复杂的气溶胶。个别成分以及混合物的毒理学配置文件可以然而,建立了体外 ,由通量筛选工具,这使烟草烟雾的危害和潜在的有害成分(HPHCs)的分析施加高,受美国食品和药品的定义管理局(FDA)。2
对于初步评估,使用该化合物的毒性的实时,无标记评估的基于阻抗的工具。该仪器读数依赖于细胞黏附,活力和形态,所有共同提供的电池状态的概述。无量纲参数,命名的单元格指数,用来量化。一组的DIF同的染色方法是为基于荧光成像开发的调查和HCS平台被用来获取对每个HPHC引起的一种细胞毒性更深入的信息。
测试的15个成分中,只有五人入选基于HCS-分析,他们注册了一个可计算的LD 50(<20毫米)。这些包括1- aminonaphtalene,砷(V),铬(VI),巴豆醛和苯酚。基于它们在HCS效果,1- aminonaphtalene和酚可确定以诱导线粒体功能障碍,并连同铬(VI),为基于增加组蛋白H2AX的磷酸化基因毒性。巴豆醛被确定为氧化应激诱导剂和砷作为应力激酶途径的活化剂。
这项研究表明,阻抗和基于HCS技术的组合提供了用于在体外的CS成分的评估一个强大的工具。
毒理学风险评估历来依赖于使用动物模型当中,虽然在生命科学基础,也有不足之处联系,如不一致译人类和成本高。此外,出现了越来越多的努力,找到“3R原则”2(替代,减少和优化)的精神动物试验替代方案。这种努力已经加速,在过去的几年中,这不仅是因为最近的进展,如高通量的技术和系统生物学方法,但由于立法限制使用动物试验也,特别是在欧洲联盟。
的细胞信号途径调节到毒性损伤的响应的复杂性使得它显然使用单一毒理学终点将不足以描述的某些化合物的毒理学基础。对于这一点,数百相互作用的p的相互有助于生物网络roteins也将需要被考虑在内。研究毒物对这些网络的影响,一个系统毒理学方法与表型中,高通量筛选测定组合是有用的推断效能并同时提供对个别毒物作用机制的更多信息。
在这项研究中,我们采用HCS作为强大的筛选工具,它是由一个自动显微镜和生物软件应用的,可以采集,处理和分析来自特定的基于荧光的细胞分析而得的图像数据。这允许在小区内的视觉变化进行量化,在单细胞或亚细胞水平,并可以同时分析许多参数。3例如,DNA双链断裂是使用组蛋白H2AX的磷酸化的基于抗体的鉴定评估,并使用细胞烫发活性氧(ROS)的定量eable超敏感的染料。
因为肺上皮细胞代表针对吸入毒物,包括香烟烟雾中的第一生物屏障,我们利用主支气管上皮细胞作为体外模型来分析由美国食品和药品管理局公布HPHCs的效果。4本手稿是一个后续-最多上以前的研究5中,我们评估HPHCs的不同子集的生物学影响。
作为我们工作流以评估在体外的细胞毒性的一部分,我们最初评估选择的15 HPHC的的效力,使用基于阻抗的实时蜂窝分析使我们能够建立剂量范围,适合于随后的HCS(RTCA)系统分析( 图1)。毒理学评估HCS然后用细胞毒性九个多参数进行端点,每次在两个时间点(4和24小时)监测。所使用的标记物指示线粒体毒性,DNA损伤,应激激酶,活性氧(ROS),谷胱甘肽(GSH)的含量,蛋白酶3 – 7活性,细胞色素C释放和细胞膜的通透性,如表1所述。
我们的方法使识别和香烟烟雾成分通过剂量和时间依赖性的采样的效果的表征。最终,这产生每个HPHC 的体外毒理学特性。多组学方法也可以被用来进一步补充HCS分析。这最后还提供了在细胞信号和/或转录水平的影响有了更深的了解。
用于替代动物实验和新的高通量测试方法的需求在过去几年里得到了广泛的讨论。这已使科学家和监管当局调查标准毒性试验的替代方法,利用细胞试验紧密模仿靶组织的生理学。在这项研究中,我们已经证明结合具有高含量筛选(HCS)平台实时细胞分析仪(RTCA)评估暴露于单个CS成分对人肺上皮细胞的影响的适用性。这种设置可以类似用于评估其他各种空气污染物,空气中的颗粒,和纳米粒子诱导的细胞毒性。此外,所获得的结果可以与来自全基因组转录和计算方法基于因果生物网络相匹配。据此前报道,这种方法使我们能够证实的分子通路数据在CS曝光5与HCS终点的扰动,解决这些途径扰动也表型。
为流程图测定中,实时细胞分析提供以剂量和时间依赖性的分辨率,这允许它的剂量和暴露时间点可以是用于下游分析14有利更好的决策细胞活力相关的信息。分析仪的原理依赖于在由细胞产生的,因为它们附着和扩散上覆盖有金微电极的培养以及表面电阻抗的变化。阻抗被转换成称为小区索引一个无量纲参数,其可用于监测细胞粘附,扩散,形态和最终细胞活力。虽然该技术不提供关于细胞毒性机制的信息,其灵敏度能的,即使在非常低的剂量在所述HCS并不翔实形态学细胞变化的检测(数据未显示)。基于前雇主OU中的实验中,我们已经注意到,RTCA方法能够检测在较低剂量相比,HCS端点形态学变化。
在与实时细胞分析初步筛选中,HCS平台被用来获取关于每个HPHC引起的那种细胞毒性的更深入的信息。允许个人资料HPHCs对他们在细胞车厢潜在影响HCS检测板/细胞器以及识别那些引发遗传毒性和氧化应激。该分析揭示了不同的配置文件,从而选定HPHCs诱导NHBE细胞毒性。在一般情况下,所有的化合物中,除苯酚,发现在最高测试剂量以诱导坏死。在H2AX的癌症发展1 aminonaphtalene诱导的磷酸化的潜在作用,作为遗传毒性标志物,但是HCS面板中的线粒体毒性读出这个HPHC中还发现了活性(质量增加,细胞色素C relea一致本身)和氧化应激(GSH耗竭)。同样,如先前所描述,苯酚被确定以诱导线粒体功能障碍,并导致DNA损伤以及谷胱甘肽耗竭。铬(VI),列为I组致癌的化合物之一,和巴豆醛也都鉴定为基因毒性,特别是铬(VI)也诱导细胞凋亡(半胱天冬级联活化)和巴豆醛引起增加ROS产生。最后砷(V)中,被发现会引起cJun磷酸化这是应力激酶途径激活的标志。
在这项研究中,我们利用NHBE细胞在体外肺上皮细胞的模型。在HCS设置使用这些细胞是前所未有的,使更广泛的端点,包括遗传毒性和氧化应激标志物的调查。两个活细胞和固定细胞染色方法被我们的协议内描述的,示范的整体技术的灵活性。 f中行为,非常相同的协议可以被应用到更广泛的目标,这可以通过使用任何荧光染料或抗体的加以处理。对的活染色方案的成功执行,则尊重培养时间,因为一些染料具有有限的半衰期和荧光信号完成图像采集之前可能降低是重要的。同样重要的是要考虑到,如果使用不同的细胞类型中,所有的染色条件,应重新评估,作为最佳的染料浓度和温育时间可以是不同的。
在当前的论文中,我们描述了只有五个化合物,其中的HCS方法筛选的场景。考虑到先前描述的板布局,他们被给予超过2种不同的板集总共24板(6测定和2的时间点)板.The数量也可以增加,从而允许更多的化合物或同时筛选在不变拟多个端点的tigation。在这样做之前,但是,应该考虑到,某些端点(GSH和ROS)需要立即采集,并作为结果,板的给药应以交错的方式来执行,以允许采集先前板。另一方面,使用固定的细胞染色协议表示有利的,因为在板可堆叠,在定影后的任何步骤中断协议,用于染色过程完成在稍后阶段。这种方法,例如,将提供操作员的时间来完成所有的活细胞染色板而不损害数据质量。
通过减少板的数量进一步优化工作流程,它也将是可能的复用多个端点在一起。例如,在这种情况下DNA损伤和应激激酶可以一起研究简单地使用两个二级抗体与荧光发射的不同的Channels。所述HCS平台的不断发展,其中包括全自动细胞接种,化合物稀释,剂量和染色,以及加入的新的端点将进一步扩大HCS平台的能力,作为对上皮HPHCs和其他细胞类型的有力的分析工具。
The authors have nothing to disclose.
笔者想感谢Karsta Luettich和Gregory Vuillaume他们的手稿的审查。
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
Screener (HCS) | Genedata | NA | |
CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
Easy Flask filter cap 75cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
10X permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
10X blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |